Rozmnażanie i rozwój rybki danio

Zarodki danio pręgowanego posiadają wiele cech, które czynią je ulubionym modelem wśród biologów rozwoju. Ich szybki rozwój zewnętrzny oraz przezroczystość sprawiają, że są one wyjątkowo odpowiednie do wizualizacji. Dodatkowo zarodki są podatne na manipulacje zarówno fizyczne, jak i genetyczne, co pozwala badaczom na wyodrębnienie sygnałów kontrolujących procesy rozwojowe. W niniejszym filmie omówiono cykl życiowy danio pręgowanego, wczesne stadia rozwoju zarodkowego, hodowlę ryb do wieku dorosłego oraz przedstawiono wybrane techniki wykorzystujące rozwijające się zarodki danio pręgowanego.

Najpierw omówmy podstawowe etapy rozwoju danio pręgowanego.

Cykl życiowy danio pręgowanego dzieli się na cztery główne okresy: embrionalny, larwalny, młodzieńczy i dorosły. Pełny cykl życia od zapłodnionej komórki jajowej do osobnika dorosłego trwa zaledwie 90 dni.

Wczesny rozwój przebiega w szybkim, lecz przewidywalnym tempie, gdy embriony są hodowane w temperaturze 28 °C. W związku z tym stadia rozwoju można określić jako liczbę godzin lub dni po zapłodnieniu (częściej skracane do hpf lub dpf). Jednak w przypadku zmiany temperatury inkubacji stadia można dokładniej zidentyfikować na podstawie cech morfologicznych. Według tej metody pierwsze 24 godziny dzielą się na pięć faz: zygota, podziały, blastula, gastrula i segmentacja. Faza pharyngula obejmuje kolejne 24 godziny, aż do momentu wyklucia się zarodków i przejścia w stadium larwy.

Teraz, gdy są Państwo zapoznani z głównymi etapami rozwoju danio pręgowanego, omówmy szczegółowo pierwsze 24 godziny.

Cykl życiowy danio pręgowanego rozpoczyna się od zapłodnionej komórki jajowej. Zygota ta posiada kilka ważnych struktur, w tym otaczającą embrion błonę ochronną zwaną chorionem oraz żółtko, które dostarcza składników odżywczych niezbędnych do rozwoju embrionalnego do momentu, gdy ryba będzie w stanie samodzielnie się odżywiać. Krótko po zapłodnieniu cytoplazma przemieszcza się w stronę jednego z biegunów jaja, powodując napęcznienie pojedynczej komórki zwanej blastodyskiem.

W okresie podziałów blastodysk dzieli się, tworząc blastomery, które następnie ulegają szybkim, zsynchronizowanym podziałom komórkowym bez wzrostu objętości komórek.

Tak szybkie podziały są możliwe dzięki wykorzystaniu zdeponowanego w komórce jajowej przez matkę RNA do syntezy białek funkcjonujących w blastomerach, co eliminuje konieczność syntezy RNA. W okresie blastuli embrion zaczyna syntetyzować własne RNA, co wydłuża cykl komórkowy. Okres ten obejmuje również początek gwałtownego przemieszczania się komórek po powierzchni żółtka, zjawiska znanego jako epibolia.

Gdy komórki pokryją około połowy żółtka, rozpoczyna się okres gastruli. Nazwa tego okresu pochodzi od innego rodzaju przemieszczania się komórek, zwanego gastrulacją, podczas którego komórki migrują pod przesuwający się front komórkowy. Wynikiem tego procesu jest powstanie trzech wyraźnych warstw komórek, tzw. listków zarodkowych: endodermy, mezodermy i ektodermy. Komórki w każdej z tych trzech warstw mają zupełnie inne przeznaczenie: z ektodermy powstaje nabłonek i układ nerwowy, z endodermy formuje się przewód pokarmowy, a mezoderma generuje mięśnie, kości i układ naczyniowy.

Do 12 hpf mezoderma zaczyna dzielić się na somity, czyli segmenty tkanki wzdłuż tułowia, z których później powstaną mięśnie. Choć liczba somitów definiuje poszczególne stadia w tym okresie segmentacji, w ciągu tych 10 godzin zachodzi znacznie więcej procesów. Już 24 godziny po zapłodnieniu embriony są aktywne i posiadają nawet bijące serce!

W ciągu zaledwie jednego dnia zaszły ogromne zmiany, ale praca zarodka jeszcze się nie skończyła! Zarodki nadal rozwijają się wewnątrz chorionów, aż do momentu wyklucia się w larwy około 3 dni po zapłodnieniu. Szybko zużywając zapasy energii z żółtka, larwy wkrótce wykształcają wyspecjalizowane struktury umożliwiające pływanie, takie jak pęcherz pławny: organ wypełniony gazem, który kontroluje wyporność. Po 7 dpf młode ryby, czyli „narybek”, są w pełni mobilne i zaczynają poszukiwać pokarmu!

Gotowi na adopcję ryby? Będziecie potrzebować żłobka, aby wyhodować narybek do wieku dorosłego. Nie, nie dokładnie w ten sposób. Larwy są początkowo umieszczane w zbiornikach z niewielką lub żadną wymianą wody, a następnie zwiększa się przepływ wody w miarę, jak ryby poprawiają swoje zdolności łowieckie i pływackie. Larwy są zazwyczaj karmione kombinacją rehydratowanej suchej karmy i mikroorganizmów, takich jak pantofelki, aby zmaksymalizować tempo wzrostu. Po 2-3 miesiącach w żłobku ryby osiągają wiek dorosły, co kończy cykl życiowy.

Po zapoznaniu się z głównymi etapami rozwoju danio-pręgowanego, przyjrzyjmy się technikom stosowanym do badania tych procesów.

Mały rozmiar i przejrzystość zarodków danio-pręgowanego sprawiają, że nadają się one do hybrydyzacji in situ RNA. Technika ta wykorzystuje znakowaną cząsteczkę RNA komplementarną do interesującego nas mRNA, co pozwala na wizualizację ekspresji genów w całym organizmie. Zmiany w ekspresji genów w czasie oraz w konkretnych narządach są łatwo obserwowalne i pozwalają zrozumieć procesy rozwojowe.

Ponadto zewnętrzny rozwój zarodków danio-pręgowanego umożliwia przeprowadzanie transplantacji komórek. Komórki z wczelemi zarodkami, znakowane fluorescencyjnie, mogą być przeszczepiane do nieznakowanych zarodków biorcy i śledzone w czasie. Metoda ta pozwala badaczom analizować, w jaki sposób oddziaływania komórkowe wpływają na funkcje narządów, a także łatwo wizualizować ruchy komórek in vivo.

Wreszcie, ze względu na to, że zarodki danio-pręgowanego są łatwo modyfikowane genetycznie poprzez mikroiniekcję, badacze mogą analizować rolę konkretnych genów podczas rozwoju, zaczynając od stadium jednej komórki. Na przykład, aby zbadać efekt utraty funkcji genu, do ryb można wstrzyknąć morfolino, czyli oligosynukleotydy antysensowne zaprojektowane w celu zablokowania ekspresji białka. Przesiewowe badanie wstrzykniętych ryb pod kątem fenotypów rozwojowych, takich jak zmiany w formowaniu się naczyń krwionośnych, dostarcza informacji o genetycznej kontroli złożonych procesów rozwojowych.

Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat rozwoju danio pręgowanego. W materiale tym przedstawiono cykl życiowy danio pręgowanego, omówiono etapy wczesnego rozwoju tego gatunku oraz podkreślono znaczenie danio pręgowanego jako narzędzia w biologii rozwoju. Dziękujemy za uwagę!