High-Throughput screening van microbiële isolaten met impact op caenorhabditis elegans gezondheid

Dit protocol beschrijft hoe te screenen op bacteriën met impact op C.elegans oxidatieve thermische stressbestendigheid in twee C.elegans-stammen op 48 bacteriële isolaten parallel. Deze aanpak is veelzijdig en schaalbaar. Het biedt een snelle screening van meerdere aandoeningen met impact op C.elegans tegen gezondheid, wat van toepassing is op de studie van mechanismen van gezondheid en ziekten.

Met behulp van stressresistentie als een proxy voor gezondheid, is deze pijplijn gemakkelijk toepasbaar op de preklinische screening van geneesmiddelen, anti-emetica en probiotica op nematodenmutant-, knockdown-, transgene en ziektemodellen. Het vermogen om veel omstandigheden parallel te testen, maakt de studie van complexe interacties mogelijk en dient fysiologische processen. Deze omvatten interacties tussen gastheermicroben, metabole stoornissen, stressverwerking en veroudering.

Het is van cruciaal belang om besmetting overal te voorkomen. Laat wormen niet zonder voedsel komen te zitten en voer belangrijke stappen uit zodra de wormen het vereiste stadium bereiken. Begin met de bereiding van een geconcentreerde E.coli OP50 bacteriecultuur door vier flessen lysogeniebouillon van één liter te inenten met elk twee milliliter OP50 startercultuur.

Plaats de flessen vervolgens zes uur in een schuddende incubator bij 37 graden Celsius en 160 G, gevolgd door het pelleteren van de bacteriën op 3057 G en 20 graden Celsius gedurende 15 minuten. Gooi daarna het supernatant weg en hang de pellets opnieuw op met zes milliliter OP50-medium. Verzamel de geconcentreerde cultuur in een steriele conische buis van 50 milliliter.

Ent acht zes centimeter NGM-platen per soort met 100 microliter verzadigde OP50-cultuur die 's nachts wordt gekweekt met 37 graden Celsius per plaat. Houd de borden vervolgens twee dagen voor gebruik op 20 graden Celsius. Snijd vervolgens een vierkant agar-stuk van 0,5 centimeter met wormen uit een onlangs uitgehongerde NGM-plaat met behulp van een scalpel en breng over op elk van de acht geënte zes centimeter NGM-platen.

Incubeer deze platen drie dagen bij 20 graden Celsius. Vervolgens suspensie u de wormen opnieuw door maximaal drie milliliter steriele M negen-buffer toe te voegen aan de zes centimeter NGM-platen met behulp van een P1000-pipet en verzamelt u de wormoplossing van alle acht platen per stam in een enkele conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer vervolgens op 142 maal G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een P5000-pipet of een waterpomp uitgerust met een steriele Pasteur-pipet of -punt.

Voeg daarna 10 milliliter steriele M negen buffer toe om de wormkorrel te wassen. Verwijder vervolgens het supernatant en breng de wormen over op een 15 centimeter OP50-geënt NGM-plaat aangevuld met geconcentreerde OP50 met behulp van een pipet. Kweek elke wormenstam op een NGM-plaat met een diameter van 15 centimeter gedurende drie tot vier dagen bij 15 graden Celsius door de wormen dagelijks opnieuw te voeden met 0,5 milliliter geconcentreerde OP50.

Na het verzamelen en wassen van een M nine-buffer, breng je elke wormenstamcultuur over naar meer NGM-platen en vermeerder je wormen bij 20 graden Celsius totdat 95% van de populatie gravid volwassenen zijn. Bleek vervolgens de gravid volwassen wormen door de standaard eibereidingsmethode te volgen en breng de eieren gedurende 24 uur op twee ongeplaatste NGM-platen van 15 centimeter bij 15 graden Celsius over om alle L-één larven te laten uitkomen en synchroon te groeien in de volgende stappen. Verzamel eerst alle bacteriële massa die eerder op een agarplaat van zes centimeter LB is gegroeid en breng deze over naar een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met één milliliter M negen-buffer.

Vervolgens vortex de microcentrifuge buis totdat de bacteriële pellets volledig opnieuw zijn gesuspendeerd. Draai vervolgens vijf minuten op 9, 300 keer G bij kamertemperatuur en verwijder 700 microliter supernatant. Opnieuw suspensie van de bacteriële pellet door vortexing.

Breng vervolgens 200 microliter van elke bacteriële suspensie over in een enkele put van een lege steriele 96-putplaat. Ent vanaf deze plaat acht 96 goed NGM-agaroseplaten met 10 microliter bacteriële oplossing met behulp van een meerkanaals pipet en incubeer met het deksel op 25 graden Celsius gedurende 24 uur. Sluit daarna de 96 put ophangplaat af met schone zelfklevende plafondfolie en bewaar deze maximaal vijf dagen bij 15 graden Celsius.

Om te beginnen, beoordeel het ontwikkelingsstadium van een gesynchroniseerde wormpopulatie door naar de platen te kijken. Zodra meer dan 90% van de wormen L vier stadium heeft bereikt, verzamel de wormen in maximaal 10 milliliter steriele M negen oplossing in 15 milliliter conische buizen. Was de wormen vervolgens vier keer uitgebreid door twee minuten op 142 keer G te draaien bij vier graden Celsius, terwijl je 10 milliliter vers steriel m negen tussen elke wasbeurt toevoegt om op OP50-bacteriën te verwijderen.

Verwijder vervolgens het supernatant en suspensieer de wormpellet opnieuw op in 10 milliliter M negen. Breng 50 microliter wormoplossing over in een 1,5 of twee milliliter laagoppervlakbindingsbuis met 950 microliter M negen. Nadat u de inhoud van de buis voorzichtig hebt gemengd om bezinking van wormen te voorkomen, gebruikt u snel een bevochtigde pipetpunt met lage binding om drie tot vier afzonderlijke druppels van 10 microliter op een glazen dia of een NGM-plaat over te brengen.

Onder een stereomicroscoop bij 16X vergroting, tel het aantal wormen en het gemiddelde van de tellingen van drie tot vier druppels om het aantal wormen per microliter in de wormoplossing te bepalen. Stel de wormconcentratie in op 15 wormen per microliter in de conische buis van 15 milliliter. Breng vervolgens acht microliter wormoplossing over in elk van de putten van de acht 96-put NGM-agaroseplaten met behulp van een meerkanaals pipet of herhaalde pipet.

Doseer na 36 uur 30 microliter M negen in elke put van de 96 putplaat. Breng vervolgens wormen over naar de 384-putplaat volgens de ingestelde lay-outs met behulp van tips voor lage retentie, zodat de plaatlezers correct zijn ingesteld. Vul daarna de 384 putplaten bij met meer M negen, met als doel een eindvolume van 60 microliter per put door 40 microliter M negen toe te voegen voor thermische stresstest en 34 microliter M negen in zes microliter TBHP voor TBHP-geïnduceerde oxidatieve stress.

Start vervolgens de test binnen twee minuten na het toevoegen van TBHP. Sluit vervolgens de platen met hun transparante deksel en sluit de randen van de 384 putplaten af met afplaktape, zodat de tape niet over het deksel of onder de plaat gaat. Steek vervolgens de plaat in de plaatlezer.

Bepaal een fluorescentiewaarde waaronder een piek niet significant zou verschillen van ruis, en noteer het vroegste tijdstip waarop fluorescentiefluctuaties dempen voordat ze stijgen. Noteer vervolgens de tijdspunten waartussen minimale en maximale fluorescentiewaarden naar verwachting zullen dalen, omdat ze zullen worden gebruikt voor het passen van curven. Controleer daarna of de amplitudes van de fluorescentiepieken aanzienlijk variëren tussen de putten.

Normaliseer de gegevens voorafgaand aan verdere analyse met behulp van de formule zoals beschreven in het manuscript. Download eerst LFASS van GitHub en start MATLAB en navigeer naar de map LFASS. Typ vervolgens de map Fit in het opdrachtvenster en voer deze uit volgens de instructies op het scherm.

Nadat u de map Fit hebt getypt, typt u de naam van uw gegevensmap waarin het Excel-bestand zich bevindt als Mijn gegevens. Voer vervolgens twee in voor het tijdsinterval tussen opeenvolgende metingen in het huidige protocol en typ de ruisdrempelwaarde. Wijs vervolgens de bovenste tolerantiedrempel toe door 0,94 te typen en de onderste tolerantiedrempel door 0,06 te typen om de pasvorm van het sigmoïd te beperken.

Stel tijdsintervallen in om maximale en minimale waarden te vinden. Om de convergerende pasvormen visueel te inspecteren, typt u Y voor ja of N voor nee voor het niet weergeven van gemonteerde en vloeiende curven wanneer daarom wordt gevraagd. Geef vervolgens nieuwe, onderste en bovenste tijdsgrenzen op om te proberen opnieuw in te richten.

Als u de refit wilt proberen, typt u twee. Maar als u de refit wilt accepteren en door wilt gaan naar de volgende curve, typt u nul. Om te kiezen of curven die als ruis zijn geïdentificeerd, moeten worden geanalyseerd of slecht passende curven opnieuw moeten worden aangepast, moet type Y worden goedgekeurd en N moet worden afgewezen.

Nadat het opnieuw monteren is geprobeerd of geweigerd voor alle resterende curven, eindigt het programma. Haal resultaatbestanden op uit de resultatenmap en sla op als dot XLSX voor downstream-analyse. Hitte- en oxidatieve stressbestendigheidstests werden uitgevoerd op Bristol N twee wilde type wormen, die werden gevoed met MYB11 of MYB115 bacteriële isolaten of E coli OP50-controlebacteriën.

Na 36 uur werden de volwassen wildtype wormpopulaties blootgesteld aan 42 graden Celsius thermische stress en 7% TBHP-geïnduceerde oxidatieve stress. De mediane tijd van overlijden varieerde tussen 40 en 130 minuten voor de thermische stresstest en tussen 90 en 240 minuten voor de oxidatieve stresstest. Om ervoor te zorgen dat de wormen in stap 2.5 worden gekweekt en stap 2.1 tot twee uur kan duren, tekent u een plaatindeling om wormen voor te bereiden van 96 put- tot 284 putplaten in stap 4.6.

Stappen kunnen worden toegevoegd of vervangen. Gastheergenoombrede RNA-schermen of bacteriële genetische schermen kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd door darmbacterie-isolaten te vervangen door respectievelijk RNI-klonen of bacteriële mutanten. Dus we gebruiken deze aanpak momenteel om nieuwe probiotica te identificeren en om genregulerende netwerken te ontdekken die betrokken zijn bij micro-interacties van de gastheer in de context van infecties en veroudering.