Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

Single-molecule force spectroscopie kan enorme inzichten geven in moleculaire biologie op atomaire schaal door ons in staat te stellen enkele moleculen met kracht te manipuleren. Hier demonstreren we een constante snelheidsmeting met behulp van atoomkrachtmicroscoop. We kunnen uiteindelijk gebruik maken van de gegevens om de eiwitstabiliteit te bepalen, ontvouwen snelheid, en ontvouwen traject.

Om de procedure te beginnen, bevestigt u een niet-geleidende kleeftabblad aan een schone ijzerschijf van 15 millimeter. Verwijder het dekblad en druk stevig op een schone, ongecoate of met goud bedekte glazen schuif op de blootgestelde lijm. Bewaar de glijbaan in een schone, overdekte petrischaal.

Concentreer vervolgens de gezuiverde polyproteïne in een centrifugaalfilter, draai de kolom vervolgens om en ontwijk het eiwit in de buffer die in het experiment moet worden gebruikt. Bepaal de juiste eiwitconcentratie op basis van de absorptie op 280 nanometer en bereid vervolgens 100 microliter van een 100 microgram per milliliteroplossing van het eiwit voor. Breng een 60 microliter druppel van de eiwitoplossing aan op het midden van de dia.

Zorg ervoor dat de vloeistof niet tussen de dia en de ijzerschijf wordt glijdt, omdat dit zal leiden tot ongecontroleerde monsterbewegingen tijdens het experiment. Laat het monster minstens 10 minuten op kamertemperatuur zitten. Eerst, zorgvuldig pick-up van de cantilever door het einde en plaats het in de sonde holding cel.

Zorg ervoor dat de cantilever stevig zit. Plaats dan de cel in het HOOFD van de AFM. Zet het hoofd op een omgekeerde microscoop fase en sluit een batterij aan op de AFM hoofd aan de macht van de laser.

Stel een camera in voor de microscoopdetector om het laserlicht op een monitor of tv-scherm te visualiseren. Geleid door de microscoop, plaats de laser zo dat deze op de cantilevertip wordt geleid. Zodra het monster klaar is, spoel 10 microliter van de experimentbuffer naar elke poort van de sonde holding cel.

Decanteer ongeveer 40 microliter vloeistof uit de monsterschuif en voeg 40 microliter buffer toe. Begin ondertussen met het voorbereiden van de atoomkrachtmicroscoop voor de meting. Plaats eerst de glijbaan op de magneet boven de piëzomotor.

Bevestig dat de AFM-fase zich in de verhoogde positie bevindt en plaats vervolgens het AFM-hoofd op het podium met de cantilever boven de monsterdruppel. Plaats vervolgens een klein stukje papier voor de AFM-fotodiode. Pas de laser aan totdat de plek op het papier helder en gefocust is en verwijder het papier.

Start de AFM-software om het signaal van de fotodiode te bekijken. Pas de AFM-hoofdspiegel zo aan dat het lasersignaal in alle vier de fotodiodekwadranten wordt gemaximaliseerd en een ander signaal tussen de bovenste en onderste kwadrantparen nul is. Om te beginnen met het kalibreren van de AFM, zet u de filterinstelling voor het AFM-hoofdsignaal in de volledige bandbreedte en zorgt u ervoor dat de piëzo is uitgeschakeld.

Meet in de AFM-software het gemiddelde van 512 berekeningen van het vermogensspectrum, met 1.024 datapunten per berekening. Integreer de stroomspectrale dichtheid over de eerste piek, die overeenkomt met de belangrijkste trillingsmodus voor de cantilever. Schakel vervolgens de piëzocontroller in en stel het filter in op 500 Hertz.

Beweeg de AFM-kop snel een paar honderd micrometer naar beneden terwijl het verschillende signaal wordt bewaakt. Blijf het hoofd naar beneden een paar honderd micrometer per keer tijdens het kijken naar consistente sprongen in het verschillende signaal. Wanneer de signaalsprongen in hoogte beginnen te stijgen, ligt de punt zeer dicht bij het monsteroppervlak.

Zodra het afbuigingssignaal verzadigt bij tipcontact met het oppervlak, hef de kop iets op en pas de piëzospanning aan om het AFM-hoofd met 100 tot 5.000 nanometer omhoog of omlaag te bewegen om het monsteroppervlak te vinden. Daarna voert u een trekexperiment uit met een scangrootte van ongeveer 500 nanometer, zodat de tip contact maakt met het oppervlak, of ongeveer 100 nanometer piëzomotorenreizen. Gebruik de resultaten om de veerconstante en gevoeligheid te berekenen.

Stel in de software de scangrootte in op 40% groter dan de totale theoretische grootte van de zich ontvouwende polyproteïne. Plaats de cantilever zo dat het 80% van de scangrootte uit de buurt van het oppervlak is. Stel de scansnelheid in op 300 nanometer per seconde.

Voer een trekkend experiment uit en meet de resulterende piëzopositie en het fotodiodesignaal. Voeg gedurende de hele meting elk experimentbuffer toe aan de vloeistofcel om te voorkomen dat het monster uitdroogt. De zich ontvouwende gebeurtenissen in opnames van een I91 polyproteïne en van een polyproteïne waarin drie I91-domeinen het NI10C-molecuul aan elke kant flankeerden, werden voorzien van een wormachtig kettingmodel.

Beide opnames tonen de karakteristieke kracht en contourlengtestappen van I91, wat aangeeft dat de AFM-kalibratie succesvol was. De opnames van het polyproteïne met het N110C molecuul toonden genoeg I91-gebeurtenissen om te bevestigen dat de nieuwe gebeurtenissen afkomstig waren van het eiwit van belang dat zich ontvouwde. De gemiddelde contourlengte voor de ankyrin herhaling was ongeveer 10,5 nanometer, en de ontvouwende krachten waren tussen de acht en 25 piconewtons.

Het is essentieel om een polyproteïne te gebruiken omdat de zich ontvouwende gebeurtenissen van de flankerende eiwitten een positieve controle bieden om de enkele molecuulgebeurtenis te nemen. Zonder dit kunnen de gegevens verkeerd worden geïnterpreteerd.