Monitoring van conformationele dynamica van enkelvoudige ongemodificeerde eiwitten met behulp van plasmonische nanopincetten

Dit onderzoek heeft tot doel om in realtime inzicht te krijgen in labelvrije eiwitten op het niveau van één molecuul, met een bijzondere focus op eiwitten die moeilijk te onderzoeken zijn met de huidige technieken of die relevant zijn voor ziekten. Plasmonische nanopincetten hebben onlangs hun vermogen aangetoond om conformationele dynamiek te volgen bij binding aan kleine moleculen, de demontagekinetiek te controleren en vrije energielandschappen op te helderen, allemaal op het niveau van één molecuul. Momenteel is geen enkele gevestigde techniek voor eiwitkarakterisering in staat om de conformationele dynamiek van labelvrije eiwitten met één molecuul te onderzoeken.

Plasmonische nanopincetten worden verondersteld het potentieel te hebben om deze niche binnen het veld te vullen. Dit unieke voordeel helpt ons om de relatie te onderzoeken tussen de conformationele verandering van eiwitten en hun biologische functies en de implicaties voor de ontwikkeling van ziekten. Toekomstig onderzoek zal zich richten op intrinsiek ongeordende en membraaneiwitten, aangezien veel van deze betrokken zijn bij verschillende ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, Parkinson en verschillende vormen van kanker.

Plaats om te beginnen het met PEG-thiol gecoate monster met een recht pincet in de 3D-geprinte flowcel, waarbij u ervoor zorgt dat de goudlaag naar boven wijst. Verwijder een kant van de doorzichtige dubbelzijdige tapehoes van PET-plastic. Plaats de tape voorzichtig over het monster en de flowcel en zorg ervoor dat de nanostructuren en inlaat-/afvoergaten in de flowcel onbedekt blijven.

Druk met een afgerond pincet voorzichtig langs de randen van de tape om de hechting aan de flowcel en het monster te bevestigen. Verwijder de andere kant van de tape en plaats voorzichtig een glazen afdekplaat over het monster. Gebruik een afgerond pincet om langs de randen van het dekglaasje te drukken om de hechting te bevestigen.

Dit proces creëert een vloeistofkanaal in de flowcel met een hoogte van 50 micrometer en een volume van 3,5 microliter. Meng met behulp van een kleine pipetpunt gelijke delen oplossing A en oplossing B van de duplicaatsiliconen op een microscoopglaasje in een één-op-één-verhouding of op aanwijzing van de fabrikant. Vul de openingen tussen de dekstrook en de stroomcel op met een gemengde duplicaatsiliconen en duw deze voorzichtig onder de dekplaat.

Houd de flowcel ondersteboven en breng voorzichtig dubbele siliconen aan rond de binnenwand van het gat. Verplaats de siliconen voorzichtig op de zichtbare randen van de gesmolten silica onderkant van het monster en laat het monster drogen met de goudlaag naar boven gericht totdat de duplicerende siliconen volledig zijn uitgehard. Nadat u hebt gecontroleerd of alle componenten correct zijn aangesloten, laadt u de gebruikersinterface van het microfluïdische systeem op de computer.

Klik op het afspeelpictogram naast de MUX-verdeler en draad, die respectievelijk de 12 met één roterende klep en de drie-tweewegklep aansturen om de bijbehorende interfaces te openen. Om de driewegklep te omzeilen, zet u poort één van de draad aan. Om de flowcel in een plasmonisch nanopincet te monteren, bevestigt u de inlaat- en uitlaatbuizen aan de juiste delen van de flowcel.

Plaats de flowcel op een schone tissue met de goudlaag naar boven. Breng de buffer in de flowcel met een hoog debiet van ongeveer 0,3 milliliter per minuut. Controleer of de vloeistof over het monster in de stroomcel beweegt en of er geen vloeistof zichtbaar is aan de buiten- of onderkant.

Breng een tot twee druppels immersieolie aan op het 100X-objectief. Plaats de flowcel in het stadium van het plasmonische nanopincet met de goudlaag naar beneden gericht. Zet de flowcel vast met metalen clips over de magneten en vergrendel de tafel om hem op zijn plaats te houden.

Zet de witte lichtbron aan. Open de camerasoftware en pas de belichtingstijd en versterking aan totdat de nanostructuren zichtbaar worden. Zet de laser aan op een relatief hoog vermogen en stel de Z-as handmatig in totdat de laserspot zichtbaar is.

Schakel de piëzo-elektrische controller in en selecteer de juiste instellingen voor de communicatiepoort en de maximale voltage. Stel de waarden van de X-, Y- en Z-as in op de helft van de maximale spanning voor een betere uitlijning van de trap in alle richtingen. Lijn de laserspot uit met een van de dubbele nano-gat- of DNH-structuren met behulp van de bedieningsknoppen van de hoofdtrap X, Y en Z.

Zorg ervoor dat de lawinefotodiode of APD is ingeschakeld. Sluit de behuizing voorzichtig af voor het plasmonische nanopincet. Open de software die is gekoppeld aan APD-opname, zoals een zelfgemaakte LabVIEW-gebruikersinterface. Bewerk de bestandsnaam en stel de afkapfrequentie in op één kilohertz.

Geef vervolgens het gewenste bestandspad op waar de bestanden worden opgeslagen. Schakel de witte lichtbron uit en zet de laser weer aan. Nadat u het laservermogen op het juiste niveau hebt ingesteld, gebruikt u de piëzo-elektrische bedieningselementen om de X-, Y- en Z-as aan te passen totdat het APD-signaal zo hoog mogelijk is.

Het vermijden van APD-verzadiging en met minimale standaarddeviatie van het spoor. Schakel vervolgens de laser uit om de levensduur van de nanostructuren te behouden. Laat de besturingseenheid van de spuitpomp en de gebruikersinterface van de verdeler draaien om de klep in te stellen en de gewenste hoeveelheid eiwit op te zuigen.

Gebruik de microfluïdische UI om de eiwitoplossing te infuseren met een stroomsnelheid die vergelijkbaar is met de opnamesnelheid. Ga door met de infusie in dit tempo totdat de eiwitoplossing de stroomcel bereikt. Stel vervolgens het debiet in op een geschikte waarde voor het vangen en wacht tot het spoor is gestabiliseerd.

Controleer of het volume en de tijd op de spuitpomp overeenkomen met de verwachte waarden. Om de APD-signaalgegevens op te nemen, past u de X-, Y- en Z-as naar behoefte aan met behulp van de gebruikersinterface van de piëzo-elektrische controller. Bij het waarnemen van een grote verandering in transmissie en standaarddeviatie, noteer dan de tijd dat dit gebeurt voor toekomstige gegevenssortering. Als het eiwit moet worden vrijgegeven als onderdeel van het experiment, schakelt u de laser ongeveer vijf seconden uit en vervolgens weer aan.

Het spoor moet een grote verandering in transmissie en een significant lagere standaarddeviatie hebben, wat wijst op een terugkeer naar de basislijntoestand. Schakel na het voltooien van het experiment de laser uit. Verwijder de flowcel van de drie-assige tafel en koppel de slang van het microfluïdische systeem los.

Plaats de flowcel op een schone tissue met de goudlaag naar boven. Snijd met een scalpel voorzichtig de lijm onder de glazen afdekplaat af voordat u deze voorzichtig optilt en weggooit. Houd de flowcel schuin met de goudlaag nog steeds naar boven gericht en gebruik een afgerond pincet om de lijm voorzichtig van de onderkant van de flowcel te verwijderen om het monster vrij te maken.

Pak het monster met een recht pincet op en spoel het grondig af met isopropanol. Droog het monster met een luchtpistool. Een representatief experiment uitgevoerd op in-situ ijzerbelasting van een apoferritinemolecuul demonstreert het gebruik van plasmonische nanopincetten als een hulpmiddel om de conformationele dynamiek van eiwitten te onderzoeken.

Het transmissiespoor van apoferritine blijft stabiel wanneer het wordt opgesloten in een PBS-oplossing, wat wijst op geen significante conformatieveranderingen. Bij blootstelling aan de ijzeroplossing namen de fluctuaties in de standaarddeviaties van het spoor toe, wat wijst op dynamische structurele veranderingen die verband houden met ijzerbelasting. Na 20 minuten blootstelling aan ijzer stabiliseerde het transmissiespoor, wat wijst op de overgang van apoferritine naar zijn holovorm.

De kansdichtheidsfunctiegrafieken toonden een verschuiving in de spanningsverdeling bij ijzerbelasting aan, wat de conformationele overgang van apoferritine naar holoferritine verder ondersteunt.