Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

We ontwikkelden een real-time microscopiemethode voor de kwantificering van neutrofiele extracellulaire vallen of NET's. Deze NET's spelen een belangrijke rol in de aangeboren immuunafweer. Het is echter duidelijk geworden dat accumulatie van NET in weefsels bijdraagt aan de pathofysiologie van meerdere ontstekings- en auto-immuunziekten.

Vanwege de pathologische implicaties van NET is de belangstelling voor de ontwikkeling van NETosis-antagonisten toegenomen. Om de remming van NETosis te bestuderen, hebben we een real-time microscopiemethode ontwikkeld voor de kwantificering van menselijke NET-afgifte, waardoor we NETosis en de remming ervan op een high-throughput manier kunnen bestuderen. Neutrofielen zijn gevoelige cellen en kunnen tijdens het zuiveringsproces hun reactie op prikkels veranderen als gevolg van mechanische, microbiële en andere vormen van stress.

Daarom is het belangrijk om het neutrofielenisolatieprotocol te valideren om de activering van neutrofielen te minimaliseren. Deze techniek maakt het dus mogelijk om de NET-afgifte van zowel gezonde als zieke personen te bestuderen. Bovendien stelt het ons in staat om de kinetiek van NET-vorming te bestuderen die wordt geïnduceerd door verschillende fysiologische stimuli.

Met deze high-throughput microscopietechniek konden we aantonen dat de NETosis-antagonist CIT-013, een monoklonaal antilichaam gericht tegen gecitrullineerde histonen 2A en 4, in staat was om de NET-afgifte efficiënt te remmen met een IC 50 of 4,6 nanomolair. Dit toont aan dat deze test geschikt is voor het testen van NETosis-antagonisten. Na het verzamelen van perifeer bloed van de gezonde vrijwilliger in een lithium-heparinebuisje, brengt u het bloed over in een vers buisje van 50 milliliter.

Spoel de lithium-heparinebuis af met DPBS en breng deze over in dezelfde buis van 50 milliliter, waarbij u ervoor zorgt dat de verhouding tussen bloed en DPBS 1:1 is. Voeg na het mengen verdund bloed toe aan de oplossing van de dichtheidsgradiënt. Centrifugeer het bloed bij 400 G gedurende 40 minuten met minimale versnelling en pauze.

Gooi de bovenste plasmalaag weg met een pipet van 10 milliliter. Gebruik vervolgens een plastic pasteurpipet om de perifere mononucleaire bloedcellen en de oplossing van de dichtheidsgradiënt weg te gooien. Schud de laag met erytrocyten en neutrofielen voorzichtig voordat u deze opnieuw suspendeert in 15 milliliter DPBS.

Voeg 25 milliliter 6% dextran en 0,9% natriumchloride-oplossing toe en meng door de buis om te keren. Breng na 25 minuten incubatie de bovenste neutrofielenlaag over in een nieuwe buis van 50 milliliter met een pipet van 10 milliliter en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 G. Decanteer de buis om het bovenstaande weg te gooien en suspendeer de pellet opnieuw in 10 milliliter ammoniumchloride-kaliumlysisbuffer.

Voeg 40 milliliter van dezelfde lysisbuffer toe en incubeer bij kamertemperatuur terwijl u de buis continu omkeert totdat de oplossing doorschijnend wordt. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten op 350 G. Voeg na het verwijderen van het supernatant langzaam en druppelsgewijs vijf milliliter kweekmedium, 10% toe aan de neutrofielenkorrel zonder de neutrofielen in suspensie te brengen.

Draai de buis voorzichtig rond totdat de meeste erytrocyten die bovenop de neutrofielenkorrel aanwezig zijn, weer in het kweekmedium zijn gesuspendeerd. Na het verwijderen van het supernatant, suspendeert u de neutrofielenkorrel opnieuw in 10 milliliter kweekmedium, 10%Eenmaal volledig opnieuw gesuspendeerd, voegt u tot 50 milliliter kweekmedium 10% toe en centrifugeert u het mengsel voordat u de pellet opnieuw suspendeert in 10 milliliter Neutrofiele extracellulaire val of NET-assaybuffer. Voeg om te beginnen 0,001% Poly-L-lysine-oplossing toe aan elk putje van de plaat met 96 putjes en incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius.

Was de putjes drie keer met 200 microliter DPBS en laat de putjes aan de lucht drogen. Breng vervolgens het vereiste aantal neutrofielen opnieuw in suspenis in de neutrofielenval of NET-assaybuffer. Breng vier keer geconcentreerde DNA-kleurstof in de NET-testbuffer over naar elk putje.

Voeg viermaal geconcentreerde NETosis-stimuli in de NET-analysebuffer toe aan de overeenkomstige putjes. Voeg vervolgens vier keer geconcentreerde NETosis-antagonisten toe in NET-assaybuffer en neutrofielensuspensie aan de corresponderende putjes. Centrifugeer de plaat gedurende twee minuten op 100 G.

Plaats vervolgens de plaat in het analysesysteem voor levende celmicroscopie dat in een incubator is geplaatst bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Nadat u de beeldvormingsplaat met 96 putjes met neutrofielensuspensie in een analysesysteem voor live-celmicroscopie hebt geplaatst, opent u de systeemsoftware. Klik op schema om te verwerven en klik op de plusknop om te starten.

Selecteer vervolgens scannen op schema en klik op volgende. Als u een geheel nieuw schip wilt maken, selecteert u nieuw in het gedeelte Schip maken en klikt u op volgende. Selecteer in de sectie Scantype de optie Standaard en klik op Volgende.

Selecteer de scaninstellingen als cel voor cel, geen. Beeldkanalen, fasecontrast in groen. Acquisitietijd, 100 milliseconden en objectief 20x.

Klik vervolgens op Volgende. Selecteer in het gedeelte Vaartuigselectie het juiste type vaartuig dat u wilt scannen en klik op Volgende. Geef de locatie in de lade voor het schip op en klik op Volgende.

Selecteer in het gedeelte Scanpatroon de putjes die moeten worden gescand en het aantal afbeeldingen per putje. Klik op Volgende. Geef in de sectie Vessel Notebook informatie over het schip.

Voer de naam van het kenteken in en klik op Volgende. Selecteer in de sectie Analyse instellen de optie Analyse uitstellen tot later en klik op Volgende. Selecteer in de sectie Scanschema de optie Nieuwe planning maken met scans met tussenpozen van en selecteer één uur in de sectie Scans toevoegen aan planning.

Selecteer Stoppen met scannen vijf uur na de eerste scan. Klik op Volgende en klik op Toevoegen aan schema wanneer de scangegevens correct zijn. Na het verkrijgen van fasecontrast- en immunofluorescentiebeelden van neutrofielen, start u de analysesoftware voor live celmicroscopie.

Selecteer in de weergave het experiment met levende celmicroscopie dat u wilt analyseren. Selecteer Nieuwe analysedefinitie maken en klik op Volgende. Selecteer vervolgens de basisanalyser in de sectie Analysetype en klik op Volgende.

Selecteer in het gedeelte Afbeeldingskanaal de optie groen, deselecteer fase en klik op Volgende. Open het venster met afbeeldingslagen, selecteer groen en deselecteer fase. Schakel automatisch schalen uit in het groene gedeelte en stel handmatig min en max in.

Open vervolgens het venster voor de scantijden van het vaartuig en selecteer de afbeeldingen van positieve controleputjes met NET's. Open het instellingenvenster voor de analysedefinitie en schrijf NET's voor de objectnaam. Selecteer voor de segmentatie de optie Adaptief.

Selecteer voor de drempel-GCU tussen drie en vijf en stel de randsplitsing in op tussen min 10 en nul. Selecteer vervolgens voor het opschonen Gat vullen tot 100 vierkante micrometer en pas de grootte aan tot min één pixel. Selecteer uit filters een gebied groter dan 200 vierkante micrometer, een gemiddelde intensiteit minder dan 24,6 en een geïntegreerde intensiteit groter dan 7.000.

Klik vervolgens op voorbeeld van huidig of voorbeeld van alles om de instellingen toe te passen. Beweeg de muisaanwijzer over de verschillende NET-structuren en pas de analyse-instellingen aan om de fout-positieve en vals-negatieve NET's nauwkeurig af te stemmen. Wanneer de instellingen voor de NET-analyse correct zijn, klikt u op Volgende.

Selecteer de tijdstippen en putjes die u wilt analyseren in de sectie scantijden en putjes en klik op Volgende. Voeg de definitienaam in de sectie Analysedefinitie opslaan en toepassen en klik op Volgende. Klik op Voltooien wanneer de analyse-informatie is geverifieerd en correct is.

Open de experimentanalyse door op de analyse in het betreffende vaartuig te klikken. Open vervolgens het venster met grafiekstatistieken. Klik vervolgens op de plusknop om een statistiek te maken.

Wanneer u gegevens presenteert als percentage NETTO samenvloeiing, selecteert u Gebied in de sectie Metriek en selecteert u Samenvloeiing in de sectie Waarde. Wanneer u gegevens presenteert als een percentage van NETting-neutrofielen, selecteert u Aantal objecten in de sectie Metriek en selecteert u Per afbeelding in de sectie Waarde. Nadat u metrische instellingen hebt geconfigureerd, selecteert u in de door de gebruiker gedefinieerde sectie Metrische gegevens de optie NETs Area Confluence of NETs Object Count Per Image.

Selecteer alle vereiste tijdstippen en putten voor analyse in respectievelijk de secties Scans selecteren en Putput selecteren. Klik ten slotte op Gegevens exporteren. Stimulatie van calciumionofoor induceerde snellere NETosis in vergelijking met PMA, wat resulteerde in een groter deel van de neutrofielen die NET afgaven.

NET geïnduceerd door calciumionoforen waren meer diffuus buiten het neutrofiele plasmamembraan, terwijl PMA-geïnduceerde NET dichter bij het neutrofiele plasmamembraan bleef. Een trend naar verhoogde NET-spiegels werd waargenomen wanneer neutrofielen werden geactiveerd met gecoate immuuncomplexen, FMLP en mononatriumuraatkristallen. De NET-afgifte als reactie op een 23187 werd volledig geremd door CIT-013 bij een maximale remmende concentratie van de helft van 4,6 nanomolair.