Muis Ronde Spermatide Injectie
January 26th, 2024
Hier introduceren we een methode voor het uitvoeren van ronde spermatide-injectie (ROSI) bij muizen, een techniek met veelbelovende klinische toepassingen en bruikbaarheid voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de embryonale ontwikkeling.
Ronde spermatide-injectie kan het probleem van de voortplanting bij sommige niet-obstructieve azoöspermiepatiënten oplossen, maar de efficiëntie is erg laag. Onze studie gebruikte muizen als modellen om te zoeken naar methoden om de embryonale ontwikkelingsefficiëntie van ROSI bij muizen te verbeteren. Onvolledige statistieken geven aan dat er wereldwijd minder dan 200 menselijke ROSI-verwekte foetussen zijn afgeleverd.
Een keerpunt in het begrijpen van het potentieel van ROSI-technologie vond plaats in 2015, toen Tanaka en collega's rapporteerden over de succesvolle geboorten van 14 foetussen door middel van ROSI-technologie, wat hernieuwd vertrouwen wekte in de klinische toepassing en haalbaarheid ervan. De huidige focus van ROSI-onderzoek ligt op afwijkingen in epigenetische modificaties en abnormale eicelgeassisteerde activering, terwijl het nauwkeurig identificeren van ronde spermagegevens ook een uitdaging is. De ontwikkelingsefficiëntie van ROSI-embryo's bij muizen is al erg hoog in ons laboratorium, wat vergelijkbaar is met andere laboratoria.
De ontwikkelingsefficiëntie van niet-knaagdieren, zoals mensen, is echter nog erg nieuw. In de toekomst zullen we ons richten op het verbeteren van de ontwikkelingsefficiëntie van niet-knaagdieren. Injecteer om te beginnen een zes tot acht weken oude vrouwelijke muis intraperitoneaal met 7,5 internationale eenheden van drachtige merrie serumgonadotrofine om 17.00 uur en humaan choriongonadotrofine 48 uur later.
Zorg ervoor dat er geen contact met mannelijke muizen optreedt na de injectie. Na het euthanaseren van de muis, opent u zijn buikholte. Snijd met een schaar de eileiders in de buurt van beide eierstokken door en plaats ze in een M2-buffer die is voorverwarmd op 37 graden Celsius.
Zoek onder het 10X-objectief van een rechtopstaande microscoop het transparante, vergrote deel van de eileider. Zet vervolgens met een spuit van één milliliter de eileider vast, snijd het vergrote deel door en verzamel de coronale cumuluscomplexen van de eicel. Om granulosacellen te verwijderen, plaatst u het eicellencomplex in een voorverwarmde M2-operatieoplossing die 0,1% hyaluronidase bevat en blaast u voorzichtig door een orale pipet.
Breng de eicel serieel over naar KSOMaa-druppels om drie keer te spoelen en plaats deze in een broedmachine van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Zorg om te beginnen voor een geëuthanaseerde C57BL/6-muis van acht tot 10 weken oud. Open de buikholte en snijd de bijbal bij de testis voorzichtig weg met een schaar.
Plaats de schaal met bijbal in M2-medium onder 10X objectief van een rechtopstaande microscoop. En gebruik een spuit van één milliliter om de bijbal voorzichtig weg te snijden om de spermatozoa naar buiten te laten stromen. Hevel de stromende spermatozoa in suspensie over in de bodem van een buis met 0,5 milliliter M2-buffer.
Voor ronde spermatide-isolatie brengt u de ontlede zaadbal over naar de M2-buffer. Snijd met een spuit van één milliliter voorzichtig het witte membraan onder de microscoop en knijp vervolgens de ingewikkelde tubuli seminiferi uit en snijd ze eruit. Na het extraheren van de suspensie wordt er gefiltreerd met een zeef van 400 mazen en worden de gefilterde cellen gecentrifugeerd.
Gooi het bovenstaande weg en incubeer de cellen met 200 microliter Hoechst 33342 bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Plaats het cytometriebuisje met gekleurde cellen in de flowcytometer. Selecteer na het aanpassen van de spanning de celpopulatie op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing.
Verwijder vervolgens de celverklevingen volgens de voorwaartse verstrooiing en de triggerpulsbreedte. Gebruik twee detectiekanalen onder een laser met een golflengte van 355 nanometer om de ronde spermatiden te sorteren en op te slaan bij vier graden Celsius. Onder de microscoop hadden ronde spermatiden van muizen een diameter van ongeveer 10 micrometer en vertoonden ze een uitsteekselachtige nucleolusstructuur in het midden.
Verkrijg om te beginnen eicellen en ronde spermatiden van muizen. Bereid vervolgens de vasthoud- en injectienaalden met de juiste diameters voor. Plaats de eicellen in M2-druppels van 10 microliter met of zonder cytochalasine B om de gameten zachter te maken en op te slaan.
Plaats vervolgens de ronde spermatiden'M2-druppeltjes en monteer de operatieschaal op de microscopisch kleine operatietafel. Pas de positie van de injectie aan en zet de naald vast. Gebruik polyvinylpyrrolidon of PVP om de injectienaald te bevochtigen en te reinigen.
Extraheer vervolgens de ronde spermatide in de injectienaald. Draai de eicel met de bevestigingsnaald om het polaire lichaam van de eicellen op 12 uur te oriënteren. Plaats vervolgens de injectienaald voorzichtig op de drie uur positie op de eicel.
Maak met behulp van een PiezoXpert-apparaat een gat in de zona pellucida van de eicel. Schuif vervolgens de injectienaald voorzichtig horizontaal in de eicel en scheur het eicelmembraan. Injecteer de ronde spermatide geleidelijk in het cytoplasma van de eicel.
Trek de injectienaald terug en zuig een kleine hoeveelheid van het membraan van de eicellen op bij de opening om deze af te dichten. Voor intracytoplasmatische sperma-injectie plaatst u de spermatozoa op een PVP-landingsbaan. Zuig de spermatozoa uit de staart en plaats de nek bij de opening van de injectienaald.
Breng een piëzo aan om de spermakop van de staart te scheiden. Injecteer vervolgens het sperma in de eicel, zoals eerder aangetoond, met een injectienaald met een diameter van negen tot 10 micrometer. Voor geassisteerde eicelactivering plaatst u de eicellen in druppels van 20 microliter calcium- en magnesiumvrij CZB-medium dat strontiumchloride-hexahydraat bevat.
Breng ze vervolgens over naar KSOMaa-kweekmedium voor teelt. Stel tegelijkertijd een groep op voor activering van parthenogenese zonder ronde spermatiden of spermatozoa te injecteren voor embryologisch onderzoek. Na activering overbrengen naar KSOMaa-kweekmedium voor teelt.
Ronde met spermatide geïnjecteerde embryo's vertoonden een verminderde ontwikkelingsefficiëntie in vergelijking met de intracytoplasmatische met sperma geïnjecteerde embryo's.
Overzicht
Dit artikel introduceert een methode voor het uitvoeren van ronde spermatidinjectie (ROSI) bij muizen, gericht op het verbeteren van de efficiëntie van embryonale ontwikkeling. De techniek heeft potentiële klinische toepassingen voor het aanpakken van niet-obstructieve azoöspermie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Reproductieve biologie
- Embryonale ontwikkeling
- Geassisteerde reproductieve technologie
Achtergrond
- ROSI richt zich op reproductieproblemen bij patiënten met niet-obstructieve azoöspermie.
- De efficiëntie van ROSI is momenteel laag, met minder dan 200 wereldwijd bevallen menselijke foetussen.
- In 2015 werd een belangrijke vooruitgang gemeld met de geboorte van 14 foetussen via ROSI.
- Huidig onderzoek richt zich op epigenetische modificaties en uitdagingen bij oöcyte-activering.
Doel van het onderzoek
- Om de embryonale ontwikkelingsefficiëntie van ROSI in muismodellen te verbeteren.
- Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan embryonale ontwikkeling via ROSI te onderzoeken.
- Om bij te dragen aan het begrip van de klinische haalbaarheid van ROSI.
Gebruikte methoden
- Gebruik van muismodellen voor ROSI-techniek.
- Onderzoek naar de efficiëntie van embryonale ontwikkeling.
- Analyse van epigenetische modificaties.
- Uitdagingen bij het identificeren van ronde sperma-gegevens.
Belangrijkste resultaten
- Hoge embryonale ontwikkelingsefficiëntie van ROSI-embryo's in muismodellen.
- Vergelijkbare resultaten waargenomen in meerdere laboratoria.
- Vernieuwde vertrouwen in de klinische toepassing van ROSI-technologie.
- Identificatie van belangrijke uitdagingen in het huidige onderzoekslandschap.
Conclusies
- ROSI belooft verbetering van reproductieve resultaten voor specifieke patiëntenpopulaties.
- Verder onderzoek is nodig om bestaande uitdagingen aan te pakken en de efficiëntie te verbeteren.
- Begrip van epigenetische factoren is cruciaal voor het bevorderen van ROSI-technologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Round spermatid injection (ROSI) enables the generation of viable embryos from haploid precursor cells, providing a unique tool for dissecting mechanisms of fertilization and early embryonic development. This technique is strategically positioned to accelerate mouse model generation and facilitate the production of genetically modified lines, directly impacting preclinical research pipelines. Despite its promise, ROSI's translational value is currently limited by low efficiency and unresolved safety validation, underscoring the need for rigorous mechanistic de-risking before broader adoption.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of fertilization mechanisms and early developmental pathways in controlled genetic backgrounds.
- Supports biological de-risking by allowing direct assessment of haploid cell contribution to embryogenesis.
- Facilitates functional validation of genetic modifications in germline transmission studies.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for standardizing oocyte activation and embryonic development assays in mouse models.
- Enables reproducible preparation of embryos for downstream phenotypic or molecular screening.
- Supports quantitative assessment of developmental efficiency across genetic backgrounds or interventions.
Translational & Preclinical Research
- Accelerates generation of genetically modified mouse lines for disease modeling and preclinical studies.
- Offers a system for evaluating epigenetic and developmental consequences of germline manipulations.
- Supports risk-adjusted advancement of reproductive technologies by clarifying mechanistic bottlenecks.
Pipeline & Workflow Integration
ROSI is positioned at the intersection of early discovery and preclinical model generation, enabling rapid hypothesis testing and functional validation in vivo.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic studies of fertilization and embryogenesis using defined genetic inputs.
- Screening: Standardizes embryo production for comparative developmental assays and intervention testing.
- Analytics: Delivers quantitative readouts of developmental efficiency and viability for cross-condition benchmarking.
- Translational Research: Bridges basic reproductive biology with preclinical model development for disease studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for generating and validating genetically engineered mouse lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in germline transmission and developmental outcomes.
- Operational Value: Enables standardized, scalable embryo production for research pipelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for advancing reproductive and genetic engineering technologies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of model generation and mechanistic studies.
Implementation Considerations
- Requires specialized expertise in micromanipulation and reproductive biology.
- Demands access to advanced microscopy, flow cytometry, and embryo culture infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to non-rodent systems remains challenging due to lower efficiency and safety uncertainties.
- Practical limitations include identification of round spermatids and optimization of oocyte activation protocols.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:34
Preparation of Mouse Oocytes for Round Spermatid Injection to Study Embryological Events
3:09
Preparation of Murine Round Spermatids and Spermatozoa for Oocyte-Injection and Embryological Studies
5:29
Injection of Mouse Round Spermatids into Oocytes to Study Embryonic Development in Mice
