Neutrofielen Isolatie Protocol
July 23rd, 2008
Neutrofielen behoren tot de eerste cellen aan te komen op de site van inflammatoire immuunrespons, en hun functies en mechanismen zijn uitgebreid bestudeerd in vitro. Demonstreren we een standaard dichtheidsgradiënt scheidingsmethode voor de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met in de handel verkrijgbaar scheiding media.
Neutrofiel isolatieprotocol. Deze procedure zal witte bloedcellen extraheren uit een hele bloedmonster centrifuge-apparatuur en flesjes. Vortex sir needle en spuit spuitfilter.
Milli pour merk MX gv 0,22 Micrometer materialen. Hank spell en zout oplossing neutrofielscheiding vereist twee soorten HBSS oplossingen. HBSS met calciumchloride zal worden gebruikt om een oplossing met humaan serumalbumine te maken.
HBSS zonder calciumchloride zal worden gebruikt om de neutrofielen op te schorsen en te wassen. Zorg ervoor dat u in deze procedure de juiste HBSS-oplossing gebruikt. Humaan serumalbumine of HSA is een eiwit in het bloedplasma dat de pH en SMO-druk handhaaft.
Gebruik geen bovien serum amalgamaat rood cellys buffer. Dit wordt vervaardigd door Roche Diagnostics, neutrofiel isolatie media NIM Cedar Line Labs Lymph licht Poly scheidingsmedia beschermd tegen licht en bewaard in de koelkast voor de beste resultaten. Alle reagentia moeten op kamertemperatuur zijn op het moment van gebruik.
Verwijder reagentia een uur voor het experiment uit de koelkast. Bereid H-B-S-S-H-S-A-oplossing voor voor neutrofielscheiding. Pipette HBSS met calciumchloride in het flesje.
Trek HSA in de spuit. Vermijd het opvangen van luchtbellen. Verwijder de naald van de spuit en vervang deze door de filter.
Injecteer HSA door de filter in HBSS flesje vortex twee meng wanneer u uw andere materialen klaar hebt en op kamertemperatuur, verzamel ongeveer 15 milliliter van het hele bloed. Dit zal 10 tot 15 milliliter van 10 tot de achtste neutrofielen opleveren. De donor mag geen alcohol of vrij verkrijgbare medicijnen hebben geconsumeerd gedurende 24 uur voorafgaand aan het doneren van het bloedmonster.
Deze kunnen het scheidingsproces verstoren. Het hele bloed kan worden anticoaguleerd met EDTA-citraat of heparine door negen delen bloed toe te voegen aan één deel K drie EDTA natriumcitraat of heparine volgens de instructies van de fabrikant. De volgende stappen worden in deze procedure beschreven.
Scheiden en verwijder plasma en monocyten. Scheid en verzamel een neutrofiel laag door rode bloedcellen te lyzeren, suspendeer neutrofielen eerst scheiding. Verzamel neutrofielen in NIM laag.
Verzamel vijf milliliter isolatiemedia in centrifugeerbuis. Het plaatsen van het isolatiemedia lager in de buis laat het fungeren als een filter, omdat de centrifuge het bloed ervoor zal zorgen dat het voorzichtig erdoorheen gaat. Laag vijf milliliter bloed over de NIM voor schone scheiding.
Wees zeer voorzichtig om de oplossingen niet te mengen. Voer deze stap langzaam en zorgvuldig uit en met uw pipettenpunt dicht bij het oppervlak van het scheidingsmedia om mengen te voorkomen centrifugeer. De oplossing bij 500 RCF gedurende 35 minuten.
Bij 20 tot 25 graden Celsius zou het bloed zich moeten scheiden in zes verschillende banden. De zes banden zijn plasma monocyten, isolatiemedia, neutrofielen, meer isolatiemedia en de rode bloedcel pellet op de bodem. Als deze zes banden niet duidelijk en verschillend zijn, was de scheidingsproces niet schoon en zou deze moeten worden herhaald.
Vaak voorkomende oorzaken van slechte scheiding zijn oud isolatiemedia donatie die alcohol heeft geconsumeerd in de afgelopen 72 uur of donor die andere medicijnen zoals Tylenol of aspirine heeft geconsumeerd. Verwijder en gooi voorzichtig de plasma monocyten en isolatiemedia weg. Plaats deze lagen in een afsluitbare buis en gooi voorzichtig de laag neutrofielen en al het isolatiemedia onder de neutrofielen weg in een schone centrifugeerfile om zoveel mogelijk neutrofielen te herstellen.
Het is vaak het gemakkelijkst om ook wat van het isolatiemedia van de onderlaag mee te nemen. Verontrust de pallet aan de bodem niet. Tweede verklaring, verfijn neutrofiel laag.
Verdun de neutrofiel oplossing tot 10 milliliter met HBSS zonder calcium. Draai de buis een paar keer om de cellen te suspenderen centrifuge. De neutrofiel oplossing.
350 RCF gedurende 10 minuten. Bij 20 tot 25 graden Celsius zou er een rode pellet aanwezig moeten zijn op de bodem van de buis die neutrofielen en resterende rode bloedcellen bevat. Verwijder de supra natin met de pipet.
Wees voorzichtig. om de pellet aan de bodem te verstoren. Lyzeren van de rode bloedcellen.
De rode bloedcellen in het monster moeten nu worden vernietigd door lysis. Om de resterende rode bloedcellen te lyseren, voeg twee milliliter rode cel lysis buffer toe aan de buis om resus te maken. Suspendeer de pellet vortex de fles op een instelling van drie tot vier.
Vermijd het verhogen van de vortex instelling boven vier omdat dit kan leiden tot activering van de neutrofielen. Het kan nodig zijn om enkele seconden te vortex of om de vortex te pulseren om de smaak te verdrijven. Centrifugeer de lysis oplossing bij 250 RCF gedurende vijf minuten.
Gebruik de soft start optie om schade aan het monster te minimaliseren. Verwijder de supra natin met de pipet. Herhaal het lyse proces.
Indien nodig, vrijgeven van suspensie van neutrofielen, voeg 500 microliter HBSS zonder calcium toe aan elke buis. Vortex de pellet op een instelling van drie tot vier, verdun tot 10 milliliter met HPSS zonder calcium centrifuge. De neutrofielen bij 250 RCF gedurende vijf minuten aspireer de snat en gooi weg.
Herstel de pellet in 250 microliter HBSS met HSA oplossing, twee keer 10 tot de zes. Neutrofielen per milliliter worden typisch verzameld.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren van humane neutrofielen uit vol bloed met behulp van een standaard dichtheidsgradiëntscheidingstechniek. Neutrofielen spelen een cruciale rol in de inflammatoire immuunrespons, en het begrijpen van hun isolatie is essentieel voor verder onderzoek.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Neurowetenschap
Achtergrond
- Neutrofielen behoren tot de eerste responders bij inflammatoire reacties.
- Hun functies en mechanismen zijn uitgebreid bestudeerd in vitro.
- Isolatietechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van neutrofielgedrag en functies.
- Gestandaardiseerde methoden verbeteren de reproduceerbaarheid in onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te demonstreren voor het isoleren van neutrofielen uit menselijk bloed.
- Om verder onderzoek naar neutrofielfuncties bij ontstekingen te faciliteren.
- Om een protocol te bieden dat gemakkelijk in laboratoria kan worden overgenomen.
Gebruikte methoden
- Dichtheidsgradiëntscheidingsmethode.
- Gebruik van commercieel verkrijgbare scheidingsmedia.
- Apparatuur omvat centrifuge en flesjes.
- Bereiding van oplossingen met behulp van HBSS met calciumchloride en humaan serumalbumine.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van neutrofielen uit vol bloedmonsters.
- Demonstratie van de effectiviteit van de scheidingsmethode.
- Verschaffing van een duidelijk protocol voor onderzoekers.
- Mogelijke toepassingen in het bestuderen van neutrofielgedrag onder verschillende omstandigheden.
Conclusies
- De gepresenteerde methode is effectief voor neutrofielisolatie.
- Dit protocol kan onderzoek naar immuunresponsen verbeteren.
- Verdere studies kunnen voortbouwen op deze isolatietechniek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reliable neutrophil isolation is foundational for early-stage immunology and inflammation research, enabling precise functional studies and mechanistic de-risking in drug discovery. High-purity, high-viability neutrophil preparations support robust target validation and quantitative assay development, directly impacting predictive confidence at key portfolio inflection points. Standardized isolation protocols facilitate reproducibility and cross-functional data integration across discovery and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neutrophil-specific pathways and immune mechanisms relevant to inflammation and oncology.
- Supports functional target validation by providing pure, viable neutrophil populations for downstream assays.
- Reduces biological ambiguity, strengthening predictive confidence in early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability neutrophil samples for reproducible in vitro assays.
- Facilitates quantitative measurement of neutrophil functions such as phagocytosis and cytokine production.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular material for modeling inflammatory responses in preclinical systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell function and viability.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling functional readouts in human immune cells.
Pipeline & Workflow Integration
This density gradient neutrophil isolation protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supplies pure neutrophils for hypothesis-driven functional studies and pathway analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell-based assay inputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of cell viability, purity, and functional outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models using primary human immune cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across multiple research programs and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in immune cell studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of neutrophil-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of inflammation and immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in density gradient separation and cell handling.
- Needs access to centrifugation equipment, sterile reagents, and validated separation media.
- Demands strict adherence to timing and temperature controls to preserve cell viability.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible outputs across studies.
- Limited by donor variability and short neutrophil lifespan, requiring rapid downstream use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
