Do analizy HPLC wykorzystano kulki POROS sprzężone z lektynami. Standardy glikopeptydów posłużyły jako kontrole pozytywne i negatywne. Osocze ludzkie po usunięciu białek MARS-14 i trawieniu trypsyną poddano chromatografii, a następnie zebrano frakcje przepływowe (FT) oraz związane do analiz ESI-LC-MS/MS. W frakcji związanej odnotowano wzbogacenie glikopeptydów w porównaniu z frakcją FT.
Artykuł metodologiczny
Metoda HPLC z wykorzystaniem lektyn do selektywnego wzbogacania glikopeptydów z złożonych próbek biologicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Glikany stanowią ważną klasę modyfikacji potranslacyjnych. Struktury glikanów, występujące zazwyczaj w cząsteczkach wydzielanych i zewnątrzkomórkowych, sygnalizują stan wewnętrzny komórki. Glikany w komórkach nowotworowych wykazują tendencję do obfitości reszt kwasu sialowego i fukozy. Proponujemy, aby te związane z nowotworami warianty glikanów zostały wykorzystane do opracowania biomarkerów służących do diagnostyki choroby we wczesnym stadium. W związku z tym opracowaliśmy procedurę opartą na spektrometrii mas, która obejmuje chromatografię na macierzach powinowactwa utworzonych z lektyn, czyli białek wiążących specyficzne struktury glikanów. Lektyny Sambucus nigra (SNA) oraz Aleuria aurantia (AAL), które wiążą odpowiednio kwas sialowy i fukozę, zostały kowalencyjnie sprzężone z koralikami POROS (Applied Biosystems) i zapakowane do kolumn PEEK do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). W skrócie, z osocza usunięto czternaście najliczniej występujących białek przy użyciu systemu usuwania wielokrotnego powinowactwa (MARS-14; Agilent). Oczyszczone osocze poddano trawieniu trypsyną, a następnie rozdzielono na frakcje przepływową i związaną za pomocą HPLC z użyciem SNA lub AAL. Frakcje potraktowano enzymem PNGaseF w celu usunięcia glikanów N-stycznych, a następnie przeanalizowano metodą LC-MS/MS na urządzeniu QStar Elite. Dane przeanalizowano za pomocą oprogramowania Mascot. Schemat doświadczalny obejmował kontrole pozytywne — fukozylowane i sialylowane glikopeptydy laktoferryny ludzkiej — oraz kontrole negatywne — glikopeptydy bogate w mannozę z Saccharomyces cerevisiae — które posłużyły do monitorowania swoistości wychwytu lektynowego. Kluczowe cechy tej procedury obejmują powtarzalność wynikającą z formatu HPLC, jednoznaczną identyfikację wychwyconych i potraktowanych PNGaseF glikopeptydów na podstawie ich deamidowanych motywów Asn-Xxx-Ser/Thr oraz ocenę jakości z użyciem wzorców glikoprotein. Optymalizacja protokołu obejmowała również określenie odpowiedniego stosunku materiału wyjściowego do pojemności kolumny, identyfikację najskuteczniejszych buforów do wychwytu i elucji oraz monitorowanie traktowania PNGaseF w celu zapewnienia pełnej deglikozylacji. Kierunki przyszłych badań obejmują wykorzystanie tej procedury do przeprowadzenia eksperymentów odkrywczych opartych na spektrometrii mas z wykorzystaniem osocza pacjentek z rakiem piersi oraz osób z grupy kontrolnej.
Protokół
1) Przygotowanie kolumn POROS sprzężonych z lektyną
- Załóż maseczkę, aby chronić się przed wdychaniem kulek POROS-AL podczas kroków 1.1 – 1.2. Odważ pożądaną ilość kulek POROS (100 mg kulek/300 μl objętości końcowej) i przenieś je do czystej probówki typu Eppendorf.
- Przemyj kulki, dodając 1 mL soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Osadź kulki poprzez wirowanie w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 3 minuty. Usuń nadosad i powtórz przemywanie.
- Odważ pożądaną ilość nie sprzężonej lektyny (1 – 4 mg/ 200 μl kulek) i przenieś ją do czystej probówki typu Eppendorf. Dodaj PBS, aby przygotować roztwór o stężeniu 5 – 20 mg/mL. Odstaw 25 μl tego roztworu.
- Przenieś pozostały roztwór lektyny do kulek POROS. Dodaj cyjanoborowodorek sodu do stężenia końcowego 50 mM. Umieść probówkę na kołysce i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej. (Uwaga: cyjanoborowodorek sodu jest toksyczny i musi być używany w dygestorium. Zanieczyszczone odpady należy zutylizować w odpowiedni sposób).
- Osadź kulki POROS zgodnie z krokiem 1.2. Usuń nadosad i zachowaj go jako roztwór po sprzęganiu.
- Przemyj kulki 1 mL buforu gaszącego (1 M Tris-Cl, pH 7.4). Osadź kulki zgodnie z krokiem 1.2 i bezpiecznie usuń nadosad.
- Zablokuj pozostałe miejsca reakcyjne na kulkach POROS za pomocą 1 mL buforu gaszącego. Dodaj cyjanoborowodorek sodu do stężenia końcowego 50 mM. Umieść probówkę na kołysce i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 min.
- Osadź kulki zgodnie z krokiem 1.2 i usuń nadosad.
- Przemyj kulki 1 mL 1 M NaCl. Osadź kulki i usuń nadosad. Powtórz czynność cztery razy, aby łącznie wykonać pięć przemyć. Kulki są teraz gotowe do upakowania.
- Aby określić ilość białka sprzężonego z kulkami POROS, wykonaj analizę stężenia białka w roztworach lektyny przed i po sprzęganiu. Różnica w stężeniach stanowi ilość białka sprzężonego z kulkami. Ilość białka sprzężonego w przeliczeniu na objętość kulek odpowiada stężeniu lektyny na kulkach. Docelowe stężenia lektyny wynoszą od 2 do 20 mg/mL.
2) Pakowanie kulek POROS sprzężonych z lektyną do kolumny PEEK
- Zmontuj system do pakowania (opis poniżej) i zamocuj go na metalowym statywie pierścieniowym. System do pakowania składa się z następujących elementów, od dołu do góry: ogranicznik ciśnienia, końcówka kolumny 1, frit, kolumna (2 x 50 mm), końcówka kolumny 2, łącznik kolumny, końcówka kolumny 3, kolumna (4,5 x 50 mm), końcówka kolumny 4 oraz złączka końcowa. Górna kolumna służy jako zbiornik dla materiału wypełniającego.
- Resuspenduj kulki POROS w odpowiedniej objętości Buforu A (10 mM bufor Tris, pH 7,4, 150 mM chlorku sodu, 10 mM chlorku wapnia, 10 mM chlorku magnezu). W przypadku pakowania jednej kolumny (objętość złoża ~200 μl), resuspenduj w 400 μl Buforu A.
- Przenieś skoniugowane kulki POROS do górnej kolumny (zbiornika). Dolewaj Bufor A do zbiornika, aż bufor osiągnie górną krawędź kolumny. Ostrożnie nałóż złączkę końcową na górę kolumny, starając się uniknąć powstania pęcherzyków powietrza w kolumnie. Podłącz złączkę końcową górnej kolumny do systemu HPLC.
- Spakuj kolumnę, przepuszczając Bufor A przez system. Zacznij od szybkości przepływu 0,5 mL/min. Zwiększaj szybkość przepływu o 0,5 mL/min w każdej minucie, aż do osiągnięcia 4 mL/min lub maksymalnego ciśnienia (3000 psi). Kontynuuj z maksymalną możliwą szybkością przepływu, dopóki przez kolumnę nie przepłynie co najmniej 35 mL Buforu A.
- Wyłącz pompy i poczekaj, aż ciśnienie w kolumnie spadnie do < 20 psi.
- Ostrożnie rozmontuj system do pakowania, zaczynając od góry. Po dotarciu do końcówki kolumny 2 usuń ją ostrożnie. Część spakowanego materiału powinna wystawać ponad górną krawędź kolumny. Za pomocą żyletki lub podobnego ostrego narzędzia delikatnie usuń wystające kulki, tak aby powierzchnia złoża była zrównana z górną krawędzią kolumny. Podczas tej czynności nie wywieraj nacisku na kulki.
- Zdejmij spakowaną kolumnę ze statywu pierścieniowego. Włóż nowy frit do nowej końcówki i odwróć spakowaną kolumnę, aby połączyć ją z fritem/końcówką na otwartym (wcześniej górnym) końcu kolumny.
- Odpowiednio oznakuj kolumnę. Jest ona teraz gotowa do użycia. Gdy nie jest używana, kolumnę można przechowywać w PBS z 0,02% azotku sodu w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
3) Zaprogramowanie metody HPLC
- Szczegóły programowania urządzenia HPLC będą się różnić w zależności od specyfiki oprogramowania producenta. W naszej pracy wykorzystujemy HPLC Michrom Paradigm MG4. W tym urządzeniu metody są tworzone i wybierane w zakładce „Setup” u góry ekranu. Należy zaprogramować następującą metodę:
Czas Szybkość przepływu (μl/min) % A % B 0:00 50 100 0 9:00 50 100 0 9:01 500 0 100 13:50 500 0 100 13:51 3000 100 0 19:50 3000 100 0
Bufor A: 10 mM bufor Tris, pH 7.4, 150 mM chlorku sodu, 10 mM chlorku wapnia, 10 mM chlorku magnezu
Bufor B: 0.5 M kwas octowy
Detektor UV należy zaprogramować na odczyt przy 280 nm w czasie od 0:00 do 19:50. Oś y powinna być dostosowana do wykrywania niskich poziomów absorbancji, np. 0 - 50 AU. - Jeśli dostępny jest autosampler, należy zaprogramować następujący harmonogram zbierania frakcji. W przeciwnym razie frakcje należy zbierać ręcznie, zgodnie ze wskazówkami podczas przeprowadzania chromatografii.
Frakcja Opóźnienie rozpoczęcia zbierania od momentu wstrzyknięcia próbki Czas trwania zbierania (min) Przepływowa (Flow-through) 2.8 4.1 Związana (Bound) 9 2.6
4) Przygotowanie próbek do HPLC
- Przed zastosowaniem w tym protokole osocze ludzkie należy opróżnić z 14 najliczniejszych białek przy użyciu kolumny MARS (Agilent; Santa Clara, CA). Opróżnione osocze, ludzką laktoferynę i inwertazę drożdżową należy oddzielnie poddać trawieniu trypsyną i odsolić zgodnie z wcześniejszym opisem 1.
- Aby przygotować standard laktoferyny specyficzny dla lektyny, należy przeprowadzić chromatografię 50 ug laktoferyny trawionej trypsyną na kolumnie AAL lub SNA, stosując metodę opisaną w Części 3. Frakcja związana będzie zawierać glikopeptydy laktoferyny specyficzne dla lektyny. Próbki należy zneutralizować zgodnie z Częścią 4.4 i odsolić zgodnie z Częścią 6. Próbkę należy zawiesić ponownie w 1 mL Buforu A. Tak przygotowana próbka jest gotowa do użycia.
- Należy wykonać trzy powtórzenia eksperymentalne. Aby przygotować próbkę dla trzech powtórzeń, należy dodać 3 pmol inwertazy trawionej trypsyną oraz 1 μl specyficznej dla lektyny laktoferyny (AAL-LAC lub SNA-LAC) do 30 μl ekwiwalentów osocza (PE) trawionych trypsyną i opróżnionych z białek za pomocą MARS. PE definiuje się jako objętość nieprzetworzonego/nienaruszonego/oryginalnego osocza, z którego pochodziła dana ilość przetworzonego osocza (opróżnionego z białek przez MARS i trawionego trypsyną). Do próbki należy dodać Bufor A do uzyskania końcowej objętości 330 μl.
- Do fiolek na próbki, w których będzie zbierany eluat, należy dodać bufor neutralizujący (1 M Tris pH 8.0). Liczba i objętość fiolek zależy od ograniczeń zastosowanego autopróbnika. W przypadku urządzenia Paradigm MG4 jedna fiolka służy do zbierania frakcji niezatrzymanej, a dwie do zbierania eluatu. Do zneutralizowania 1 mL eluatu потребуется około 1,5 mL buforu Tris. Docelowe pH po neutralizacji wynosi 7,0-8,0; końcowe pH należy sprawdzić za pomocą papierka wskaźnika pH.
5) Przeprowadzenie chromatografii
- Wszystkie następujące analizy prób i pomiary tła będą przeprowadzane zgodnie z metodą opisaną w części 1. Kolumna i bufory podczas użytkowania znajdują się w temperaturze pokojowej. Kolumny przechowuje się w temperaturze 4 °C, natomiast bufory w temperaturze pokojowej.
- Podłączyć do systemu HPLC kolumnę z lektyną AAL lub SNA i przeprowadzić dwie analizy tła (wstrzykując sam Bufor A). Należy upewnić się, że kolumna z lektyną odpowiada specyficznej dla danej lektyny laktoferrynie (część 2).
- Przeprowadzić chromatografię trzech próbek osocza, wstrzykując próbkę tła pomiędzy każdą analizowaną próbką, co daje łącznie 7 przebiegów HPLC. Frakcje z analiz tła nie muszą być zbierane.
6) Odsolenie zebranych frakcji
Dla każdej frakcji należy wykorzystać jeden wkład SPE Waters Oasis HLB 1 mL w następujący sposób:
- Przymocuj wymaganą liczbę kolumienek do manifoldu próżniowego.
- Zwilż każdą kolumienkę za pomocą 1 mL 80% ACN w 1% kwasie mrowkowym (manometr próżniowy na manifoldzie powinien wskazywać 5 - 20 lnHg).
- Zrównoważ kolumienki za pomocą 1,5 mL 0,1% kwasu mrowkowego (manometr próżniowy na manifoldzie powinien wskazywać 5 - 20 lnHg).
- Nanieś całą objętość jednej próbki na jedną kolumienkę (manometr próżniowy na manifoldzie powinien wskazywać 2 - 2,5 lnHg, a szybkość przepływu nie powinna przekraczać 1 mL/min).
- Przemyj kolumienki 3 x 1 mL 0,1% kwasu mrowkowego (manometr próżniowy na manifoldzie powinien wskazywać 5 - 20 lnHg).
- Eluuj peptydy/glikopeptydy do opisanych probówek Eppendorf za pomocą 1 x 1 mL 80% acetonitrylu w 0,1% kwasie mrowkowym (manometr próżniowy na manifoldzie powinien wskazywać 2 - 2,5 lnHg, a szybkość przepływu nie powinna przekraczać 1 mL/min). Dla każdej kolumienki należy użyć osobnej probówki do zbierania eluatu.
- Zneutralizuj eluat, dodając 60 μl 0,5 M wodorowęglanu amonu do każdej probówki. Docelowe pH po neutralizacji wynosi 7,0-8,0; sprawdź końcowe pH za pomocą papierka wskaźnikowego.
- Skoncentruj eluoowane peptydy/glikopeptydy do objętości ~50 μL, odwirując je w wirówce próżniowej (np. Thermo Savant SpeedVac) przez ~2 h w temperaturze 35°C.
7) Trawienie PNGazą F
- Zmierz pH próbki, aby upewnić się, że mieści się w zakresie 7,0 - 8,0. W razie potrzeby dodaj 50 mM wodorowęglanu amonu, aby zwiększyć pH. Jeśli końcowa objętość próbki wynosi > 100 μl, odparuj ją w wirówce próżniowej (speedvac), aż osiągnie objętość między 50-100 μl.
- Dodaj 0,5 μl (250 U) PNGazy F bez glicerolu do każdej probówki z próbką i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
8) Próbki w końcówkach Zip Tip
- Zaczynając od próbek poddanych trawieniu PNGazą F, przeprowadź oczyszczanie każdej z nich za pomocą ziptip w następujący sposób.
- Zwilż ziptip 10 μl 100% acetonitrylu, a następnie 10 μl 80% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym.
- Równoważ ziptip 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego.
- Nanieś próbkę na ziptip, pipetując ją 10 razy w górę i w dół przez matrycę ziptip.
- Przemyj ziptip, pipetując 10 μl 0,1% kwasu mrówkowego 5 razy.
- Eluuj próbkę do czystej probówki eppendorfa za pomocą 10 μl 80% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym.
- Powtórz elucję i dodaj kolejne 10 μl do tej samej probówki.
- Odparuj próbki w Speedvacu do objętości < 2 μl.
- Resuspenduj próbki w 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Próbki są teraz gotowe do analizy LC-MS/MS.
9) Reprezentatywne wyniki:
Koniugacja z użyciem POROS zazwyczaj pozwala na uzyskanie stężeń lektyny na koralikach w zakresie 2 - 20 mg/mL. Jest to wartość optymalna dla chromatografii powinowactwa.
Chromatografia lektynowa plazmy ludzkiej po trawieniu trypsyną i usunięciu białek MARS zazwyczaj wzbogaca frakcję związaną w glikopeptydy. Ponieważ glikopeptydy są poddawane działaniu PNGase F przed analizą LC-MS/MS, są one identyfikowane jako peptydy z konsensusową sekwencją wiązania N-glikanów, NXS/T (gdzie X to dowolny aminokwas poza proliną), w których asparagina została przekształcona w kwas asparginowy w wyniku działania PNGase F. Peptydy o tych charakterystykach uznaje się za peptydy odglikozylowane (lub „deglikopeptydy”). Średnio frakcja przepływowa (FT) z chromatografii AAL lub SNA zawiera 2-4% deglikopeptydów, podczas gdy 30-50% peptydów odzyskanych we frakcji związanej to deglikopeptydy. Zazwyczaj, przy użyciu QStar Elite, we frakcji FT zostanie zidentyfikowanych 1000-1300 peptydów, a we frakcji związanej 200-400 peptydów. We frakcji FT powinny zostać zaobserwowane dwa lub więcej odrębnych deglikopeptydów inwertazy, a we frakcji związanej dwa lub więcej odrębnych deglikopeptydów laktoferyny (Tabela 1).
Tabela 1.
Dyskusja
Niniejszy protokół przedstawia szybką metodę izolacji i identyfikacji glikopeptydów w sposób specyficzny dla glikanów. Ponieważ glikozylacja ulega znacznym zmianom w obrębie organizmu, szczególnie podczas rozwoju i patogenezy, technika ta może znaleźć zastosowanie w odpowiedzi na szeroki zakres zagadnień. W szczególności wykorzystujemy tę metodę do selektywnego wzbogacania glikopeptydów zmodyfikowanych epitopami powiązanymi z nowotworami, jako pierwszy krok w procesie odkrywania biomarkerów.
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez inicjatywę Clinical Proteomic Technologies for Cancer, 5U24CA126477-04.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Osocze ludzkie | Przygotowywane we własnym zakresie | ||
| Laktoferryna ludzka | Sigma-Aldrich | L0520 | Trawienie trypsyną przed użyciem |
| Inwertaza drożdżowa | Sigma-Aldrich | I0408 | Trawienie trypsyną przed użyciem |
| Wkładnice SPE OAS HLB | Waters | WAT094225 | Objętość 1 cc |
| Końcówki do pipet ZipTip | Fisher Scientific | ZTC1 8M0 96 | Millipore, C18 do pipety 10 ml |
| Tris | Fisher Scientific | BP154-1 | 99% |
| Węglan amonu | Sigma-Aldrich | A6141 | 99% |
| Chlorek wapnia | Sigma-Aldrich | C4901 | 96% |
| Chlorek magnezu | Sigma-Aldrich | M8266 | 98% |
| Kwas octowy | Sigma-Aldrich | 242853 | 99.7% |
| Papierek wskaźnikowy pH | Fisher Scientific | M95903 | Zakres 0-14 |
| Acetonitryl | Fisher Scientific | A998 | 99.9% |
| Kwas mrówkowy | Pierce, Thermo Scientific | 28905 | 99% |
| Fosforanowy bufor solny (PBS) | Invitrogen | 14190-136 | Bez wapnia i magnezu |
| Azydek sodu | Sigma-Aldrich | 71289 | 99.5% |
| PNGaza F | New England Biolabs | P0705L | Bez glicerolu |
| Kolby do filtrowania próżniowego | Fisher Scientific | SCGVU05RE | Pory 0.2 mm |
| Kuleczki POROS-AL | Applied Biosystems | 1-6028-02 | |
| Aleuria aurantia lektyna | Vector Laboratories | L-1390 | |
| Sambucus nigra aglutynina | Vector Laboratories | L-1300 | |
| Cyjanoborowodorek sodu | Sigma-Aldrich | 296945 | Roztwór 5.0 M |
Bibliografia
- Keshishian, H. multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution. Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).
Przedruki i uprawnienia
