Het formuleren en karakteriseren van lipide nanodeeltjes voor genafgifte met behulp van een microfluïdisch mengplatform

Dit protocol kan worden gebruikt om nucleïnezuur ingekapselde lipide nanodeeltjes te produceren met een hoge reproduceerbaarheid en snelheid en lage volumes. De formuleringsparameters kunnen worden afgestemd om een gewenste bioverdeling te bereiken op basis van de klinische toepassing. Het standaard visgraatontwerp van de microfluïdische cartridge maakt een snelle, nauwkeurige en gecontroleerde laminaire stroom tijdens het mengen mogelijk.

De methode is vatbaar voor schaalvergroting en genereert uniforme, sterk ingekapselde deeltjes. Omdat de meeste commercieel goedgekeurde gentherapieproducten afhankelijk zijn van virale methoden, kan deze procedure inzicht geven in de genafgifte, omdat de niet-virale aanpak toepassingen mogelijk maakt waarvoor herhaalde toediening noodzakelijk is. Begin met het toevoegen van de juiste hoeveelheid van elke vloeibare bouillonoplossing aan een glazen injectieflacon met intermitterende vortexing.

zoals aangegeven in de tabel, gevolgd door de toevoeging van 200 bewijsethanol aan een eindvolume van 533 microliter. Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid mRNA-voorraad toe en verdun met citraatbuffer om een eindvolume van 1,5 milliliter bij de gewenste concentratie te bereiken. Om de microfluïdische kanalen te primen, voert u eerst de primingparameter in de instrumentsoftware in zoals beschreven in de tabel.

Open vervolgens het deksel van het instrument en plaats een microfluïdische patroon in het roterende blok. Laad ten minste 500 microliter ethanol in een spuit van 1 milliliter, zorg ervoor dat er geen bellen of luchtspleten aan de punt van de spuit zitten en steek de spuit in de rechterinlaat van de patroon. Laad een spuit van vijf milliliter met 1,5 milliliter citraatbuffer, zorg ervoor dat er geen luchtbellen of openingen zijn en steek de spuit in de linkerinlaat van de patroon.

Plaats twee conische buizen van 15 milliliter in de cliphouders om als afvalcontainers te dienen en klik op Go"om de oplossingen te mengen. Wanneer het instrument stopt met primen zoals aangegeven door het uitschakelen van het blauwe lampje aan de onderkant, opent u de late en gooit u de conische buizen en spuiten op de juiste manier weg. Stel voor de vorming van lipide nanodeeltjes de juiste formuleringsparameters in zoals aangegeven in de tabel en laad een spuit van 1 milliliter met een eerder bereid lipidenmengsel.

Verwijder eventuele luchtspleten of bubbels in de punt van de spuit en steek de spuit in de rechterkant van de patroon. Laad de eerder bereide nucleïnezuuroplossing in een spuit van 3 milliliter, zorg ervoor dat er geen bellen of luchtspleten in de punt van de spuit zitten en steek de spuit in de linkerinlaat van de patroon. Plaats een RNAasevrije conische buis van 15 milliliter met het label monsternaam in de linkerbuisclip en plaats een 15 milliliter afval conisch in de rechterbuisclip.

Sluit het deksel van het instrument en klik op Go.De lipide- en mRNA-oplossingen stromen door de microfluïdische cartridge en de lipide nanodeeltjesoplossing wordt verzameld in de conische buizen. Houd de conische buis aan het einde van het formuleringsproces vast en verdun vervolgens de lipide nanodeeltjes met 5 milliliter PBS en een biologische veiligheidskast. Om een bufferuitwisseling uit te voeren, wast u eerst een ultracentrifugefilter van 100 kilodalton poriegrootte voor met 2 milliliter PBS, centrifuge en leegt u vervolgens de PBS vanuit het onderste compartiment.

Voeg de verdunde lipide nanodeeltjes toe aan het bovenste compartiment van het voorgewassen ultracentrifugefilter voor drie centrifugewasbeurten, gooi de doorstroming weg en voeg 5 milliliter PBS toe aan het ultracentrifugefilter na de eerste twee wasbeurten. Pipetteer na de laatste wasbeurt de lipide nanodeeltjesoplossing een paar keer tegen de wanden van het ultracentrifugefilter om het verlies van nanodeeltjes te minimaliseren voordat de nanodeeltjesoplossing wordt overgebracht naar een nucleasevrije injectieflacon. Voeg vervolgens PBS toe om de suspensie van de nanodeeltjes zo nodig in de juiste experimentele concentratie en volume te brengen.

Om de inkapselingsefficiëntie van de lipide nanodeeltjes te beoordelen, bereidt u eerst tweevoudige seriële verdunningen van werkende nucleïnezuuroplossing in PBS om een standaardcurve te genereren, beginnend bij 500 nanogram per milliliter en met ten minste vijf verdunningen. Bereid vervolgens de verdunningen van het nanodeeltjesmonster in PBS voor om een geschikte theoretische concentratie te bereiken die rond het middelpunt van de standaardcurve ligt. Bereid vervolgens het ribogroene RNA-reagens voor om de aanwezigheid van RNA zowel binnen als buiten het lipide nanodeeltje te detecteren door de juiste hoeveelheden RNA-reagens, Triton X100 en PBS, te mengen.

Om vervolgens de aanwezigheid van RNA buiten het vloeibare nanodeeltje te detecteren, mengt u de juiste hoeveelheden RNA-reagentia en alleen PBS. Laad repliceert van de nucleïnezuurstandaard en lipide nanodeeltjesoplossingen in een zwarte fluorescentie-capabele 96-putplaat, voeg vervolgens een gelijk volume RNA-kwantificeringsreagens toe met en zonder Triton X100 aan de standaard en monsterrepliceert. Schud de plaat in de plaatlezer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht om een grondige menging van de monsters te verkrijgen en meet vervolgens de fluorescentie op een microplaatlezer bij een excitatiegolflengte van 480 nanometer en een emissiegolflengte van 520 nanometer.

Om de hydrodynamische grootte en polydispergeeriteit van de lipide nanodeeltjes te meten, verdunt u eerst de nanodeeltjesoplossing 40 keer in PBS en voegt u de oplossing toe aan een semi-microcuvet. Laad de cuvette op de Zetasizer en selecteer een standaard bedieningsprocedure om het instrument in te stellen om de nanodeeltjes te meten op basis van hun materiaal, dispergeermiddel, temperatuur en celtype. Klik vervolgens op Start om de hydrodynamische grootte en polydispergeeriteit van de lipide nanodeeltjes te meten.

Om het Zeta-potentieel van lipide nanodeeltjes te meten, verdunt u de nanodeeltjesoplossing 40 keer in nucleasevrij water en laadt u de oplossing in een cuvette naar de vullijn. Laad de cuvette in een Zeta-potentiaalanalysator, zorg ervoor dat de elektroden contact maken met het instrument en stel het instrument in om de Zeta-potentiaal te meten volgens de specifieke samenstelling van de lipide nanodeeltjes. Klik vervolgens op Start"om het Zeta lipide nanodeeltjespotentiaal te meten.

In deze analyse werden meerdere batches lipide nanodeeltjes met dezelfde lipideformulering en amine/fosfaatverhouding op afzonderlijke dagen ontwikkeld om de reproduceerbaarheid van de techniek aan te tonen. Zoals waargenomen, vertoonden batches één en twee overlappende grootteverdelingen met een vergelijkbare polydispergeeriteit, zonder significante verschillen waargenomen in de grootte of inkapselingsefficiëntie tussen de batches. Doorgaans veroorzaken veranderingen in de formuleringsparameters enkele kleine maar statistisch significante verschillen.

Het verlagen van de amine-fosfaatverhouding resulteert bijvoorbeeld in een afname van 4% in de inkapselingsefficiëntie, met een gelijktijdige toename van de hydrodynamische diameter van de nanodeeltjes. Lipide nanodeeltjes geformuleerd met verschillende ioniseerbare lipiden maar dezelfde amine-fosfaatverhouding, vertonen een significante verandering in de inkapselingsefficiëntie en kleine verschillen in de deeltjesdiameter. De inkapseling van plasmide-DNA resulteert in grotere deeltjes in vergelijking met mRA die lipide nanodeeltjes inkapselen, hoewel beide soorten nanodeeltjes een vergelijkbare inkapselingsefficiëntie vertonen.

Veranderingen in de stroomsnelheidsprocesparameter hebben echter geen invloed op de ontwikkeling van lipide nanodeeltjes. Lipide nanodeeltjes hebben geweldige toepassingen, het perfecte voorbeeld zijn de onlangs goedgekeurde COVID-19-vaccins. Deze techniek dient als een geweldige gereedschapsset en maakt de weg vrij voor toekomstige toepassingen door screening van de formulering van de onderste ledematen mogelijk te maken.