15.14: PCR

Przegląd

Reakcja łańcuchowa polimerazy, czyli PCR, jest szeroko stosowaną techniką kopiowania segmentów DNA. Ze względu na wykładniczą amplifikację, PCR może wytworzyć miliony lub miliardy kopii DNA w ciągu zaledwie kilku godzin. W reakcji PCR odporny na ciepło enzym polimeraza DNA amplifikuje oryginalne DNA poprzez serię zmian temperatury w zautomatyzowanej maszynie zwanej termocyklerem.

PCR to wszechstronna metoda, która zrewolucjonizowała biologię molekularną

Kary Mullis opracował metodę PCR w 1983 r., za co w 1993 r. otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Będąc stosunkowo szybką, niedrogą i precyzyjną metodą kopiowania sekwencji DNA, PCR stała się nieocenionym narzędziem do wielu zastosowań, w tym do klonowania molekularnego, mutagenezy genów, wykrywania patogenów, analizy ekspresji genów, oznaczania ilościowego i sekwencjonowania DNA oraz diagnostyki chorób genetycznych.

Cykl reakcji PCR

PCR naśladuje naturalny proces replikacji DNA zachodzący w komórkach. Mieszanina reakcyjna zawiera matrycową sekwencję DNA do skopiowania, parę krótkich cząsteczek DNA zwanych starterami, wolne elementy DNA zwane trifosforanami deoksynukleotydów (dNTP) i wyspecjalizowany enzym polimerazę DNA.

PCR obejmuje szereg etapów prowadzonych w wysokich temperaturach, wymagających enzymu polimerazy DNA działającego w takich temperaturach. Najczęściej stosowaną polimerazą DNA jest polimeraza Taq, nazwana na cześć bakterii Thermus aquaticus, z której początkowo wyizolowano polimerazę. Polimeraza DNA nie jest w stanie zsyntetyzować cząsteczki DNA od podstaw ani de novo. Zamiast tego polimeraza DNA dodaje krótkie cząsteczki DNA, zwane starterami, które wiążą się z matrycą DNA poprzez komplementarne parowanie zasad. Podkłady zapewniają wolne 3’ grupę hydroksylową, do której polimeraza DNA może przyłączać nowe dNTP. W PCR występują cztery typy dNTP, po jednym na każdy nukleotyd w cząsteczce DNA: dATP, dCTP, dGTP i dTTP.

Każdy cykl PCR składa się z trzech etapów: denaturacji, przyłączania i syntezy DNA.

1. Denaturacja. Cykl PCR inicjowany jest poprzez podgrzanie mieszaniny reakcyjnej do wysokiej temperatury, co powoduje rozdzielenie podwójnej helisy DNA na dwie nici. To „topnienie” proces zwykle zachodzi w temperaturze 90°C­­–100°C.
2. Wyżarzanie. Mieszaninę reakcyjną szybko schładza się (zwykle do 50°C–65°C)), umożliwiając związanie dwóch starterów z ich komplementarnymi sekwencjami na niciach matrycowego DNA.
3. Synteza DNA (przedłużanie startera). Mieszaninę reakcyjną ponownie ogrzewa się, tym razem do temperatury (zwykle 60°C–75°C), która pozwala polimerazie DNA na wydłużenie starterów poprzez dodanie dNTP, które łączą się z zasadami w nici matrycowej.

Typowy PCR obejmuje 20–40 powtarzanych cykli tych trzech etapów zachodzących w termocyklerze. Ponieważ liczba cząsteczek DNA podwaja się w każdym cyklu, DNA ulega wykładniczej amplifikacji.

Ograniczenia PCR

Jeśli naukowiec chce amplifikować określony odcinek genomu, musi znać przynajmniej część docelowej sekwencji DNA, aby zaprojektować odpowiednie startery. Innym potencjalnym problemem jest niespecyficzne przyłączanie starterów do częściowo podobnych sekwencji DNA, prowadzące do amplifikacji DNA innego niż docelowy. Problem ten można kontrolować optymalizując warunki reakcji. PCR, będąc bardzo czułą metodą wykrywania, jest również podatna na zanieczyszczenia i nawet śladowe ilości zanieczyszczającego DNA mogą powodować mylące wyniki. Polimerazy DNA stosowane w PCR mogą być podatne na błędy. Jeśli mutacja nastąpi w ciągu pierwszych kilku cykli, większość amplifikowanego DNA będzie nosicielem mutacji.

Celem PCR, reakcji łańcuchowej polimerazy, jest amplifikacja sekwencji genetycznej. W tym przykładzie interesujący nas gen zostanie amplifikowany z oczyszczonego DNA. Aby przeprowadzić amplifikację, wymagana jest polimeraza do syntezy nowego DNA.

Potrzebny jest również starter, krótki fragment jednoniciowego DNA, który ma homologię z genem będącym przedmiotem zainteresowania. Wreszcie, pojedyncze nukleotydy zwane trifosforanami deoksynukleozydów lub dNTP są używane do wytworzenia nowej nici. Pierwszym krokiem w PCR jest podgrzanie mieszaniny, która denaturuje DNA.

Następnie reakcja jest schładzana, a startery będą wyżarzane do swojego homologicznego obszaru. Po związaniu reakcja jest podgrzewana do temperatury optymalnej dla polimerazy. Polimeraza następnie rozpoznaje kompleks starterowego DNA i rozpoczyna syntezę nowej nici przy użyciu dNTP w roztworze.

Reakcja jest następnie podgrzewana i przebiega zgodnie z opisem w dodatkowych cyklach. Po trzecim cyklu znajduje się łącznie osiem kopii genu. Po czwartym cyklu 16 egzemplarzy.

I piąty cykl, 32 egzemplarze. Liczba cykli będzie nadal rosła wykładniczo. Po 30 cyklach jest ich nieco ponad miliard egzemplarzy.