Oczyszczanie plazmidów

Plazmidy są kolistymi, pozachromosomalnymi cząsteczkami DNA, które w biologii molekularnej pełnią rolę nośników, czyli wektorów, dla określonego fragmentu DNA. Do replikacji plazmidów wykorzystuje się bakterie, co pozwala na masową produkcję interesującego badacza fragmentu DNA. Proces, w którym naukowcy wyizolowują plazmidy z bakterii, nazywa się oczyszczaniem plazmidów, co zostanie wyjaśnione w tym filmie.

Oczywiście oczyszczanie plazmidów polega na ich izolacji, ale co dokładnie to oznacza? Aby oczyścić plazmidy, muszą one zostać oddzielone od chromosomu bakteryjnego, białek, błony bakteryjnej oraz rybosomów bakteryjnych.

Mimo istnienia wielu różnych zestawów do oczyszczania plazmidów, podstawowa zasada ich izolacji pozostaje dla wszystkich taka sama. Najpierw wybraną kolonię bakterii hoduje się w odpowiedniej pożywce zawierającej właściwe antybiotyki. Dzięki genowi oporności na antybiotyki, kodowanemu przez plazmid, w tej pożywce urosną tylko bakterie zawierające plazmid. Następnie bakterie są zbierane i poddawane lizie w warunkach wysokiego pH. Po zneutralizowaniu pH i dodaniu soli, mieszaninę wiruje się w celu usunięcia szczątków komórkowych i DNA genomowego.

Zneutralizowany lizat komórkowy nanosi się na kolumnę krzemionkową. Przyjmuje się, że DNA plazmidowe wiąże się z kolumną poprzez mechanizm wymiany anionowej, w którym DNA, będące silnym anionem, łączy się z ujemnie naładowaną kolumną za pomocą kationowego mostka solnego. Pozostałe materiały z lizatu, takie jak białka, są wypłukiwane z kolumny za pomocą buforów o wysokim stężeniu soli. Na koniec oczyszczony plazmid jest uwalniany z kolumny po dodaniu buforu o niskim stężeniu soli, co prowadzi do rozpadu mostka solnego.

Podczas wykonywania tej procedury należy nosić fartuch laboratoryjny, jednorazowe rękawiczki i okulary ochronne.

Kultury bakterii, które zostały przekształcone pożądanym plazmidowym DNA, należy hodować przez noc w pożywkach wzrostowych z odpowiednim antybiotykiem w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37°C.

Następnego dnia kulturę bakterii należy osadzić poprzez wirowanie, a nadfiltr usunąć. Pozostały osad resuspenderuje się w buforze lizującym.

Po resuspensji bakterie można przenieść do mniejszej probówki, do której dodaje się bufor lizujący. Bufor lizujący ma wysokie pH i zawiera detergenty, takie jak dodecylo-siarczan sodu, które rozrywają błony bakteryjne, powodując lizę bakterii. Po dodaniu buforu lizującego roztwór stanie się mętny, a po wymieszaniu ponownie się przejrzyści. Mieszaniny nie należy mieszać w wortexie ze względu na możliwość ścinania lub rozrywania genomowego DNA, co mogłoby doprowadzić do zanieczyszczenia oczyszczanego DNA plazmidowego.

Następnie dodaje się bufor neutralizujący, aby zneutralizować warunki zasadowe i obniżyć pH. Podczas delikatnego mieszania genomowe DNA oraz wszelkie związane z nim białka wytrącą się, podczas gdy DNA plazmidowe pozostanie w roztworze. Ponownie należy unikać wortexowania, aby plazmidy były wolne od zanieczyszczeń genomowym DNA.

Mieszaninę następnie wiruje się, osadzając wytrącone genomowe DNA i białka. Nadfiltr zawiera DNA plazmidowe oraz białka rozpuszczalne.

Nadfiltr przenosi się na kolumnę poprzez przelewanie lub pipetowanie. Osad można odrzucić.

Następnie przez kolumnę przepuszcza się bufor piorący o wysokim stężeniu soli, podczas gdy DNA pozostaje związane z krzemionką. Powtarzane etapy przemywania buforem o wysokiej zasoleniu usuwają endonukleazy, RNA, białka, barwniki i zanieczyszczenia o niskiej masie cząsteczkowej. Przesącz z etapów przemywania należy odrzucić. Po ostatnim etapie przemywania należy upewnić się, że filtr jest całkowicie suchy i nie pozostał w nim żaden bufor. DNA plazmidowe wciąż znajduje się na filtrze.

DNA plazmidowe eluje się wodą sterylną lub buforem elucyjnym. DNA jest gotowe do natychmiastowego użycia w szerokim zakresie zastosowań.

Istnieje szereg sposobów weryfikacji czystości plazmidów po oczyszczaniu. Można użyć spektrometru, aby porównać absorbancję przy różnych długościach fal w celu określenia stężenia DNA plazmidowego. Analiza oczyszczonego plazmidu na żelu agarozowym pozwala ustalić, czy plazmid ma prawidłowy rozmiar i czy nie ma zanieczyszczeń. Krok ten zapewnia brak zanieczyszczeń genomowym DNA oraz potwierdza, że plazmid nie został zmodyfikowany w bakteriach.

Procedurę oczyszczania plazmidów można modyfikować w zależności od rozmiaru plazmidu, liczby kopii, objętości hodowli, a także stosować różne urządzenia do etapów wiązania, płukania i elucji. Wydajność jest jedną z najważniejszych różnic między preparatami plazmidowymi, które często dzieli się na minipreparaty (miniprep), midipreparaty (midiprep), maxipreparaty (maxiprep) i megapreparaty (megaprep), w zależności od pożądanej ilości uzyskanego produktu.

W kontekście dalszych zastosowań, procedurą często następującą po oczyszczaniu plazmidów jest transfekcja, która polega na wprowadzeniu plazmidowego DNA do komórek eukariotycznych. Celem eksperymentu z transfekcją jest często wizualizacja struktury komórek i tkanek za pomocą białek reporterowych, takich jak te znakujące neurony na prezentowanych tutaj obrazach.

Czasami do tych samych bakterii można wprowadzić wiele plazmidów oczyszczonych za pomocą różnych metod preparatywnych, odtwarzając w ten sposób cały szlak biosyntetyczny poprzez produkcję szeregu enzymów kodowanych przez plazmidy. Efektem końcowym jest wytwarzanie przez komórkę złożonego związku, takiego jak antybiotyk widoczny tutaj.

Oczyszczone plazmidy mogą zostać ponownie wprowadzone do bakterii w celu wygenerowania dużych ilości białka kodowanego przez plazmid. Tutaj widzimy homogenizację i lizę komórek bakteryjnych przed zastosowaniem techniki zwanej oczyszczaniem powinowactwa w celu wyizolowania docelowego białka. Oczyszczone białko zostaje poddane krystalizacji, a następnie zidentyfikowana zostaje jego struktura.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do oczyszczania plazmidów. W tym filmie omówiliśmy podstawowe zasady tej metody, jej opis krok po kroku oraz kilka zastosowań przygotowanego preparatu plazmidowego. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!