Analyse van ruwe en verwerkte Cyperi Rhizoma-monsters met behulp van vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie bij ratten met primaire dysmenorroe

Metabanomiek meet de algemene en dynamische metabole reacties en is consistent met het bepalen van de algehele werkzaamheid van de traditionele Chinese geneeskunde. Veranderingen in de medicijncomponenten als gevolg van de metabole respons van het lichaam kunnen worden bepaald met de metabonomics. De reikwijdte van het screenen van de actieve ingrediënten van TCM kan worden beperkt door gebruik te maken van deze techniek.

Eenzijdigheid kan worden vermeden door de individuele bestanddelen te bestuderen. Deze methode kan gelijktijdig zijn, de endogene metabolieten en exogene bestanddelen bepalen die in het bloed worden opgenomen. Metabanomica is op grote schaal gebruikt in studies over TCM, drug toxicologie, gezondheidsmanagement, sport, voedsel en andere gebieden.

Bepaal om te beginnen het vereiste extract van Cyperi rhizoma, of CR, of Cyperi rhizoma verwerkt met azijn, of CRV, om een groep van zes Sprague Dawley-ratten gedurende drie dagen te behandelen. Bereken het volume CR of CRV dat per rat moet worden toegepast met behulp van deze vergelijking. Om de CRV te verwerken, mengt u 100 gram CR en 20 gram azijn, die meer dan 5,5 gram azijnzuur per 100 milliliter bevat, grondig en incubeert u gedurende 12 uur.

Roerbak het mengsel na de incubatie 10 minuten in een ijzeren pan op 110 tot 120 graden Celsius. Verwijder vervolgens het mengsel en laat het afkoelen bij kamertemperatuur. Om het CR-extract te bereiden, weekt u de CR gedurende twee uur met zuiver water 10 keer de ingenomen CR-hoeveelheid, waarbij u ervoor zorgt dat de geneesmiddelen zich onder het vloeibare niveau bevinden.

Breng vervolgens het mengsel van water en medicijnen op hoog vuur aan de kook en houd het 20 minuten op laag vuur koken. Filter vervolgens de inhoud door een filterdoek van 100 mazen en verzamel het filtraat. Concentreer vervolgens het verzamelde filtraat in een extract met een roterende verdamper tot één gram per milliliter.

Om het CRV-extract te bereiden, voert u de stappen van weken, koken en concentreren uit zoals aangetoond voor de CR-extractie. Voor het testen van de CR- en CRV-extracten, pipetteer 500 microliter van het extract tot 500 microliter methanol in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter en vortex gedurende 30 seconden om te mengen. Centrifugeer de monsters gedurende 15 minuten bij 16, 500 g bij vier graden Celsius.

Verwijder vervolgens het supernatant en breng het over naar de injectieflacon met het monster om te testen. Nadat u de monsters hebt getest, voert u de hoofdcomponentanalyse of PCA en de modellering uit met behulp van de analysesoftware. Importeer de gestandaardiseerde gegevens van de metabolieten in de software en gebruik vervolgens Autofit om het analysemodel te bouwen.

Gebruik ten slotte de scores om de scorespreidingsplot van de PCA te verkrijgen. Om de orthogonale partiële kleinste kwadratische discriminantanalyse of OPLS-DA uit te voeren, importeert u de gestandaardiseerde gegevens over de metabolieten en de CR- en CRV-groepen in de software. Importeer vervolgens de CR- en CRV-gegevens in hun respectievelijke groepen die zijn gemaakt.

Gebruik vervolgens Autofit om het analysemodel te bouwen en gebruik de score om de scorespreidingsplot van de OPLS-DA te verkrijgen. Gebruik ten slotte VIP om de variabele significantie in de projectie of VIP-waarde in de OPLS-DA te verkrijgen. Om de potentieel differentiële metabolieten te identificeren, screent u de metabolieten met VIP-waarden groter dan één.

Gebruik vervolgens de statistische software om de P-waarde van de gescreende metabolieten te berekenen door de T-test van de student. Gebruik vervolgens om de differentiële metabolieten te identificeren de geannoteerde metabolieten en screen de differentiële metabolieten die moeten worden gematcht in de KEGG-database. Toon de veranderingen in de differentiële metabolieten in de CR- en CRV-groepen door een heatmap te tekenen.

Om de potentiële metabole routes te onderzoeken, gaat u naar de MetaboAnalyst-database. Gebruik Pathways Analysis om de verschillende metabolieten te uploaden om de potentiële metabole routes te verkrijgen. Upload de verschillende metabolieten naar de KEGG-database om de potentiële metabole routes te analyseren.

Het geanalyseerde dysmenorroe-modelexperiment toonde significante verschillen in de prostaglandinespiegels. De ratten in de model CR- en CRV-groepen vertoonden aanzienlijke kronkelende reacties na de oxytocine-injectie. De resultaten van de PCA-analyse toonden aan dat de clusters van de CR en CRV in vergelijking met de modelgroepen significant gescheiden waren in zowel de positieve als de negatieve ionenmodus.

De OPLS-DA werd gebruikt om te screenen op metabole verschillen, en de scatter plot resultaten toonden aan dat de CR- en CRV-groepen gescheiden waren. Univariate statistische analyses werden uitgevoerd om metabole variaties te identificeren. Er wordt een vulkaanplot getoond, waarbij elk punt overeenkomt met een andere metaboliet.

Significante veranderingen werden waargenomen in 63 metabolieten in de positieve modus en 30 in de negatieve modus. De differentiële metabolieten werden bepaald met behulp van de KEGG- en HDMB-databases en de nauwkeurig overeenkomende verbindingen werden vermeld. De kwantitatieve waarden van de differentiële metabolieten tussen de CR- en CRV-groepen werden berekend en geclusterd.

De kleurvlakken geven aan hoe elke metaboliet tot expressie komt ten opzichte van de andere. In vergelijking met de CR-groep namen de niveaus van vier differentiële metabolieten in de CRV-groep toe, terwijl 11 metabolieten afnamen in de positieve ionenmodus. In het geval van negatieve ionenmodus namen vier differentiële metabolieten toe en namen zeven metabolieten af.

De resultaten van de KEGG-routeanalyse toonden aan dat de differentiële metabolieten geassocieerd waren met negen routes in de positieve en negatieve modi. Hoe meer differentiële metabolieten, hoe beter de resultaten, zodat voldoende metabole routes kunnen worden gekoppeld en de belangrijkste gescreende metabole routes nauwkeuriger zullen zijn.