Snelle magnetische microbead-methode voor efficiënte zuivering van neutrofielen met lage dichtheid
11 november 2025
Neutrofielen met lage dichtheid (LDN) nemen aanzienlijk toe bij verschillende ziekten. LDN worden meestal geïsoleerd door middel van celsortering. We presenteren een praktische methode om zuiver en levensvatbaar LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed worden cellen geïncubeerd met magnetische microbeads en vervolgens wordt LDN gescheiden door magnetische kolommen.
We bestuderen laagdichtheidsneutrofielen binnen perifere bloed mononucleaire cellen om hun functies te karakteriseren en zo hun rol in verschillende ziekten te definiëren. Neutrofielen met lage dichtheid zijn zeldzaam in gezond bloed, maar nemen aanzienlijk toe bij ziekten zoals systemische lupus erythematosus en kanker. Om te beginnen voeg je 10 eenheden heparine per milliliter toe als antistollingsmiddel aan een 15-milliliter conische centrifugebuis.
Voeg dan twee milliliter 6% T500 toe in PBS. Neem 10 milliliter bloed af van een gezonde volwassen vrijwilliger door venipunctie. Voeg in een andere verse 15-milliliter centrifugebuis vijf milliliter dichtheidsgradiëntmedium toe.
Pipetteer voorzichtig het plasma zonder de erytrocyten aan te raken en leg het bovenop het medium om twee aparte fasen te vormen. Centrifugeer de buis op 516 g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Om PBMC's te isoleren, aspireer en verwijder je het plasma boven de PBMC-band zonder de cellen te verstoren.
Verzamel de mononucleaire celband tussen het plasma en het medium, waardoor de verzameling van het medium wordt geminimaliseerd. Voeg 20 milliliter PBS toe aan de buis met PBMC's, en centrifugeer dan op 400 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Zuig voorzichtig het supernatant eruit en schraap de buis om de pellet te scheiden.
Voeg 10 milliliter koude PBS toe om de cellen opnieuw te laten suspensjoneren. Om neutrofielen te isoleren, schraap je de buis om de cellen te scheiden nadat je het medium hebt gepipetteerd. Voeg dan 10 milliliter koude PBS toe.
Breng de cellen nu over in een verse 50-milliliter conische centrifugebuis en centrifuge. Aspiraat het supernatant en schraap de buis opnieuw. Pipetteer nu 10 milliliter koude hypotone oplossing in de buis en meng voorzichtig.
Meng voorzichtig precies één minuut. Voeg snel 10 milliliter koude hypertonische oplossing toe om de oplossing isotoon te maken. Vervolgens tellen de neutrofielen met behulp van een Neubauer-kamer en zorgen dat de zuiverheid groter is dan 95%; centrifugeer de suspensie om een celpellet te verkrijgen.
Daarna doe je de pellet opnieuw in koude PBS. Centrifugeer de perifere bloed mononucleaire cellen op 400 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van het supernatant worden de cellen opnieuw opgehangen in 120 microliter koudewasbuffer.
Daarna pipetten ze 35 microliter CD66b magnetische microkorrels naar de celsuspensie. Breng het mengsel 30 minuten in het donker uit bij vier graden Celsius. Pipetteer nu één milliliter cold wash buffer naar de buis.
Centrifugeer de buis op 400 g gedurende drie minuten. Schraap de buis om de celpellet te scheiden nadat je het supernatant hebt verwijderd. En de cellen opnieuw ophangen in één milliliter wash-buffer.
Plaats een magnetische scheidingskolom op een magneet. Voeg 0,5 milliliter wash buffer toe aan de kolom, zodat deze volledig kan passeren. Breng één milliliter van de resuspendeerde cellen over op de kolom en laat de buffer druppel voor druppel passeren.
Na het wassen plaats je de kolom in een microcentrifugebuis. Pipetteer dan één milliliter washbuffer in de kolom. Plaats nu de zuiger bovenop de kolom.
Oefen voorzichtig druk uit om de cellen te elueren. Verwijder vervolgens de zuiger en plaats de kolom op een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg nog een milliliter wash buffer toe aan de kolom.
Steek dan de zuiger weer in en oefen voorzichtig druk uit om de resterende cellen te elueren. Centrifugeer beide microcentrifugebuizen op 800 g gedurende drie minuten. Susseer de celpellets uit beide buisjes opnieuw in één milliliter koude PBS.
Houd de celsuspensie op ijs. Sussen de gezuiverde cellen opnieuw in een labelingsbuffer gemaakt van 1% foetaal rundserum in PBS. Breng 250 microliter van de suspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.
Voeg de bijbehorende antilichamen tegen neutrofielmembraanmoleculen toe aan de buis. Daarna incubeer je de cellen 30 minuten op vier graden Celsius, beschermd tegen licht. Pipetteer nu één milliliter PBS naar de buis.
Draai de buis drie minuten in een microcentrifuge op 800 g. Aspireer het supernatant eruit. Tik op de buis om de pellet te breken.
En de cellen opnieuw opschorsen in 0,5 milliliter van 1% paraformaldehyde. Houd de cellen vervolgens op vier graden Celsius, beschermd tegen licht tot analyse met flowcytometrie. Analyseer de monsters met behulp van flowcytometrie en vang 10.000 gebeurtenissen per monster vast.
Neutrofielen met lage dichtheid bij gezonde personen vertegenwoordigden ongeveer 5% van de perifere mononucleaire cellen in het bloed, terwijl het beschreven magnetische isolatieprotocol laag-dichtheid neutrofielen opleverde bij ongeveer 98% herstel. Neutrofielen drukken de membraanmarkers CD10, CD11b, CD15, CD62L en CD66b tot expressie. Magnetisch gezuiverde neutrofielen met lage dichtheid drukten dezelfde membraanmarkers uit als neutrofielen.
Gezuiverde neutrofielen met lage dichtheid vertoonden een multilobulaire kern en waren qua grootte vergelijkbaar met neutrofilen. Zowel neutrofielen als laagdichtheidsneutrofielen genereerden reactieve zuurstofsoorten als reactie op PMA-stimulatie, waarbij laagdichtheidsneutrofielen hogere niveaus produceren dan neutrofielen. Neutrofielen met lage dichtheid gaven neutrofiele extracellulaire vallen af als reactie op PMA-stimulatie, zoals blijkt uit colocalisatie van DNA met elastase en met citrulline.
Zowel gezuiverde neutrofielen als laagdichtheidsneutrofielen gaven na PMA-behandeling NETs af met vergelijkbare kinetiek en hoeveelheden. Ons protocol biedt een snelle en reproduceerbare manier om zeer zuivere en functionele neutrofielen met lage dichtheid te verkrijgen. We pakken het ontbreken van een gestandaardiseerd, tijdefficiënt protocol aan voor de isolatie van laagdichtheidsneutrofielen uit menselijk bloed.
Dit protocol vereist geen speciale training voor complexe instrumenten en is bovendien economischer en sneller dan FACS.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op lagedichtheidsneutrofielen (LDN) die worden aangetroffen in mononucleaire cellen uit perifeer bloed, die zeldzaam zijn bij gezonde individuen maar significant toenemen bij verschillende ziekten. Het artikel presenteert een praktische methode voor het isoleren van zuivere en levensvatbare LDN door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugering en magnetische scheidingstechnieken.
Belangrijkste Studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Lagedichtheidsneutrofielen worden geassocieerd met ziekten zoals systemische lupus erythematodes en kanker.
- Het begrijpen van LDN kan inzicht bieden in hun rol in ziektemechanismen.
- Isolatie van LDN is cruciaal voor het bestuderen van hun functies en therapeutisch potentieel.
- Huidige methoden voor LDN-isolatie leveren mogelijk niet zuivere en levensvatbare cellen op.
Doel van het onderzoek
- Om de functies van lagedichtheidsneutrofielen te karakteriseren.
- Om de rol van LDN bij verschillende ziekten te definiëren.
- Om een efficiënte methode te presenteren voor het isoleren van LDN uit perifeer bloed.
Gebruikte methoden
- Gebruik van heparine als anticoagulans bij bloedafname.
- Toepassing van dextran T500 voor dichtheidsgradiëntscheiding.
- Magnetische microbead-incubatie voor celsortering.
- Scheiding van LDN met behulp van magnetische kolommen.
Belangrijkste resultaten
- De methode isoleert met succes zuivere en levensvatbare lagedichtheidsneutrofielen.
- LDN kunnen worden gekarakteriseerd op hun functionele rollen bij ziekte.
- Verhoogd begrip van LDN kan leiden tot betere therapeutische strategieën.
- De isolatietechniek kan worden toegepast in verschillende onderzoeksomgevingen.
Conclusies
- Het isoleren van LDN is essentieel voor het bestuderen van hun impact op gezondheid en ziekte.
- De gepresenteerde methode verbetert de zuiverheid en levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen.
- Verder onderzoek naar LDN kan bijdragen aan vorderingen in immunologie en therapeutische benaderingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of low-density neutrophils (LDN) addresses a critical bottleneck in immunology-focused drug discovery, enabling robust functional studies of disease-associated neutrophil subpopulations. This rapid magnetic-microbead method delivers high-purity, viable LDN, supporting mechanistic de-risking and target validation in autoimmune, oncology, and infectious disease pipelines. Scalable, reproducible LDN purification enhances predictive confidence for translational biomarker and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LDN-mediated disease mechanisms and immune pathway clarification.
- Supports biological de-risking by isolating functionally intact LDN for hypothesis testing.
- Facilitates target validation by providing pure cell populations for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated LDN samples for quantitative flow cytometry and functional assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through high-purity cell isolation.
- Accelerates screening readiness by reducing isolation time and preserving cell viability.
Translational & Preclinical Research
- Enables disease-relevant functional studies of LDN in autoimmune, cancer, and infection models.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing scalable LDN yields.
- Facilitates omics and biomarker analyses aligned with translational research objectives.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, reproducible LDN isolation for mechanistic studies, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and immune pathway analysis using purified LDN.
- Screening: Delivers standardized, viable LDN for quantitative flow cytometry and functional readouts.
- Analytics: Supports robust measurement of LDN marker expression and functional outputs such as ROS and NET formation.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease model development by enabling scalable LDN purification.
- Enterprise Reuse: Offers a reproducible, time-efficient protocol adaptable across disease areas and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell studies.
- Operational Value: Standardizes LDN isolation, improving reproducibility and scalability for high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and translational biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires basic cell biology expertise and standard laboratory instrumentation.
- Utilizes magnetic separation columns and flow cytometry for validation.
- Enables cross-team standardization due to protocol simplicity and reproducibility.
- Adaptable to various disease models and sample volumes for scalable studies.
- Limited by the need for specific antibodies and magnetic bead reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Neutrophils from Human Blood
2:55
Purification of Low-Density Neutrophils (LDNs) Using Magnetic Microbeads
4:59
Multicolor Flow Cytometry Staining and Analysis of Purified Neutrophils
6:13
Results
7:43
Conclusion
