Klinisch microfluïdisch chipplatform voor de isolatie van veelzijdige circulerende tumorcellen

Dit protocol beschreef een methode voor rode tumorcel-inventarisatie en de klinische CTC-isolatie. Om te beginnen, kweek de tumorcellen MCF-7, MDA-MB-231 en HeLa in een celkweekkolf op één keer 10 tot de vijfde in één millimeter DMEM, aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Wanneer de cellijnen groeien als hechtende monolagen tot 95% samenvloeiing, maak ze dan gedurende twee minuten los van de kweekschaal met 0,25% trypsine-oplossing. Bevlek de tumorcellen door drie microliter Calcein AM toe te voegen en plaats de schaal gedurende 30 minuten in de couveuse. Aan het einde van de incubatie, verteer alle cellen met trypsine.

Tel de kweektumorcellen in PBS met een celtelkamer en verdun tot 100 tumorcellen per één milliliter PBS zijn verkregen. Breng vervolgens de verdunde celsuspensie in de microfluïdische chip met behulp van een spuit met een spuitpomp met verschillende stroomsnelheden. Verkrijg de opvangefficiëntie voor de verschillende stroomsnelheden en bepaal het optimale debiet.

Tel het aantal tumorcellen dat op de chip is gevangen en uit de uitlaat stroomt. Bereken de opname-efficiëntie met behulp van de gegeven formule. Herhaal de procedure om de vangstefficiëntie voor verschillende aantallen tumorcellen te verkrijgen, van 10 tot 100.

Test en valideer de microfluïdische chip op zeldzame aantallen tumorcellen. Injecteer deze 10 monstersuspensies in de microfluïdische chips met behulp van een holle naald gemaakt met een micropipettrekker om verdunde tumorcellen op te zuigen. Detecteer en inventariseer het aantal tumorcellen voor elk monster na hun vangst op de chip.

Kleur vervolgens de tumorcellen met Calcein AM en inventariseer 100 tumorcellen in vijf microliter PBS. Spike deze cellen in een milliliter hele, normale bloedmonster. Introduceer deze cellen in de chip en noteer het aantal tumorcellen dat op de chip is gevangen met groene immunofluorescentie.

Voer een in vivo opsomming uit zoals beschreven en bereken de opname-efficiëntie na het vastleggen. Inventariseer één tot 10 tumorcellen zonder kleuring. Spike deze cellen in een milliliter heel, normaal bloed.

Introduceer deze monsters in de microfluïdische chip en vang de tumorcellen op. Voeg drie tot vijf microliter fluorescerende kleurstof toe aan 20 tot 30 microliter PBS en breng deze oplossing met een spuit op de chip. Inventariseer het aantal tumorcellen dat op de chip is gevangen met blauwe en groene immunofluorescentie om de vangstefficiëntie te bepalen.

Wijzig vervolgens het oppervlak van de chip met 100-microliter 4% 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan en ethanol bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten voor de op affiniteit gebaseerde vangst van anti-epitheelceladhesiemolecuul. Was de chip aan het einde van de incubatie drie keer met ethanol. Voeg vervolgens 100 microliter van het koppelmiddel GMBS toe en laat het gedurende 30 minuten interageren.

Gebruik aan het einde van de incubatie een spuit om de chip drie keer te wassen met één milliliter PBS. Behandel de chip met 30 tot 40 microliter van 10 microgram per milliliter neutravidine bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, wat leidt tot immobilisatie van de cellen op de GMBS, en spoel vervolgens met PBS om overtollig avidine te verwijderen. Wijzig de chip met drie microliter anti-gebiotinyleerd epitheelceladhesiemolecuulantilichaam en incubeer 's nachts.

Alle tumorcellen werden gevangen rond de array van de golfchip zonder dat er cellen ontbraken, wat wijst op de hoge opname-efficiëntie van de microfluïdische chip. Tumorcellen gekleurd met Hoechst en Calcein AM worden hier getoond. CTC's van een maagkankerpatiënt die zijn vastgelegd met behulp van kleine ellipsmicrofilters worden hier weergegeven.

Ook worden CTC's van een colorectale kankerpatiënt die zijn vastgelegd met trapezoïde microfilters en die zowel blauwe als groene fluorescentie uitzenden, getoond. Hoge opname-efficiëntie en levensvatbaarheid werden waargenomen voor tumorcellen die werden gevangen met behulp van grote ellipsmicrofilters. Klinische immunofluorescentieanalyse van colorectale CTC's vastgelegd op de microfluïdische chip herkende CTC's als DAPI-positief, CK-positief, CD45-negatief en de WBC's als DAPI-positief, CK-negatief, CD45-positief.

Colorectale tumorcellen gekweekt op de grote ellipschip na vangst, en colorectale tumorcellen gevangen op de grote ellips microfilters worden hier getoond. Deze methode van modificeren met aptamer biedt een nieuwe benadering om CTC-isolatie te verrijken.