15.14: Metoda PCR

Przegląd

Reakcja łańcuchowa polimerazy lub PCR jest szeroko stosowaną techniką kopiowania segmentów DNA. Ze względu na wykładniczą amplifikację, PCR może wyprodukować miliony lub miliardy kopii DNA w ciągu zaledwie kilku godzin. W reakcji PCR odporny na ciepło enzym polimerazy DNA amplifikuje oryginalne DNA poprzez serię zmian temperatury wewnątrz zautomatyzowanej maszyny zwanej termocyklerem.

PCR to wszechstronna metoda, która zrewolucjonizowała biologię molekularną

Kary Mullis opracował PCR w 1983 roku, za co otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1993 roku. Będąc stosunkowo szybkim, niedrogim i precyzyjnym sposobem kopiowania sekwencji DNA, PCR stał się nieocenionym narzędziem do wielu zastosowań, w tym klonowania molekularnego, mutagenezy genów, wykrywania patogenów, analizy ekspresji genów, kwantyfikacji i sekwencjonowania DNA oraz diagnostyki chorób genetycznych.

Cykl reakcji PCR

PCR naśladuje naturalny proces replikacji DNA, który zachodzi w komórkach. Mieszanina reakcyjna zawiera matrycową sekwencję DNA do skopiowania, parę krótkich cząsteczek DNA zwanych starterami, wolne bloki budulcowe DNA zwane trifosforanami deoksynukleotydów (dNTP) oraz wyspecjalizowany enzym polimerazy DNA.

PCR składa się z szeregu etapów w wysokich temperaturach, wymagających enzymu polimerazy DNA, który działa w takich temperaturach. Najczęściej stosowaną polimerazą DNA jest polimeraza Taq, nazwana na cześć Thermus aquaticus, bakterii, z której początkowo wyizolowano polimerazę. Polimeraza DNA nie jest w stanie zsyntetyzować cząsteczki DNA od zera lub de novo. Zamiast tego polimeraza DNA dodaje się do krótkich cząsteczek DNA, zwanych starterami, które wiążą się z matrycą DNA poprzez komplementarne parowanie zasad. Startery zapewniają wolną grupę hydroksylową 3′, do której polimeraza DNA może przyłączać nowe dNTP. W PCR występują cztery rodzaje dNTP, po jednym dla każdego nukleotydu w cząsteczce DNA: dATP, dCTP, dGTP i dTTP.

Każdy cykl PCR składa się z trzech etapów: denaturacji, wyżarzania i syntezy DNA.

1. denaturacja. Cykl PCR jest inicjowany przez podgrzanie mieszaniny reakcyjnej do wysokiej temperatury, powodując rozdzielenie podwójnej helisy DNA na dwie nici. Ten proces “topnienia” zachodzi zwykle w temperaturze 90°C–100°C.
2. Wyżarzanie. Mieszanina reakcyjna jest szybko schładzana (zwykle do 50°C–65°C), co pozwala dwóm starterom związać się z ich komplementarnymi sekwencjami na matrycowych niciach DNA.
3. Synteza DNA (rozszerzenie startera). Mieszanina reakcyjna jest ponownie podgrzewana, tym razem do temperatury (zwykle 60°C–75°C), która umożliwia polimerazie DNA wydłużenie starterów poprzez dodanie dNTP, które łączą się z zasadami w nici matrycowej.

Typowy PCR obejmuje 20-40 powtarzających się cykli tych trzech etapów, występujących w termocyklerze. Ponieważ liczba cząsteczek DNA jest podwajana w każdym cyklu, DNA jest amplifikowane wykładniczo.

Ograniczenia PCR

Jeśli naukowiec chce amplifikować określony fragment genomu, musi znać przynajmniej część docelowej sekwencji DNA, aby zaprojektować odpowiednie startery. Innym potencjalnym problemem jest niespecyficzne wyżarzanie starterów do częściowo podobnych sekwencji DNA, prowadzące do amplifikacji DNA niedocelowego. Problem ten można kontrolować, optymalizując warunki reakcji. Będąc bardzo czułą metodą wykrywania, PCR jest również podatny na zanieczyszczenie, a nawet śladowe ilości zanieczyszczonego DNA mogą powodować mylące wyniki. Polimerazy DNA stosowane w PCR mogą być podatne na błędy. Jeśli mutacja nastąpi w ciągu pierwszych kilku cykli, większość amplifikowanego DNA będzie nosić mutację.