Muis Ronde Spermatide Injectie

Ronde spermatide-injectie kan het probleem van de voortplanting bij sommige niet-obstructieve azoöspermiepatiënten oplossen, maar de efficiëntie is erg laag. Onze studie gebruikte muizen als modellen om te zoeken naar methoden om de embryonale ontwikkelingsefficiëntie van ROSI bij muizen te verbeteren. Onvolledige statistieken geven aan dat er wereldwijd minder dan 200 menselijke ROSI-verwekte foetussen zijn afgeleverd.

Een keerpunt in het begrijpen van het potentieel van ROSI-technologie vond plaats in 2015, toen Tanaka en collega's rapporteerden over de succesvolle geboorten van 14 foetussen door middel van ROSI-technologie, wat hernieuwd vertrouwen wekte in de klinische toepassing en haalbaarheid ervan. De huidige focus van ROSI-onderzoek ligt op afwijkingen in epigenetische modificaties en abnormale eicelgeassisteerde activering, terwijl het nauwkeurig identificeren van ronde spermagegevens ook een uitdaging is. De ontwikkelingsefficiëntie van ROSI-embryo's bij muizen is al erg hoog in ons laboratorium, wat vergelijkbaar is met andere laboratoria.

De ontwikkelingsefficiëntie van niet-knaagdieren, zoals mensen, is echter nog erg nieuw. In de toekomst zullen we ons richten op het verbeteren van de ontwikkelingsefficiëntie van niet-knaagdieren. Injecteer om te beginnen een zes tot acht weken oude vrouwelijke muis intraperitoneaal met 7,5 internationale eenheden van drachtige merrie serumgonadotrofine om 17.00 uur en humaan choriongonadotrofine 48 uur later.

Zorg ervoor dat er geen contact met mannelijke muizen optreedt na de injectie. Na het euthanaseren van de muis, opent u zijn buikholte. Snijd met een schaar de eileiders in de buurt van beide eierstokken door en plaats ze in een M2-buffer die is voorverwarmd op 37 graden Celsius.

Zoek onder het 10X-objectief van een rechtopstaande microscoop het transparante, vergrote deel van de eileider. Zet vervolgens met een spuit van één milliliter de eileider vast, snijd het vergrote deel door en verzamel de coronale cumuluscomplexen van de eicel. Om granulosacellen te verwijderen, plaatst u het eicellencomplex in een voorverwarmde M2-operatieoplossing die 0,1% hyaluronidase bevat en blaast u voorzichtig door een orale pipet.

Breng de eicel serieel over naar KSOMaa-druppels om drie keer te spoelen en plaats deze in een broedmachine van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Zorg om te beginnen voor een geëuthanaseerde C57BL/6-muis van acht tot 10 weken oud. Open de buikholte en snijd de bijbal bij de testis voorzichtig weg met een schaar.

Plaats de schaal met bijbal in M2-medium onder 10X objectief van een rechtopstaande microscoop. En gebruik een spuit van één milliliter om de bijbal voorzichtig weg te snijden om de spermatozoa naar buiten te laten stromen. Hevel de stromende spermatozoa in suspensie over in de bodem van een buis met 0,5 milliliter M2-buffer.

Voor ronde spermatide-isolatie brengt u de ontlede zaadbal over naar de M2-buffer. Snijd met een spuit van één milliliter voorzichtig het witte membraan onder de microscoop en knijp vervolgens de ingewikkelde tubuli seminiferi uit en snijd ze eruit. Na het extraheren van de suspensie wordt er gefiltreerd met een zeef van 400 mazen en worden de gefilterde cellen gecentrifugeerd.

Gooi het bovenstaande weg en incubeer de cellen met 200 microliter Hoechst 33342 bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Plaats het cytometriebuisje met gekleurde cellen in de flowcytometer. Selecteer na het aanpassen van de spanning de celpopulatie op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing.

Verwijder vervolgens de celverklevingen volgens de voorwaartse verstrooiing en de triggerpulsbreedte. Gebruik twee detectiekanalen onder een laser met een golflengte van 355 nanometer om de ronde spermatiden te sorteren en op te slaan bij vier graden Celsius. Onder de microscoop hadden ronde spermatiden van muizen een diameter van ongeveer 10 micrometer en vertoonden ze een uitsteekselachtige nucleolusstructuur in het midden.

Verkrijg om te beginnen eicellen en ronde spermatiden van muizen. Bereid vervolgens de vasthoud- en injectienaalden met de juiste diameters voor. Plaats de eicellen in M2-druppels van 10 microliter met of zonder cytochalasine B om de gameten zachter te maken en op te slaan.

Plaats vervolgens de ronde spermatiden'M2-druppeltjes en monteer de operatieschaal op de microscopisch kleine operatietafel. Pas de positie van de injectie aan en zet de naald vast. Gebruik polyvinylpyrrolidon of PVP om de injectienaald te bevochtigen en te reinigen.

Extraheer vervolgens de ronde spermatide in de injectienaald. Draai de eicel met de bevestigingsnaald om het polaire lichaam van de eicellen op 12 uur te oriënteren. Plaats vervolgens de injectienaald voorzichtig op de drie uur positie op de eicel.

Maak met behulp van een PiezoXpert-apparaat een gat in de zona pellucida van de eicel. Schuif vervolgens de injectienaald voorzichtig horizontaal in de eicel en scheur het eicelmembraan. Injecteer de ronde spermatide geleidelijk in het cytoplasma van de eicel.

Trek de injectienaald terug en zuig een kleine hoeveelheid van het membraan van de eicellen op bij de opening om deze af te dichten. Voor intracytoplasmatische sperma-injectie plaatst u de spermatozoa op een PVP-landingsbaan. Zuig de spermatozoa uit de staart en plaats de nek bij de opening van de injectienaald.

Breng een piëzo aan om de spermakop van de staart te scheiden. Injecteer vervolgens het sperma in de eicel, zoals eerder aangetoond, met een injectienaald met een diameter van negen tot 10 micrometer. Voor geassisteerde eicelactivering plaatst u de eicellen in druppels van 20 microliter calcium- en magnesiumvrij CZB-medium dat strontiumchloride-hexahydraat bevat.

Breng ze vervolgens over naar KSOMaa-kweekmedium voor teelt. Stel tegelijkertijd een groep op voor activering van parthenogenese zonder ronde spermatiden of spermatozoa te injecteren voor embryologisch onderzoek. Na activering overbrengen naar KSOMaa-kweekmedium voor teelt.

Ronde met spermatide geïnjecteerde embryo's vertoonden een verminderde ontwikkelingsefficiëntie in vergelijking met de intracytoplasmatische met sperma geïnjecteerde embryo's.