Metoda ELISA

Test ELISA, czyli enzymatyczny test immunosorpcyjny, jest powszechnie stosowaną metodą określania obecności lub braku specyficznego białka docelowego.

Poprzez serię etapów płukania i wiązania przeciwciało sprzężone z enzymem rozpoznaje białko docelowe znajdujące się na dnie płytki 96-dołkowej. Po dodaniu substratu do próbki zachodzi reakcja enzymatyczna, która powoduje zmianę barwy, umożliwiając identyfikację i ilościowe oznaczenie białka docelowego.

Zanim przejdziemy do omówienia sposobu przeprowadzenia testu ELISA, zapoznajmy się z niezbędnym sprzętem i odczynnikami.

Reakcja ELISA jest zazwyczaj przeprowadzana w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem. Płaskie dno dołków ułatwia równomierne rozłożenie próbki badawczej, a także przeciwciał wychwytujących i detekcyjnych.

Testy ELISA wykrywają obecność specyficznych białek docelowych w wodnych roztworach badawczych. Typowymi próbkami eksperymentalnymi są mocz, pożywki do hodowli komórkowych oraz surowica.

W teście ELISA przeciwciało, które wiąże się bezpośrednio z białkiem docelowym, jest przeciwciałem pierwotnym. Charakteryzuje się ono wysokim powinowactwem, czyli wysoką zdolnością do silnego wiązania z epitopem – specyficznym regionem białka docelowego. Przeciwciało pierwotne jest zazwyczaj nieoznaczone, czyli nieukonjugowane.

Jak wspomniano, przeciwciała wiążą się z białkami docelowymi głównie poprzez wysokopowinowate wiązanie ze specyficznym epitopem. Jednak próbka badawcza może zawierać fragmenty komórek wykazujące niespecyficzne miejsca wiązania – miejsca, które mogą wiązać stały, czyli niespecyficzny dla epitopu, region przeciwciał detekcyjnych.

Dlatego w teście ELISA niezbędne jest dodanie buforu blokującego, aby zająć wszelkie niespecyficzne miejsca wiązania w próbkach badawczych. W przeciwnym razie w dołkach, które nie zawierają białka docelowego, mogą zachodzić reakcje enzymatyczne, co doprowadzi do uzyskania wyników fałszywie dodatnich!

Przeciwciało wtórne w teście ELISA to przeciwciało służące do rozpoznawania przeciwciała pierwotnego. Jest ono zazwyczaj koniugowane z enzymem. Przeciwciała wtórne mają czasami specyficzne nazewnictwo. Na przykład, jeśli przeciwciało wtórne zostało wytworzone w osle w celu rozpoznania przeciwciała pierwotnego wytworzonego w kozie, zostanie ono nazwane przeciwciałem oslim anty-kozim. W nazewnictwie przeciwciał wtórnych pierwsza nazwa wskazuje organizm, który wytworzył przeciwciało wtórne, a druga nazwa reprezentuje organizm, który wytworzył przeciwciało pierwotne.

Niezbędny będzie również substrat, który wiąże się z centrum aktywnym enzymu połączonego z przeciwciałem wtórnym. Reakcja chemiczna zachodząca w tym procesie powoduje zmianę barwy pierwotnie bezbarwnego substratu. Ten tzw. pomiar kolorymetryczny umożliwia identyfikację i ilościowe oznaczenie obecności białka docelowego.

Reakcja enzymatyczna trwa tak długo, jak długo dostępny jest substrat. Dlatego po krótkim czasie inkubacji do dołków dodaje się roztwór stopujący, który powoduje kolejną zmianę barwy, sygnalizując faktyczne zatrzymanie reakcji.

Do ilościowego oznaczenia stężenia interesującego nas białka w każdym dołku zostanie użyty czytnik mikroplatek, który zmierzy absorbancję, czyli ilość kolorowego produktu w każdym dołku. Absorbancja jest proporcjonalna do ilości obecnego białka docelowego.

Skoro cały sprzęt jest już przygotowany, przeprowadźmy badanie ELISA!

Aby wykonać standardowy, czyli bezpośredni test ELISA, należy najpierw pokryć dołki płytki 96-dołkowej docelowym białkiem zainteresowania rozcieńczonym w buforze do pokrywania. W tym czasie należy nanieść również kontrolle pozytywne i negatywne.

Po inkubowaniu pokrytej płytki przez czas wystarczający, aby białko mogło całkowicie zaadsorbować się, czyli przyłączyć do dna płytki, zlej nadmiar roztworu do pokrywania szybkim ruchem nadgarstka.

Następnie zablokuj wszelkie możliwe niespecyficzne wiązania lub sygnał tła, inkubując każdy dołek w buforze blokującym.

Teraz zlej bufor blokujący i przemyj dołki, poddając je krótkiej inkubacji w temperaturze pokojowej w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, czyli PBS, oraz 1% BSA.

Podczas płukania dołków PBS-em, przygotuj rozcieńczenia białka docelowego o znanych stężeniach w celu stworzenia krzywej standardowej. Absorbancja dołków krzywej standardowej, zawierających znane stężenia białka docelowego, zostanie wykorzystana do obliczenia stężenia białka docelowego w dołkach z próbkami eksperymentalnymi na podstawie porównania absorbancji dołków z próbkami do absorbancji dołków krzywej standardowej.

Czas teraz dodać przeciwciało detekcyjne lub pierwotne!

Płytka jest następnie inkubowana, zazwyczaj w temperaturze pokojowej, aby umożliwić przyłączenie wystarczającej ilości przeciwciał do białka docelowego w celu jego późniejszej detekcji i kwantyfikacji.

Po tej inkubacji usuwa się nadmiar przeciwciał, a dołki są krótko płukane PBS-em.

Następnie do płytki dodaje się przeciwciało wtórne i ponownie poddaje ją inkubacji – zazwyczaj na platformie rotacyjnej – aby umożliwić przyłączenie przeciwciał wtórnych. Kroki płukania powtarza się w ten sam sposób co poprzednio.

Następnie dodaj do płytki substrat, aby sprawdzić, które dołki zawierają białko docelowe. Przykryj płytkę, aby chronić reakcję przed światłem, a po krótkiej inkubacji zatrzymaj reakcję za pomocą roztworu stopującego.

Na koniec umieść płytkę w czytniku mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję lub ilość zabarwionego roztworu w każdym dołku. Będziesz musiał wybrać, które dołki czytnik ma przeanalizować. Po zakończeniu odczytu płytki przez instrument wyświetlony zostanie odczyt absorbancji dla każdego dołka.

Ważne jest, aby zauważyć, że każdy zestaw ELISA ma granicę detekcji. Oznacza to, że dokładnie można określić jedynie stężenia białka mieszczące się w określonych granicach. Bardzo niskie stężenia białka są zazwyczaj zbyt zbliżone do poziomów tła barwienia niespecyficznego, natomiast bardzo wysokie stężenia mogą wskazywać na to, że nadmiar białka lub przeciwciał nie został prawidłowo wypłukany z dołka z próbką.

Dlaczego zatem warto przeprowadzić test ELISA? Przyjrzyjmy się kilku powszechnym zastosowaniom.

Prawdopodobnie najczęściej wykonywanym rodzajem testu ELISA jest ELISA kanapkowa (sandwich ELISA).

W metodzie ELISA kanapkowej płytka 96-dołkowa jest najpierw pokryta przeciwciałem pierwszorzędowym, które rozpoznaje docelowe białko.

W tym doświadczeniu pożywka z hodowli komórkowych pobrana z ludzkich linii komórkowych produkujących przeciwciała została naniosiona przez system zautomatyzowany na płytki 96-dołkowe uprzednio pokryte przeciwciałem pierwszorzędowym rozpoznającym ludzkie przeciwciała.

Po wypłukaniu nadmiaru próbki roztworem PBS dodaje się znakowane enzymatycznie przeciwciało wtórne, a następnie substrat kolorymetryczny.

Absorbancję mierzy się następnie w taki sam sposób, jak w typowym teście ELISA. Na przykład w tym doświadczeniu dane z testu ELISA zostaną wykorzystane do ustalenia, która z linii komórkowych produkuje ludzkie przeciwciało o najwyższym powinowactwie do swojego antygenu docelowego, czyli najlepiej i najdokładniej się z nim wiąże.

Dostępny w sprzedaży test ciążowy to jeden z rodzajów testu ELISA kanapkowej.

Gdy mocz potencjalnie ciężarnej kobiety zostanie dodany do testu, znakowane enzymatycznie przeciwciała pierwszorzędowe przytwierdzone do testu zwiążą hormon ciążowy hCG, jeśli jest on obecny. Jeśli kobieta jest w ciąży, w miejscu testu zajdzie reakcja substratowo-enzymatyczna, gdy przeciwciała pierwszorzędowe zostaną rozpoznane przez przeciwciała wtórne związane z substratem, i pojawi się kolorowa linia.

Innym rodzajem testu ELISA jest ELISA konkurencyjna, która może być stosowana do wykrywania obecności przeciwciał.

Jeśli w próbce znajdują się poszukiwane przeciwciała, zwiążą się one z białkiem docelowym przytwierdzonym do dna płytki. Później, po dodaniu do płytki znakowanych enzymatycznie przeciwciał detekcyjnych, przeciwciała te znajdą mało lub żadnych białek do związania; zostaną one „wyparte” przez przeciwciała poszukiwane w próbce doświadczalnej.

W teście ELISA konkurencyjnym kolorowe dołki wskazują zatem próbki, które w rzeczywistości nie zawierają poszukiwanego przeciwciała! Próbki osocza pacjentów są zazwyczaj badane za pomocą konkurencyjnego testu ELISA w celu ustalenia, czy w próbce obecne są przeciwciała przeciwko określonym patogenom, takim jak wirus HIV.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do przeprowadzania testu ELISA. W tym filmie omówiliśmy: czym jest test ELISA i jak on działa; jakiego sprzętu i odczynników potrzeba do jego wykonania oraz różne zastosowania tej metody. Dziękujemy za uwagę i pamiętajcie, aby nie dopuścić do nadmiernego wybarwienia substratu!