Formulering en karakterisering van bioactieve stof die nanoschijven bevat

Dit protocol biedt praktische kennis, nuttig voor het formuleren van nanoschaaldeeltjes, d.w.z. nanoschijven, die stabiel een breed scala aan hydrofobe bioactieve moleculen bevatten. Deze methode kent vele praktische toepassingen.

Het vermogen om waterige oplosbaarheid te verlenen aan anders onoplosbare bioactieve verbindingen maakt het gebruik van nanoschijven in toepassingen voor medicijnafgifte mogelijk. De beschreven methode is eenvoudig. Het heeft de voorkeur om studies uit te voeren op de beschreven schaal, vijf milligram fosfolipide, twee milligram steigereiwit, zodat de vorming van nanoschijven gemakkelijk kan worden gecontroleerd door visuele inspectie.

Michael Karo en Matthew Swackhammer, niet-gegradueerde studentonderzoekers in het Ryan-lab, zullen de procedure demonstreren. Om een fosfolipide aliquot te bereiden, weegt u vijf milligram DMPC en brengt u het over in een glazen reageerbuis. Los het fosfolipide op door 300 microliter chloroform en 100 microliter methanol toe te voegen voor een verhouding van drie op één.

Verdamp het organische oplosmiddel door de glazen reageerbuis gedurende 10 tot 15 minuten onder een zachte stroom stikstofgas te plaatsen, zodat zich een dunne film van gedroogd fosfolipide vormt langs de wanden van het onderste deel van de buis. Om amfotericine B- of AmpB-nanoschijven te formuleren, pipetteer 450 microliter PBS naar de gelyofiliseerde fosfolipide-aliquot en vortex gedurende 30 seconden om het lipide te verspreiden. Pipetteer 50 microliter van 20 milligram per milliliter voorraad AmpB-oplossing in het gedispergeerde fosfolipidemonster en vortex.

Voeg 500 microliter van vier milligram per milliliter ApoE4 NT steigereiwit toe aan de glazen reageerbuis met het gedispergeerde fosfolipide en AmpB. Soniceer het monster bij 24 graden Celsius totdat de oplossing helder wordt. Voor AmpB-Nanodisk dialyse, bereid een deel van de dialyseslang voor door het grondig te weken in gedestilleerd gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten.

Klem met behulp van een dialyslangklem het ene uiteinde van de geweekte dialyseslang vast, zodat er geen vloeistof kan ontsnappen. Steek een smalle nektrechter in het open uiteinde van de dialysebuis en breng het AmpB-Nanodisk-monster over in de dialysebuis. Verwijder de trechter en klem het uiteinde van de dialyseslang vast met een andere dialysebuisklem.

Plaats een schuimdialyse-drijf op een van de afgesloten uiteinden van de dialyseslang en plaats de geassembleerde dialyseslang in het bekerglas met vers bereide PBS-buffer van één liter. Plaats een magnetische roerstaaf in de bodem van het bekerglas en stel de roerregeling laag in, zodat er geen draaikolk ontstaat. Laat de dialyse 's nachts doorgaan bij vier graden Celsius.

Schakel de spectrofotometer in door de aan/uit-schakelaar om te draaien en maak verbinding met een overeenkomstige ondersteuningscomputer door op pc-besturing te drukken. Open op de ondersteuningscomputer de software met het label UVProbe 2.61 en maak verbinding met de spectrofotometer door in de linkerbenedenhoek op verbinden te klikken. Klik op het spectrum en klik vervolgens op methode"in de bovenste werkbalk.

Klik op het tabblad Meting en voer 500 in het tekstvak "begin" in dat zich onder het golflengtebereik bevindt en 300 in het tekstvak aan het einde. Klik op het vervolgkeuzemenu naast het tabblad met het label scansnelheid en stel het in op gemiddeld. Bereid een monster blanco voor door één milliliter DMSO over te brengen in twee kwartscuvetten.

Laad beide cuvetten in de respectievelijke monsterpoorten van de spectrofotometer. Klik op automatisch leeg en neem een spectrum op van 300 tot 500 nanometer door op start te klikken in de linkerbenedenhoek. Voor ampB-standaard spectrale analyse verwijdert u de cuvette uit de voorste monsterpoort en voegt u 20 microliter van één milligram per milliliter AmpB-stamoplossing toe.

Laad de cuvette terug in het monsterbord en klik op start" om de absorptie van het monster te registreren. Verwijder na het opnemen van de absorptie van het monster de cuvette en decanteer de vloeibare inhoud in een afvalcontainer. Spoel de cuvette grondig af met drie wasbeurten van gedeïoniseerd water, gevolgd door drie wasbeurten met 70% ethanol.

Voor spectrale analyse van verstoorde AmpB-Nanodisk, bereidt u het monster voor door 20 microliter van één milligram per milliliter AmpB-Nanodisk-voorraad in één milliliter DMSO te pipetteren en gedurende één minuut te incuberen voordat het spectrum wordt opgenomen. Plaats de cuvette in de voorste monsterpoort en klik op start" om de absorptie van het monster vast te leggen. Voor spectrale analyse van een PBS-buffer blanco, bereidt u een blanco voor door één milliliter PBS over te brengen in twee kwartscuvetten.

Laad de cuvetten in de monsterpoort. Klik op automatisch leeg en neem het spectrum op van 300 tot 500 nanometer. Voor spectrale analyse van een niet-verstoord AmpB-Nanodisk-monster verwijdert u de cuvette uit de voorste monsterpoort en voegt u 20 microliter van een ampB-nanoschijfmonster van één milligram per milliliter toe aan de PBS-buffer.

Laad de cuvette terug in het monsterbord. Klik op start" en neem het voorbeeldspectrum op. De AmpB-Nanodisk formuleringsreactie wordt als voltooid beschouwd wanneer het uiterlijk van het monster overgaat van troebel naar helder.

UV-zichtbare absorptiespectroscopie van AmpB-monsters in DMSO en PBS wordt getoond. In DMSO werden drie onderscheidende absorptiemaxima waargenomen op 372, 392 en 415 nanometer, pieken die wijzen op AmpB. De absorptiespectra van AmpB-Nanoschijven in PBS vertoonden een enkele grote absorptiepiek bij een kortere golflengte.

Ter vergelijking: de absorptiespectra van AmpB-Nanoschijven in DMSO leken vergelijkbaar met de spectra van voorraad AmpB. Biologische activiteit van AmpB-Nanodisks werd uitgevoerd door het beoordelen van gistgroeiremmingstests. Controlemonsters zoals PBS, DMSO en gereconstitueerde lipoproteïnen met hoge dichtheid toonden aan dat andere nanoschijfcomponenten dan AmpB geen waarneembaar effect hebben op de gistgroei.

De positieve controle bevestigde dat AmpB een efficiënte remmer van gistgroei is. In het geval van AmpB-Nanodisks werd concentratieafhankelijke groeiremmingsactiviteit waargenomen. Niet alle nanoschijfpreparaten zijn hetzelfde.

Sommige kunnen meer tijd, andere lipiden of andere steigereiwitten nodig hebben. Ze zijn alleen onduidelijk} is de verduidelijking van het nanoschijfmonster. Deze techniek heeft geleid tot nieuwe nanodeeltjes die worden gebruikt om doxorubicine-geïnduceerde cardiotoxiciteit, apoptose, ligandinteracties te bestuderen en leverde tal van waterige onoplosbare bioactieve moleculen, waaronder luteïne en curcumine.