Het gebruik van levende cel STED beeldvorming om de ultrastructuur van het mitochondriale binnenmembraan in neuronale celmodellen te visualiseren
June 30th, 2023
Dit protocol presenteert een workflow voor de voortplanting, differentiatie en kleuring van gekweekte SH-SY5Y-cellen en primaire hippocampusneuronen van ratten voor visualisatie en analyse van de mitochondriale ultrastructuur met behulp van gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie.
Ons onderzoeksprogramma richt zich op structurele en functionele aspecten van mitochondriën, met name als ze betrekking hebben op verouderingsgerelateerde disfunctie. Daartoe gebruiken we een breed scala aan biofysische, biochemische en structurele technieken om de basismechanismen van mitochondriale veroudering te onderzoeken en therapeutische interventies te ontwikkelen om de mitochondriale gezondheid te behouden en te herstellen. Mitochondriale functie en structuur zijn onlosmakelijk met elkaar verbonden.
Standaard lichtmicroscopietechnieken zijn geschikt voor het meten van grootschalige mitochondriale kenmerken zoals basismorfologie en netwerkstructuren. Het analyseren van de mitochondriale ultrastructuur of kenmerken die een hogere resolutie vereisen dan traditionele optische microscopie, wordt meestal gedaan met behulp van elektronenmicroscopie of tomografie op vaste monsters. Superresolutiemicroscopie is een op fluorescentie gebaseerde beeldvormingstechniek die kenmerken meet die verder gaan dan de diffractielimiet.
Voor mitochondriën omvat dit metingen van eiwitverdeling op nanoschaal en cristae-architectuur. Het hier beschreven stead imaging-protocol stelt onderzoekers in staat om de gedetailleerde structuur van het binnenmembraan in levende cellen te meten. Beeldvorming van levende cellen stelt ons in staat om complexe kenmerken van cristae te observeren en kwantitatief te analyseren onder fysiologisch relevante omstandigheden zonder dat monsterfixatie nodig is.
Dit zal onderzoekers nieuwe inzichten geven in de dynamische veranderingen die optreden in ultrastructurele kenmerken en hun temporele reacties op stressoren en farmacologische verbindingen.
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor de propagatie, differentiatie en kleuring van SH-SY5Y-cellen en primaire rattenhippocampus-neuronen. Het doel is om mitochondriale ultrastructuur te visualiseren en te analyseren met behulp van geïnduceerde emissiedepletie (STED) microscopie, waardoor inzichten worden verkregen in de structurele dynamica van mitochondriën in levende cellen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Mitochondriaal onderzoek
Achtergrond
- De structuur en functie van mitochondriën zijn cruciaal voor de gezondheid van cellen.
- Traditionele microscopie is beperkt in resolutie voor ultrastructurele analyse.
- Superresolutiemicroscopie maakt gedetailleerdere beeldvorming van mitochondriale kenmerken mogelijk.
- Inzicht in mitochondriale veranderingen kan inzichten bieden in veroudering en disfunctie.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te vestigen voor het bestuderen van mitochondriale ultrastructuur in levende cellen.
- Om onderzoekers in staat te stellen dynamische veranderingen in mitochondriale morfologie te analyseren.
- Om een basis te bieden voor het onderzoeken van mitochondriale reacties op verschillende behandelingen.
Gebruikte methoden
- Celcultuur en differentiatie van SH-SY5Y neuroblastomacellen.
- Bereiding van primaire rattenhippocampus-neuronen.
- Gebruik van STED microscopie voor hoog-resolutie beeldvorming.
- Belangrijke stappen omvatten het ontdooien van cellen, het coaten van deksels en kleuring met PKMO.
- Beeldverwerving en analyse door middel van specifieke software en plugins.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van mitochondriale structuren op nanoschaal resolutie.
- Inzichten in de architectuur van cristae en de verdeling van eiwitten binnen mitochondriën.
- Kwantitatieve analyse van veranderingen in mitochondriale kenmerken onder fysiologische omstandigheden.
- Potentieel belangrijke bevindingen met betrekking tot de reactie van mitochondriën op farmacologische verbindingen.
Conclusies
- De studie demonstreert een waardevolle techniek voor het onderzoeken van mitochondriale dynamica in levende cellen.
- Draagt bij aan het begrijpen van de rol van mitochondriën in cellulaire veroudering en gezondheid.
- Implicaties voor therapeutische interventies gericht op het herstellen van mitochondriale functie.
