Isolatie en kweek van primaire adipocyten van muizen van magere en zwaarlijvige muizen

Ons onderzoek richt zich op het onderzoeken van de functie van volgroeide adipocyten uit verschillende vetdepots en voedingscondities. We zijn specifiek geïnteresseerd in het begrijpen hoe volgroeide adipocyten communiceren met omliggende cellen en hoe deze crosstalk de voortgang van ziekten kan beïnvloeden en kan worden veranderd bij obesitas. Volgroeide adipocyten zijn grote en delicate cellen, wat gebruikelijke celisolatiemethoden zoals FACS ineffectief maakt.

Bovendien kunnen hoge niveaus van vrij lipide, die vaak in vetweefsel worden aangetroffen, giftig zijn voor volgroeide adipocyten, waardoor hun onderhoud wordt gecompliceerd. In tegenstelling tot veel gebruikte methoden die afhankelijk zijn van de in vitro differentiatie van preadipocyten, stelt dit protocol ons in staat om ex vivo geïsoleerde adipocyten te bestuderen, die functioneel en transcriptioneel gelijk zijn aan in vivo adipocyten. Dit is bijzonder belangrijk omdat adipocyten sterk variëren tussen verschillende vetdepots en onder verschillende dieetcondities.

Dit protocol isoleert efficiënt, volgroeide adipocyten weerspiegelend en is gemakkelijk schaalbaar. Aanpassingen zijn opgenomen om de isolatie van adipocyten uit muizen van verschillende geslachten en met verschillende voedingscondities te optimaliseren. Eenmaal geïsoleerd, kunnen de adipocyten worden gekweekt, geïmager of anderszins worden gebruikt zoals nodig.

Om te beginnen, bereid een collageenase-oplossing met DNase voor door 0,00017 gram DNase per één milliliter collageenase-oplossing toe te voegen en de mixteer te vortexen om een volledige menging te garanderen. Gebruik een scheermes om het geïsoleerde vetweefsel van de muis fijn te snijden totdat het homogeen lijkt. Breng vervolgens het fijngesneden weefsel over naar een steriele 50-milliliter conische buis.

Voeg de bereide collageenase en DNase-oplossing toe aan het fijngesneden vetweefsel en vortex met maximale snelheid gedurende zeven tot 10 seconden om de componenten grondig te mengen. Plaats vervolgens de 50 milliliter conische buizen horizontaal in een shaker ingesteld op 220 RPM bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder na incubatie de buizen, vortex gedurende vijf seconden en controleer de monsters.

Gebruik nu een serologische pipette om het verteerde weefsel door een zeef in een nieuwe steriele 50-milliliter conische buis te leiden. Voeg FBS toe gelijk aan het volume van weefsel en collageenase-oplossing door de zeef in dezelfde conische buis om de collageenase te neutraliseren. Draai de buizen 300 G gedurende drie minuten bij de temperatuur die in de tabel hier getoond wordt.

Gebruik vervolgens een 200-microliter pipette om voorzichtig de bovenste laag vrije lipiden weg te gooien. Gebruik vervolgens een P1000 pipette met de punt afgesneden om de volgroeide adipocyten over te brengen naar een voorbereide 15-milliliter buis die 10 milliliter groeimedia bevat. Draai de 15-milliliter buizen voorzichtig drie tot vijf keer om te zorgen dat de witte laag zich verspreidt door het media.

Laat de buizen 10 minuten rusten en draai ze vervolgens bij de eerder bepaalde temperatuur om de lagen verder te scheiden. Gebruik vervolgens een pipette om de bovenste laag vrije lipiden weg te gooien. Bevestig vervolgens een 21 gauge naald aan een vijf-milliliter spuit en schuif voorzichtig de naald langs de rand van de buis tot de onderkant van de naald onder de laag volgroeide adipocyten ligt.

Trek vervolgens langzaam aan de spuit om het kweekmedium en eventueel cellulair puin te verwijderen. Voeg voorzichtig 10 milliliter kweekmedium toe aan de buis. Gebruik gel-laadpipet tips om de punt langs de rand van de buis te schuiven om het resterende media onder de laag volgroeide adipocyten te verwijderen.

Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende één minuut bij 100 G. Gebruik een pipette om de vrije lipiden te verwijderen. Gebruik een gel-laadpipet tip om het kweekmedium onder de adipocyten te verwijderen.

Verwijder de celkweekinserts van een weefselkweek-behandelde 24-wellsplaat en plaats ze met de membraanzijde omhoog op het oppervlak van de kap. Vul afwisselende wells van de plaat met warm kweekmedium. Gebruik een afgesneden P200 pipette tip om 30 microliter verpakte volgroeide adipocyten over te brengen naar de bovenkant van een Transwell insert.

Til vervolgens voorzichtig het Transwell insert op, draai het om en plaats het in een vooraf gevulde well in de 24-wellsplaat. Om het medium uit de wells te verwijderen, houd het Transwell insert vast en aspireer met een P200 pipette door de kleine openingen aan de zijkanten. Nadat het medium is verwijderd, voeg terwijl je het Transwell nog steeds vasthoudt, langzaam één milliliter vers medium toe langs de zijwand van de well.