Artykuł metodologiczny

Wizualizacja uwalniania dopaminy w pojedynczych zakończeniach presynaptycznych za pomocą FFN

DOI:

10.3791/1562

⸱

31 sierpnia 2009

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Neurology, Columbia University, 2Departments of Psychiatry and Pharmacology, Columbia University, 3Department of Chemistry, Columbia University, 4eMolecules, Inc., 5Departments of Neurology and Physiology, University of California School of Medicine, San Francisco, 6Division of Molecular Therapeutics, New York Psychiatric Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowa metoda optycznego pomiaru neurotransmisji z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów dopaminy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ nerwowy przekazuje sygnały między neuronami poprzez uwalnianie neuroprzekaźników podczas fuzji pęcherzyków synaptycznych. Aby bezpośrednio obserwować pobieranie i uwalnianie neuroprzekaźników z poszczególnych zakończeń presynaptycznych, zaprojektowaliśmy fluorescencyjne fałszywe neuroprzekaźniki służące jako substraty dla transporterów monoamin pęcherzyków synaptycznych. Wykorzystując te sondy do obrazowania uwalniania dopaminy w prążkowiu, dokonaliśmy kilku obserwacji istotnych dla plastyczności synaptycznej. Stwierdzono, że frakcja pęcherzyków synaptycznych uwalniających neuroprzekaźnik na jeden bodziec była zależna od częstotliwości stymulacji. W tych warunkach eksperymentalnych nie zaobserwowano kinetycznie odrębnej populacji „rezerwowych” pęcherzyków synaptycznych. Wykazano zależną od częstotliwości heterogeniczność zakończeń presynaptycznych, która była częściowo zależna od receptorów dopaminowych D2, co wskazuje na mechanizm zależnego od częstotliwości kodowania selekcji presynaptycznej.

Hui Zhang i Niko G. Gubernator wnieśli równy wkład w tę pracę.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta została zastosowana w badaniu opisanym w pracy Gubernator et al., Science 324 (5933). 1441-1444 (2009).

1. Przygotowanie świeżych skrawków prążkowia

  1. Przed przygotowaniem ostrych skrawków prążkowia należy uprzednio natlenić sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ASCF) i chłodzić go w lodzie przez co najmniej 15 minut przed wyjęciem mózgu. Podczas sekcji ACSF musi pozostać lodowaty i natleniony. ACSF (w mM): NaCl 125, KCl 2.5, NaHCO3 26, CaCl2 2.4, MgSO4 1.3, KH2PO4 0.3, glukoza 10, HEPES 5; pH 7.3-7.4, 290-295 mOsm.
  2. Dokonać dekapitacji samca myszy bez znieczulenia.
  3. Wyjąć cały mózg z myszy i przymocować go do tacki wibrotomu umieszczonej na urządzeniu za pomocą kleju Krazy®Glue. Wyjęcie i zamocowanie mózgu musi zostać wykonane w ciągu 2 minut. W tym czasie należy dbać o to, aby ACSF był lodowaty i natleniony w celu zachowania żywotności tkanki.
  4. Wyciąć koronalne skrawki prążkowia o grubości 250μm w obrębie bregma +1.54 do +0.621. Uzyskane zostaną trzy pełne skrawki, które można następnie podzielić igłą na 6 połówek.
  5. Inkubować skrawki mózgu w natlenionym ACSF w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę przed wprowadzeniem sondy. Skrawki wykazują prawidłowe ładowanie FFN511 i pozostają aktywne do obrazowania do 4 godzin po przygotowaniu.

2. Załadunek FFN511

  1. Przygotować roztwór ładujący FFN511 (10μM FFN511 w ACSF); przygotować również 100μM ADVASEP-7 w ACSF. Wszystkie roztwory powinny być przygotowane na świeżo i napowietrzane przez co najmniej 15 minut przed wprowadzeniem do skrawków.
  2. Inkubować poszczególne skrawki w roztworze ładującym FFN511 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Następnie usunąć barwnik związany z tkanką pozakomórkową, inkubując załadowany skrawek w napowietrzonym roztworze ACSF z 100μM ADVASEP-7 przez 30 minut w temperaturze pokojowej2. Skrawki są teraz gotowe do obrazowania.

3. Obrazowanie FFN511 w przekrojach mózgu

Obrazowanie FFN511 w skrawkach wykonuje się przy użyciu wielofotonowego skaningowego mikroskopu laserowego. Stosujemy wielofotonowy skaningowy mikroskop laserowy Prairie Ultima (wcześniej używaliśmy wielofotonowego skaningowego mikroskopu laserowego Zeiss LSM 510 NLO i niektóre wyniki uzyskano przy użyciu mikroskopu Zeiss).

  1. Umieść skrawek obciążony FFN511 w komorze rejestracyjnej (RC-27L, Warner) i perfunduj natlenionym ACSF z przepływem 1-2 ml na minutę. Następnie połóż na wierzchu skrawka platynową harfę z nylonowymi strunami, aby zminimalizować ruchy podczas eksperymentu. Aby dodatkowo ograniczyć przemieszczanie się preparatu, pozwól skrawkowi stabilizować się w komorze przez co najmniej 10 minut przed obrazowaniem.
  2. Zwizualizuj i zlokalizuj grzbietowe prążkowie, korzystając z luminescencji w polu jasnym pod obiektywem imersyjnym wodnym 10x.
  3. W przypadku przeprowadzania eksperymentu ze stymulacją, umieść i odpowiednio ustaw bipolarne skręcone elektrody wolframowe w tym obszarze. Idealny obszar obrazowania znajduje się w odległości 300 μm pomiędzy dwoma końcami stymulującej elektrody bipolarnej. Umieść ten obszar w centrum pola widzenia.
  4. Obrazuj terminale prążkowia znakowane FFN511 pod ultrafioletowym obiektywem imersyjnym wodnym 63x (0.9 NA). Pobudzenie FFN511 odbywa się przy 760 nm za pomocą lasera Mai Tai firmy Spectral Physics, a optymalna fluorescencja terminali prążkowia jest widoczna poprzez filtr pasmowy (480-520 nm). Obrazy są rejestrowane w formacie 12-bitowym z obszarami zainteresowania o wymiarach 75 x 75 μm przy rozdzielczości 512 x 512 pikseli. W eksperymentach z odbarwianiem indukowanym stymulacją, w celu skompensowania przesunięcia w osi z, dla każdego okresu czasu pozyskuje się serię z składającą się z 5-7 obrazów, oddzielonych od siebie o 1 μm w płaszczyźnie z.

4. Odbarwianie FFN511

Znacznik FFN511 można usunąć poprzez zastosowanie wysokiego stężenia KCl (stosujemy 70 mM KCl), siarczanu (+)-amfetaminy (AMPH, 20 μM) lub stymulację elektryczną. W eksperymencie z usuwaniem znacznika za pomocą KCl, po podaniu do skrawka mózgu roztworu ACSF o wysokiej zawartości potasu, znacznik FFN511 zostaje usunięty w ciągu 2 minut. Należy rejestrować obrazy xyz-t, aby śledzić proces usuwania FFN511 w czasie. Poniżej opisano usuwanie znacznika z zakończeń dopaminergicznych zależne od stymulacji elektrycznej:

  1. Aby monitorować odbarwianie FFN511 w czasie, rejestrowane są obrazy xyz-t. Aby zapewnić minimalny ruch skrawka (mniej niż 4 μm w osi z) oraz uniknąć fotobleachingu wywołanego przez laser, przed stymulacją należy uzyskać kontrolne serie czasowe obrazów stosu z przez co najmniej 5 minut. W przeciwnym razie należy skorygować moc lasera.
  2. Po wykonaniu tych obrazów kontrolnych należy kontynuować obrazowanie xyz-t, rozpoczynając stymulację z częstotliwością 1, 4 lub 20 Hz. Bodźce o częstotliwości 1, 4 lub 20 Hz (300 μs x 1 mA) są przyłożone lokalnie do prążkowia za pomocą izolatora stymulacji Iso-Flex wyzwalanego przez generator impulsów Master-8 (AMPI, Jerozolima, Izrael) z użyciem elektrod bipolarnych. Aby zminimalizować zmienność depolaryzacji miejsc uwalniania, zastosowano protokół stymulacji przy użyciu 150% maksymalnej intensywności stymulacji wyznaczonej za pomocą woltamperometrii cyklicznej.
  3. Do analizy obrazów należy użyć odpowiedniego oprogramowania. W naszym laboratorium używamy programu Image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) oraz autorskiego oprogramowania w języku IDL (Research Systems, Boulder, CO) do ilościowego określania fluorescencji puncta oraz zmian zachodzących w czasie3.

Reprezentatywne wyniki

Rycina 1 pokazuje, że ładowanie FFN511 do przekroju prążkowia zostało zakończone. Reprezentatywne obrazy z użyciem obiektywów 10x i 60x przedstawiono na Ryc. 1. Selektywne znakowanie zakończeń dopaminergicznych można usunąć za pomocą 20 μM amfetaminy.
Rycina 2 przedstawia usuwanie znakowania FFN511 za pomocą wysokiego stężenia KCl.
Rycina 3 przedstawia usuwanie znakowania FFN511 poprzez lokalną stymulację elektryczną.

Obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiające przekroje tkanki mózgowej z markerami białkowymi w różnych warunkach.
Rycina 1. FFN511 znakuje zakończenia dopaminergiczne w żywych ostrych skrawkach korowo-prążkowiowych. (A) Znakowanie za pomocą FFN511 w ostrym żywym skrawku korowo-prążkowiowym: obfite znakowanie w prążkowiu (STR), rzadsze znakowanie w korze (CTX) oraz brak znakowania w cielemwołkowym (CC). Pasek skali: 100 μm. (B) Wypłukiwanie FFN511 z prążkowia za pomocą amfetaminy. Panele lewe: przed podaniem amfetaminy; panele prawe: po 20 minutach działania 20 μM amfetaminy. Pasek skali: 10 μm.

Podwójne obrazy mikroskopowe porównujące struktury komórkowe: grupa kontrolna vs. wyniki po traktowaniu KCl.
Rysunek 2. Usuwanie oznakowania FFN511 przez wysokie stężenie KCl. Oznakowanie FFN511 zostaje usunięte w ciągu 2 min aplikacji 70 mM KCl w ACSF. Pasek skali: 10μm.

Eksperyment obrazowania wapnia pokazujący zanik fluorescencji w czasie; dołączono wykres intensywności w funkcji czasu.
Rysunek 3. Zależna od częstotliwości odbarwianie znakowania FFN511 w prążkowiu. (A) Lokalna stymulacja z częstotliwością 4 Hz doprowadziła do odbarwiania zakończeń. Stymulację rozpoczęto w czasie t = 0. Pasek skali: 5 μm. (B) Odbarwianie FFN511 przy 4 Hz jest zależne od Ca2+ oraz częstotliwości. Grupy kontrolne nie otrzymywały stymulacji (153 punkty z 3 skrawków). Odbarwianie w obecności chlorku kadmu (200 μM) było identyczne z niezstymulowanymi kontrolami (475 punktów z 5 skrawków). Krzywe odbarwiania dla każdej częstotliwości stymulacji dopasowano za pomocą funkcji pojedynczego wykładniczego zaniku, a wartości czasu połowicznego (t1/2) obliczono jako τ x 0,693 (1 Hz: 765 punktów z 9 skrawków, 4 Hz: 410 punktów z 7 skrawków, 20 Hz: 416 punktów z 6 skrawków). Prosimy zapoznać się z filmowym mikrografem z mikroskopii dwufotonowej przedstawiającym odbarwianie FFN511 podczas egzocytozy w preparacie skrawka mózgu z prążkowia.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym filmie prezentujemy metodę optycznej wizualizacji neurotransmisji z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów dopaminy. FFN511 jest pierwszą generacją opracowanych przez nas FFN. Chociaż został on zaprojektowany poprzez ukierunkowanie na neuronalny transporter monoamin pęcherzykowy (VMAT2), który transportuje neurotransmitery monoaminowe z cytoplazmy do pęcherzyków synaptycznych i specyficznie znakuje zakończenia dopaminergiczne w prążkowiu oraz domniemane zakończenia katecholaminergiczne i/lub serotonergiczne w korze (jak pokazano w publikacji w czasopiśmie Science), odpowiedni czas ładowania jest krytyczny dla specyficzności, ponieważ FFN511 jest stosunkowo hydrofobowy. Stwierdzono, że inkubacja trwająca dłużej niż 40 minut prowadzi do rozległego niespecyficznego barwienia w skrawkach prążkowia. Specyficzność można łatwo określić poprzez odbarwianie z użyciem wysokiego stężenia KCl, co powinno spowodować uwolnienie FFN z funkcjonalnych pęcherzyków synaptycznych. Ekspozycja skrawka na FFN511 przez mniej niż 15 minut skutkuje słabym sygnałem fluorescencyjnym z powodu niewystarczającego załadowania barwnika do zakończeń. W tym protokole stosujemy 100μM ADVASEP-7 w celu usunięcia barwnika związanego z tkanką pozakomórkową. Krok ten nie jest niezbędny, ale w przypadku jego pominięcia czas wypłukiwania w ACSF musi zostać wydłużony. Podsumowując, w zależności od wybranego preparatu, konieczna będzie modyfikacja stężenia i czasu ładowania w celu ustalenia optymalnego znakowania.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D. Sames dziękuje fundacji The G. Harold & Leila Y. Mathers Charitable Foundation oraz programom Columbia University's Initiatives in Science and Engineering.
D. Sames i D. Sulzer dziękują fundacji McKnight Foundation za przyznanie The McKnight Technological Innovations in Neuroscience Award
D. Sulzer dziękuje NIDA, NIMH oraz fundacjom Picower i Parkinson's Disease Foundations.
H. Zhang dziękuje NARSAD.
R.H. Edwards dziękuje fundacji Michael J. Fox Foundation, National Parkinson Foundation, NIDA oraz NIMH.
Dziękujemy Robertowi Burke’owi za iniekcje 6-OHDA i porady, Markowi Sondersowi za pomocne dyskusje, Merekowi Siu za programowanie analizy obrazowania oraz Janowi Schmoranzerowi za wsparcie techniczne przy konfiguracji mikroskopii TIRF.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)Columbia University - Dalibor Sames Lab
ADVASEP-7 CyDexAR-OA7-005
Komora rejestracyjna RC-27LWarner Instruments64-0375
Uchwyt 6-dołkowy PELCO PrepEzeTed Pella, Inc.36157-1Do inkubacji skrawków
Stymulator impulsowy Master-8 oraz izolator stymulacji Iso- FlexAMPI

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
  2. Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
  3. Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescencyjne fa szywe neuroprzeka nikifuzja p cherzyk w synaptycznychbarwienie FFN 511mikroskopia wielofotonowastymulacja elektrycznadepolaryzacja chlorkiem potasuheterogeniczno zale na od cz stotliwo cireceptory dopaminy D2

Powiązane artykuły