Name: Neutrofielen Isolatie Protocol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Leer een betrouwbaar protocol voor het isoleren van neutrofielen uit menselijk bloed met dichtheidsgradiëntscheiding. Deze gestandaardiseerde methode verbetert de reproduceerbaarheid van immunologisch onderzoek naar ontstekingsreacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De financiering van NIH R01 HL56621.

Neutrofielen Isolatie Protocol <ol><li> Breng alle reagentia op kamertemperatuur. </li><li> Verzamel 5,0 ml van neutrofielen isolatie media in centrifugebuis. Voorzichtig laagje 5,0 ml bloed over de scheiding media. Voer deze stap langzaam en voorzichtig, en met de pipet tip dicht bij de oppervlakte van de media om te voorkomen dat het mengen van het bloed en de media. </li><li> Centrifugeer op 500 RCF gedurende 35 min bij 20-25 ° C. Het bloed op moet scheiden in 6 verschillende bands: plasma, monocyten, isolatie media, neutrofielen, meer isolatie media, en de rode bloedcellen pellet (figuur 1). Als deze banden niet duidelijk zijn, was het scheidingsproces niet schoon en zal moeten worden herhaald. </li><li> Verwijder voorzichtig de bovenste drie lagen (plasma, monocyten en isolatie media) met een pipet. Bied deze lagen. </li><li> Voorzichtig pipet de laag van neutrofielen en alle media de isolatie onder de neutrofielen. Plaats de oplossing in een schone centrifugebuis. </li><li> Verdun de neutrofiel oplossing tot 10 ml met HBSS zonder Ca 2 + / Mg 2 +. Omkeren van de buis een paar keer om de cellen te schorten. </li><li> Centrifugeer de neutrofiele oplossing bij 350 RCF gedurende 10 minuten. Een rode pellet moet aanwezig zijn bij de bodem van de buis, met neutrofielen en resterende rode bloedcellen (RBC). Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet voorzichtig, zodat de pellet niet wordt verstoord. </li><li> Om lyse de resterende rode bloedcellen, voeg 2 ml Red Cell Lysis Buffer naar de buis. Om resuspendeer de pellet, vortex de flacon in een instelling van 3-4. Voorkomen dat de vortex instelling boven de 4, omdat dit kan leiden tot de neutrofielen te activeren. Het kan nodig zijn om vortex te zijn voor enkele seconden, of naar &quot;Pulse&quot; van de vortex naar de pellet te ontbinden. </li><li> Centrifugeer de buis bij 250 RCF gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet. Herhaal het lyserende proces indien nodig. </li><li> Voeg 500 ul HBSS zonder Ca 2 + / Mg 2 + aan elke buis. Nogmaals, vortex naar de pellet opnieuw in suspensie in een instelling van 3-4. Verdunnen tot 10 ml met HBSS zonder Ca 2 + / Mg 2 +. </li><li> Centrifugeer de buizen op 250 RCF gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant af en gooi. </li><li> Resuspendeer de pellet in 250 ul HBSS / HSA Oplossing (2% HSA). Cellen kunnen dan worden geteld en aangepast aan de gewenste concentratie. </li></ol>

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

De dichtheid gradiënt scheiding methode wordt gebruikt om de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met een mengsel van natrium-metrizoate en Dextran 500. Deze methode is gebaseerd op de mononucleaire leukocyten scheiding methode Boyum (1968), die was voor neutrofielen scheiding gewijzigd door Ferrante en Thong (1980). Na het verzamelen van een donor, kan volledig bloed worden antistolling met EDTA, citraat of heparine. Omdat ze van korte duur, moet neutrofielen worden gebruikt binnen 2-4 uur van de collectie. De procedure be...

<table><tbody><tr><td>Lymphocyte Poly(R)</td><td>Reagens</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>PolymorphprepTM kan als alternatief worden gebruikt</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s gebalanceerde zoutoplossing zonder calciumchloride</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humaan serumalbumine</td><td>Reagens</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rode bloedcel lysisbuffer</td><td>Reagens</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten en zuigballon</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>Reagens</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>Alternatief reagens voor Lymphocyte-Poly (R)</td></tr><tr><td>Spuitfilter</td><td>Overig</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0.22 &amp;#x03BC;m, PVDF, 33 mm, gamma-steriliseerbaar</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s gebalanceerde zoutoplossing met calciumchloride</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neutrofielen isolatie protocol

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrofiele granulocyten polymorfonucleaire (PMN) zijn de meest voorkomende leukocyten bij mensen en bij de eerste cellen aan te komen op de site van inflammatoire immuunrespons. Vanwege hun belangrijke rol in ontstekingen, zijn neutrofielen functies zoals motoriek, cytokine productie, fagocytose, en de tumorcel te bestrijden uitgebreid bestudeerd. Te bepalen wat de specifieke functies van neutrofielen, een schone, snelle en betrouwbare methode om ze te scheiden van andere bloedcellen is wenselijk voor in-vitro-studies, vooral omdat neutrofielen zijn van korte duur en moet worden gebruikt binnen 2-4 uur van de collectie. Hier tonen we een standaard dichtheidsgradiënt scheidingsmethode voor de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met in de handel verkrijgbaar scheiding media dat is een mengsel van natrium-metrizoate en Dextran 500. De procedure bestaat uit lagen volbloed op de dichtheidsgradiënt medium, centrifugeren, scheiding van neutrofielen laag, en lysis van erytrocyten rest. Cellen worden vervolgens gewassen, geteld, en opnieuw gesuspendeerd in buffer tot de gewenste concentratie. Bij het correct wordt uitgevoerd, is deze methode is aangetoond dat monsters van&gt; 95% neutrofielen met&gt; 95% levensvatbaarheid opbrengst.

Neutrofielen behoren tot de eerste cellen aan te komen op de site van inflammatoire immuunrespons, en hun functies en mechanismen zijn uitgebreid bestudeerd in vitro. Demonstreren we een standaard dichtheidsgradiënt scheidingsmethode voor de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met in de handel verkrijgbaar scheiding media.

Neutrofielen Isolatie Protocol

Neutrofiele polymorfnucleaire granulocyten (PMN) zijn de meest voorkomende leukocyten bij mensen en behoren tot de eerste cellen die arriveren op de plaats van een ontsteking ...

Protocol voor de isolatie van neutrofielen. Deze procedure wordt gebruikt om witte bloedcellen uit een volbloedmonster te extraheren met behulp van een centrifuge en buisjes. Vortexmixer, naald en spuit, spuitenfilter.Materialen van het merk Milli Pore MX gv 0,22 micrometer. De scheiding van neutrofielen met Hanks gebalanceerde zoutoplossing vereist twee soorten HBSS-oplossingen. HBSS met calciumchloride wordt gebruikt om een oplossing met humaan serumalbumine te maken.HBSS zonder calciumchloride wordt gebruikt om de neutrofielen te suspenderen en te wassen. Let er specifiek op dat de juiste HBSS-oplossing bij deze procedure wordt gebruikt. Humane serumalbumine of HSA is een eiwit in het bloedplasma dat de pH en de osmotische druk handhaaft.Gebruik geen bovine serum amalgamate red cell lysis buffer. Deze wordt geproduceerd door Roche Diagnostics, neutrophil Isolation Media NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly separation media; bescherm tegen licht en bewaar in de koelkast voor het beste resultaat. Alle reagentia moeten op kamertemperatuur zijn op het moment van gebruik.Haal de reagentia één uur voor het experiment uit de koelkast. Bereid de H-B-S-S-H-S-A-oplossing voor voor de sche

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates an in vitro assay to study neutrophil-biofilm interaction. The pathogenic bacteria embedded in the biofilm and isolated neutrophils were tagged using fluorescent labels, and the immune response by the neutrophils and the evasion of the immune response by the bacteria were assessed using a fluorescence microscope.

An In Vitro Assay to Study the Interaction between Neutrophils and Biofilm

This video demonstrates the induction and visualization of neutrophil extracellular traps or NETs in pre-labeled neutrophils using patient serum containing anti-neutrophil cytoplasmic antibodies. Furthermore, using an impermeable DNA dye and fluorescence microscopy enables the visualization of NETs.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

In de onderstaande voorschriften beschrijven we een zeer eenvoudige manier om neutrofielen extracellulaire vallen (NET) uit humaan totaal bloed met gemakkelijk beschikbare reagentia isoleren. Wij dan tonen hoe de geïsoleerde netten kunnen worden gebruikt in een in vitro adhesietest met kankercellen.

Vereenvoudigde Human Neutrophil Extracellular traps (NET) Isolatie en Handling

Neutrofielen spelen niet alleen een belangrijke rol bij de verdediging van het gastheerlichaam tegen binnendringende micro-organismen, maar zijn ook betrokken bij de immuunbewaking van tumorcellen. Hier beschrijven we technieken met betrekking tot de isolatie van neutrofielen met anti-tumoreigenschappen en methoden voor het monitoren van anti-tumor neutrofielen functie in vitro en in vivo.

Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

Neutrofielen zijn het meest voorkomende type witte bloedcellen. Hier worden de isolatie van neutrofielen uit menselijk bloed door middel van dichtheidsgradiëntscheiding en de differentiatie van menselijke promyelocytische (HL60) cellen langs de granulocytische route beschreven; om hun rol in de gevoeligheid van lymfoomcellen voor anti-lymfoom middelen te testen.

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

We beschrijven hier een werkwijze voor het verkrijgen en identificeren van een nieuw kenmerk subpopulatie van neutrofielen afgeleide reus fagocyten. Deze cellen ontwikkelen in de cultuur van verse menselijk bloed neutrofielen, en worden gekenmerkt door fagocytose, autofagie, immens groot formaat, en verlengde levensduur. Deze methode is van essentieel belang om verder te onderzoeken deze unieke neutrofielen afgeleid subpopulatie.

Ontwikkeling en Identificatie van een nieuw subpopulatie van Human neutrofielen afgeleide Giant Fagocyten In Vitro

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en het bedienen van NETQUANT, een volautomatische software optie voor het kwantificeren van netten in immunofluorescentie beelden.

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van neutrofielen uit volbloed, buffy coats of leukaferesemembranen, het bereiken van een goede opbrengst, hoge zuiverheid en minimale celactivering. We maken gebruik van gradiëntzuivering, rode bloedcel (RBC) sedimentatie en RBC-lysis om een hoogwaardig / zuiver neutrofielenpreparaat te verkrijgen.

Isolatie van menselijke neutrofielen van volbloed en buffy jassen

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Hier bieden we een betrouwbare benadering voor het isoleren van neutrofielen met een lage en normale dichtheid uit volbloed met behulp van magnetische isolatie (negatieve selectie) en een discontinu dichtheidsgradiëntmedium. Het zorgt voor ongerepte isolatie van cellen met een hoge zuiverheid (≥93%), waardoor een nauwkeurige stroomafwaartse analyse van neutrofielensubpopulaties mogelijk is, cruciaal voor het begrijpen van hun rol in gezondheid en ziekte.

De isolatie en karakterisering van neutrofielen met een lage en normale dichtheid uit volbloed

Neutrofielen met lage dichtheid (LDN) nemen aanzienlijk toe bij verschillende ziekten. LDN worden meestal geïsoleerd door middel van celsortering. We presenteren een praktische methode om zuiver en levensvatbaar LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed worden cellen geïncubeerd met magnetische microbeads en vervolgens wordt LDN gescheiden door magnetische kolommen.

Snelle magnetische microbead-methode voor efficiënte zuivering van neutrofielen met lage dichtheid

Leer een betrouwbaar protocol voor het isoleren van neutrofielen uit menselijk bloed met dichtheidsgradiëntscheiding. Deze gestandaardiseerde methode verbetert de reproduceerbaarheid van immunologisch onderzoek naar ontstekingsreacties.

Neutrofielen Isolatie Protocol

Meer video's verkennen