Artykuł metodologiczny

Wizualizacja uwalniania dopaminy w pojedynczych zakończeniach presynaptycznych za pomocą FFN

26.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1562

⸱

31 sierpnia 2009

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Neurology, Columbia University, 2Departments of Psychiatry and Pharmacology, Columbia University, 3Department of Chemistry, Columbia University, 4eMolecules, Inc., 5Departments of Neurology and Physiology, University of California School of Medicine, San Francisco, 6Division of Molecular Therapeutics, New York Psychiatric Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Nowa metoda optycznego pomiaru neurotransmisji z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów dopaminy.

Streszczenie

Układ nerwowy przekazuje sygnały między neuronami poprzez uwalnianie neuroprzekaźników podczas fuzji pęcherzyków synaptycznych. Aby bezpośrednio obserwować pobieranie i uwalnianie neuroprzekaźników z poszczególnych zakończeń presynaptycznych, zaprojektowaliśmy fluorescencyjne fałszywe neuroprzekaźniki służące jako substraty dla transporterów monoamin pęcherzyków synaptycznych. Wykorzystując te sondy do obrazowania uwalniania dopaminy w prążkowiu, dokonaliśmy kilku obserwacji istotnych dla plastyczności synaptycznej. Stwierdzono, że frakcja pęcherzyków synaptycznych uwalniających neuroprzekaźnik na jeden bodziec była zależna od częstotliwości stymulacji. W tych warunkach eksperymentalnych nie zaobserwowano kinetycznie odrębnej populacji „rezerwowych” pęcherzyków synaptycznych. Wykazano zależną od częstotliwości heterogeniczność zakończeń presynaptycznych, która była częściowo zależna od receptorów dopaminowych D2, co wskazuje na mechanizm zależnego od częstotliwości kodowania selekcji presynaptycznej.

Hui Zhang i Niko G. Gubernator wnieśli równy wkład w tę pracę.

Protokół

Metoda ta została wykorzystana w badaniach opisanych w pracy Gubernator et al., Science 324 (5933). 1441-1444 (2009).

1. Przygotowanie ostrych skrawków prążkowia

  1. Przed przygotowaniem ostrych skrawków prążkowia należy natlenić sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ASCF) i chłodzić go w lodzie przez co najmniej 15 minut przed wyjęciem mózgu. Podczas sekcji ACSF należy utrzymywać w niskiej temperaturze (w lodzie) i stale natleniać. ACSF (w mM): NaCl 125, KCl 2.5, NaHCO3 26, CaCl2 2.4, MgSO4 1.3, KH2PO4 0.3, glukoza 10, HEPES 5; pH 7.3-7.4, 290-295 mOsm.
  2. Dokonać dekapitacji samca myszy bez znieczulenia.
  3. Wyjąć cały mózg z myszy i przymocować go do tacy wibrotomu za pomocą Krazy®Glue. Wyjęcie i montaż mózgu muszą zostać wykonane w ciągu 2 minut. W tym czasie należy dbać o to, aby ACSF pozostawał schłodzony w lodzie i natleniony, aby zachować żywotność tkanki.
  4. Wyciąć koronalne skrawki prążkowia o grubości 250μm w przedziale od bregma +1.54 do +0.621. Uzyskane zostaną trzy pełne skrawki, które można następnie podzielić za pomocą igły na 6 połówkowych skrawków.
  5. Inkubować skrawki mózgu w natlenionym ACSF w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę przed wprowadzaniem sondy. Skrawki wykazują prawidłowe obciążenie FFN511 i pozostają aktywne do obrazowania do 4 godzin po przygotowaniu.

2. Załadowanie FFN511

  1. Przygotować roztwór ładujący FFN511 (10μM FFN511 w ACSF); przygotować również 100μM ADVASEP-7 w ACSF. Wszystkie roztwory powinny być przygotowane na świeżo i napowietrzone przez co najmniej 15 minut przed wprowadzeniem do skrawków.
  2. Inkubować poszczególne skrawki w roztworze ładującym FFN511 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Następnie usunąć barwnik związany z tkanką pozakomórkową, inkubując naładowany skrawek w napowietrzonym roztworze 100μM ADVASEP-7 ACSF przez 30 minut w temperaturze pokojowej2. Skrawki są teraz gotowe do obrazowania.

3. Obrazowanie FFN511 w skrawkach mózgu

Obrazowanie FFN511 w skrawkach wykonuje się przy użyciu multiphotonowego skaningowego mikroskopu laserowego. Wykorzystujemy multiphotonowy skaningowy mikroskop laserowy Prairie Ultima (wcześniej używaliśmy multiphotonowego skaningowego mikroskopu laserowego Zeiss LSM 510 NLO i część wyników uzyskano przy użyciu mikroskopu Zeiss).

  1. Umieść skrawek obciążony FFN511 w komorze rejestracyjnej (RC-27L, Warner) i poddawaj superfuzyjnie natlenionym ACSF przy szybkości przepływu 1-2 ml na minutę. Następnie umieść na górze skrawka platynową harfę z nylonowymi strunami, aby zminimalizować ruchy podczas eksperymentu. Aby dodatkowo ograniczyć przemieszczanie się tkanki, pozwól skrawkowi stabilizować się w komorze przez co najmniej 10 minut przed obrazowaniem.
  2. Wizualizuj i zlokalizuj grzbietowe prążkowie, korzystając z luminescencji w polu jasnym pod obiektywem imersyjnym wodnym 10x.
  3. W przypadku przeprowadzania eksperymentu ze stymulacją, umieść i wypozycjonuj bipolarne skręcone elektrody wolframowe w tym obszarze. Idealny obszar obrazowania znajduje się w odległości 300 μm pomiędzy dwoma końcami stymulującej elektrody bipolarnej. Umieść ten region w centrum pola widzenia.
  4. Obrazuj terminale prążkowia oznakowane FFN511 pod ultrafioletowym obiektywem imersyjnym wodnym 63x (0.9 NA). FFN511 jest wzbudzany przy 760 nm za pomocą lasera Mai Tai firmy Spectral Physics, a optymalna fluorescencja terminali prążkowia jest widoczna przez filtr pasmowy (480-520 nm). Obrazy są rejestrowane w formacie 12-bitowym z obszarami zainteresowania o wymiarach 75 x 75 μm przy rozdzielczości 512 x 512 pikseli. W eksperymentach z wymywaniem indukowanym stymulacją, w celu skompensowania przesunięcia w osi z, dla każdego przedziału czasowego pozyskiwana jest seria z składająca się z 5-7 obrazów, oddzielonych od siebie o 1 μm w płaszczyźnie z.

4. Odbarwianie FFN511

Znacznik FFN511 można usunąć za pomocą wysokiego stężenia KCl (stosujemy 70 mM KCl), siarczanu (+)-amfetaminy (AMPH, 20 μM) lub stymulacji elektrycznej. W eksperymencie z usuwaniem znacznika za pomocą KCl, po zastosowaniu roztworu ACSF o wysokim stężeniu potasu do skrawka mózgu, znacznik FFN511 zostaje usunięty w ciągu 2 minut. Należy rejestrować obrazy xyz-t, aby śledzić proces usuwania FFN511 w czasie. Poniżej opisano proces usuwania znacznika z zakończeń dopaminergicznych zależny od stymulacji elektrycznej:

  1. Aby monitorować odbarwianie FFN511 w czasie, rejestruje się obrazy xyz-t. Aby zapewnić minimalne przemieszczenie skrawka (mniej niż 4 μm w osi z) oraz brak fotobleachingu wywołanego laserem, należy uzyskać kontrolne obrazy serii czasowej stosu z przez co najmniej 5 minut przed stymulacją. W przeciwnym razie należy skorygować moc lasera.
  2. Po wykonaniu tych obrazów kontrolnych należy kontynuować obrazowanie xyz-t, rozpoczynając stymulację z częstotliwością 1, 4 lub 20 Hz. Bodźce o częstotliwości 1, 4 lub 20 Hz (300 μs x 1 mA) są przyłożone lokalnie do prążkowia za pomocą izolatora stymulacji Iso-Flex wyzwalanego przez generator impulsów Master-8 (AMPI, Jerusalem, Israel) z użyciem elektrod bipolarnych. Aby zminimalizować zmienność depolaryzacji miejsc uwalniania, zastosowano protokół stymulacji wykorzystujący 150% maksymalnej intensywności stymulacji wyznaczonej za pomocą woltametrii cyklicznej.
  3. Do analizy obrazów należy użyć odpowiedniego oprogramowania. W naszym laboratorium używamy programu Image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) oraz autorskiego oprogramowania w języku IDL (Research Systems, Boulder, CO) do ilościowego oznaczenia fluorescencji punktów (puncta) oraz zmian zachodzących w czasie3.

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 przedstawia zakończony proces wprowadzania FFN511 do przekroju prążkowia. Reprezentatywne obrazy wykonane przy użyciu obiektywów 10x i 60x pokazano na Rys. 1. Selektywne znakowanie zakończeń dopaminergicznych można usunąć za pomocą 20 μM amfetaminy.
Rysunek 2 przedstawia usuwanie znakowania FFN511 za pomocą wysokiego stężenia KCl.
Rysunek 3 przedstawia usuwanie znakowania FFN511 za pomocą lokalnej stymulacji elektrycznej.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przekrojów mózgu, przedstawiający warunki kontrolne i doświadczalne.
Rysunek 1. FFN511 znakuje zakończenia dopaminergiczne w żywych ostrych przekrojach korowo-prążkowiowych. (A) Znakowanie za pomocą FFN511 w ostrym żywym przekroju korowo-prążkowiowym: obfite znakowanie w prążkowiu (STR), rzadsze znakowanie w korze (CTX) oraz brak oznakowania w ciele modzelowatym (CC). Pasek skali: 100 μm. (B) Usuwanie FFN511 z prążkowia za pomocą amfetaminy. Panele lewe: przed podaniem amfetaminy; panele prawe: po 20 minutach działania 20 μM amfetaminy. Pasek skali: 10 μm.

Obraz mikroskopowy; odpowiedź komórkowa na KCl. Kontrola i traktowanie z widocznymi zmianami kontrastu.
Rycina 2. Odbarwienie znakowania FFN511 pod wpływem wysokiego stężenia KCl. Znakowanie FFN511 ulega odbarwieniu w ciągu 2 min aplikacji 70 mM KCl w ACSF. Pasek skali: 10μm.

Sygnalizacja wapniowa neuronów; obrazowanie fluorescencyjne, wykres zaniku; analiza wzbudzenia optycznego;
Rycina 3. Zależne od częstotliwości odbarwianie znakowania FFN511 w prążkowiu. (A) Lokalna stymulacja z częstotliwością 4 Hz spowodowała odbarwianie z zakończeń. Stymulację rozpoczęto w t = 0. Pasek skali: 5 μm. (B) Odbarwianie FFN511 przy 4 Hz jest zależne od Ca2+ oraz częstotliwości. Grupy kontrolne nie otrzymały stymulacji (153 punkta z 3 skrawków). Odbarwianie z dodatkiem chlorku kadmu (200 μM) było identyczne z niepobudzanymi kontrolami (475 punktów z 5 skrawków). Krzywe odbarwiania dla każdej częstotliwości stymulacji dopasowano za pomocą funkcji pojedynczego wykładniczego zaniku, a wartości okresu półtrwania (t1/2) obliczono jako τ x 0,693 (1 Hz: 765 punktów z 9 skrawków, 4 Hz: 410 punktów z 7 skrawków, 20 Hz: 416 punktów z 6 skrawków). Prosimy o zapoznanie się z mikrofilmem wideo z mikroskopii dwufotonowej przedstawiającym odbarwianie FFN511 podczas egzocytozy w preparacie skrawka mózgu z prążkowiem.

Dyskusja

W tym filmie prezentujemy metodę optycznej wizualizacji neurotransmisji z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów dopaminy. FFN511 jest pierwszą generacją opracowanych przez nas FFN. Chociaż został on zaprojektowany poprzez ukierunkowanie na neuronalny transporter monoamin pęcherzykowy (VMAT2), który transportuje neurotransmitery monoaminowe z cytoplazmy do pęcherzyków synaptycznych i specyficznie znakuje zakończenia dopaminergiczne w prążkowiu oraz domniemane zakończenia katecholaminergiczne i/lub serotonergiczne w korze (jak pokazano w publikacji w czasopiśmie Science), odpowiedni czas ładowania jest krytyczny dla specyficzności, ponieważ FFN511 jest stosunkowo hydrofobowy. Stwierdzono, że inkubacja trwająca dłużej niż 40 minut prowadzi do rozległego niespecyficznego barwienia w skrawkach prążkowia. Specyficzność można łatwo określić poprzez odbarwianie z użyciem wysokiego stężenia KCl, co powinno spowodować uwolnienie FFN z funkcjonalnych pęcherzyków synaptycznych. Ekspozycja skrawka na FFN511 przez mniej niż 15 minut skutkuje słabym sygnałem fluorescencyjnym z powodu niewystarczającego załadowania barwnika do zakończeń. W tym protokole stosujemy 100μM ADVASEP-7 w celu usunięcia barwnika związanego z tkanką pozakomórkową. Krok ten nie jest niezbędny, ale w przypadku jego pominięcia czas wypłukiwania w ACSF musi zostać wydłużony. Podsumowując, w zależności od wybranego preparatu, konieczna będzie modyfikacja stężenia i czasu ładowania w celu ustalenia optymalnego znakowania.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

D. Sames dziękuje fundacji The G. Harold & Leila Y. Mathers Charitable Foundation oraz programom Columbia University's Initiatives in Science and Engineering.
D. Sames i D. Sulzer dziękują fundacji McKnight Foundation za przyznanie The McKnight Technological Innovations in Neuroscience Award
D. Sulzer dziękuje NIDA, NIMH oraz fundacjom Picower i Parkinson's Disease Foundations.
H. Zhang dziękuje NARSAD.
R.H. Edwards dziękuje fundacji Michael J. Fox Foundation, National Parkinson Foundation, NIDA oraz NIMH.
Dziękujemy Robertowi Burke’owi za iniekcje 6-OHDA i porady, Markowi Sondersowi za pomocne dyskusje, Merekowi Siu za programowanie analizy obrazowania oraz Janowi Schmoranzerowi za wsparcie techniczne przy konfiguracji mikroskopii TIRF.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)Columbia University - Dalibor Sames Lab
ADVASEP-7 CyDexAR-OA7-005
Komora rejestracyjna RC-27LWarner Instruments64-0375
Uchwyt 6-dołkowy PELCO PrepEzeTed Pella, Inc.36157-1Do inkubacji skrawków
Stymulator impulsowy Master-8 oraz izolator stymulacji Iso- FlexAMPI

Bibliografia

  1. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
  2. Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
  3. Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fluorescencyjne fałszywe neuroprzekaźnikifuzja pęcherzyków synaptycznychbarwienie FFN 511mikroskopia wielofotonowastymulacja elektrycznadepolaryzacja chlorkiem potasuheterogeniczność zależna od częstotliwościreceptory dopaminy D2
Wizualizacja uwalniania dopaminy w pojedynczych zakończeniach presynaptycznych za pomocą FFN
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.