Artykuł metodologiczny

Immunofluorescencyjna detekcja dwóch analogów tymidyny (CldU i IdU) w tkance pierwotnej

34.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2166

⸱

7 grudnia 2010

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Endocrinology and Diabetes, Children’s Hospital of Philadelphia, Institute of Diabetes Obesity and Metabolism, Institute for Regenerative Medicine, Department of Pediatrics, University of Pennsylvania-School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy strategię wykrywania sekwencyjnego wbudowywania analogów tymydyny (CldU i IdU) w tkanki dorosłych myszy w celu ilościowego określenia dwóch następujących po sobie cykli podziałów komórkowych. Strategia ta jest przydatna do wykrywania wymiany komórkowej w tkankach długożyjących, transformacji onkogennej lub komórek wzmacniających przejście.

Streszczenie

Precyzyjny pomiar podziałów komórkowych jest fundamentalnym wyzwaniem w biologii eksperymentalnej, które staje się coraz bardziej złożone w przypadku analizy komórek dzielących się powoli. Uznane metody wykrywania podziałów komórkowych obejmują bezpośrednią wizualizację za pomocą ciągłej mikroskopii w hodowli komórkowej, rozcieńczanie barwników witalnych, takich jak karboksyfluoresceina diacetat succinimidylowa (CFSE), immunodetekcję antygenów mitogennych, takich jak ki67 lub PCNA, oraz zastosowanie analogów tymidyny. Analogi tymidyny można wykrywać za pomocą różnych metod, w tym radiodetekcji dla tymidyny tritiowanej, immunodetekcji dla bromo-deoksyurydyny (BrdU), chloro-deoksyurydyny (CldU) i jodo-deoksyurydyny (IdU) oraz detekcji chemicznej dla etynylo-deoksyurydyny (EdU). Opracowaliśmy strategię wykrywania sekwencyjnej inkorporacji różnych analogów tymidyny (CldU i IdU) do tkanek dorosłych myszy. Nasza metoda pozwala badaczom na precyzyjne ilościowe określenie dwóch kolejnych rund podziałów komórkowych. Dzięki optymalizacji protokołów immunobarwienia nasze podejście pozwala wykryć bardzo niskie dawki analogów tymidyny podawanych z wodą pitną, co jest bezpieczne dla myszy podczas długotrwałego stosowania. W konsekwencji nasza technika może być wykorzystywana do wykrywania wymiany komórkowej w tkankach o bardzo długim czasie życia. Optymalne wyniki barwienia immunofluorescencyjnego można uzyskać w wielu typach tkanek, w tym w trzustce, skórze, jelitach, wątrobie, nadnerczach, jądrach, jajnikach, tarczycy, węzłach chłonnych i mózgu. Zastosowaliśmy również tę technikę do identyfikacji transformacji onkogennej w tkankach. Ponadto wykorzystaliśmy tę metodę, aby ustalić, czy komórki wzmacniające przejście (transit-amplifying cells) przyczyniają się do wzrostu lub odnowy tkanek. W tym sensie sekwencyjne podawanie analogów tymidyny stanowi nowatorskie podejście do badania pochodzenia i przeżywalności komórek zaangażowanych w homeostazę tkanek.

Protokół

1. Markowanie tkanek za pomocą CldU i IdU

  1. Rozpuścić analogi tymidyny (CldU lub IdU) w wodzie. Odważyć 1mg/ mL każdego związku chemicznego i dodać do oddzielnych szklanych butelek z wodą destylowaną. Zazwyczaj przygotowujemy jednorazowo 1 litr każdego z nich.
  2. Rozpuścić związki chemiczne na mieszadle magnetycznym lub innym typie agitatora. CldU rozpuści się w ciągu 10 min mieszania w temperaturze pokojowej. IdU wymaga ponad godziny mieszania w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem. Źródło wody może wpływać na rozpuszczalność IdU. Jeśli IdU pozostanie nierozpuszczone po całonocnym wytrząsaniu, należy spróbować użyć czystszej wody. Roztwory przechowuje się w temperaturze 4°C w ciemności.
  3. Podać myszom pierwszy roztwór zawierający tymidynę (CldU lub IdU) przez pożądany okres znakowania. W okresie znakowania myszy nie mogą mieć dostępu do nieznakowanej wody. Po zakończeniu wyznaczonego okresu znakowania rozpocząć wypłukiwanie nieznakowaną wodą przez co najmniej 24 godziny (analogi zawierające tymidynę mają okres półtrwania w surowicy wynoszący kilka godzin). Podać myszom drugi roztwór zawierający tymidynę (CldU lub IdU) przez pożądany okres znakowania. Regularnie uzupełniać wodę w butelkach, aby zapobiec odwodnieniu!
  4. Alternatywnie myszy można znakować poprzez sekwencyjne wstrzykiwanie dootrzewnowe CldU, a następnie IdU. Przygotować CldU lub IdU w stężeniu 10mg/ mL. IdU może wymagać kroplowego dodawania stężonego roztworu wodorotlenku sodu, a następnie intensywnego wstrząsania w celu uzyskania zawiesiny. Nie należy dodawać nadmiaru wodorotlenku sodu. Dodać jedną kroplę wodorotlenku sodu do 10 mL roztworu IdU, a następnie mieszać przez godzinę w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem. Jeśli roztwór nie powstanie, powtórzyć dodawanie wodorotlenku sodu. Wstrzyknąć 100mcg na g masy ciała do jamy otrzewnej.
  5. Preparaty kontrolne są niezbędne w tym protokole. W związku z tym zdecydowanie zalecamy, aby badacze przeprowadzili kilka wariantów znakowania analogami tymidyny w celu zapewnienia czułości i swoistości. Powinny one obejmować: 1. myszy znakowane tylko CldU; 2. myszy znakowane tylko IdU; 3. myszy znakowane sekwencyjnie najpierw CldU, a następnie IdU; 4. myszy znakowane sekwencyjnie w odwrotnej kolejności, najpierw IdU, a następnie CldU; 5. myszy poddane pozornemu znakowaniu samą wodą. Podczas nauki znakowania CldU i IdU badacze powinni zawsze przeprowadzić cały protokół z wykorzystaniem wszystkich 5 powyższych zestawów preparatów kontrolnych z badanej tkanki.

2. Pobieranie tkanek, utrwalanie i przygotowanie preparatów

  1. Stosując odpowiedni środek znieczulający, podaj dawkę letalną, a następnie poświęć mysz poprzez upuszczenie krwi. Pobierz świeżą tkankę i utrwal ją w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Przenieś tkankę do buforu z formaliną w stosunku 1:4 i przechowuj w temperaturze 4°C do czasu zatopienia w parafinie.
  2. Alternatywnie, podaj dawkę letalną, a następnie przeprowadź perfuzję myszy przez lewą komorę serca roztworem soli fizjologicznej, aż krew zostanie usunięta z organizmu; następnie natychmiast przeprowadź perfuzję 30-50 cc 4% paraformaldehydu. Pobierz interesujące tkanki i przechowuj je w buforze z formaliną w stosunku 1:4 w temperaturze 4°C do czasu zatopienia w parafinie.
  3. Po odwodnieniu tkanki i zatopieniu w parafinie, wykonaj skrawki tkankowe o grubości 5 mikronów i umieść je na szkiełkach nabłonionych. Wypiecz szkiełka w temperaturze 65°C przez 16 godzin, aby zapewnić przyleganie tkanki do szkiełka (jest to niezbędne przy poniższych etapach odzyskiwania antygenu).

3. Dehydratacja, permeabilizacja i odsłanianie antygenów

  1. Usuń nadmiar parafiny, zanurzając preparaty w dwóch kąpielach w ksylenie po 5 min. każda.
  2. Rehydratuj tkankę, zanurzając preparaty w etanolu rozcieńczonym wodą: 100, 95, 90, 80, 70 i 50%. Mocz preparaty przez 3 min. przy każdym stężeniu, zaczynając od 100% i kończąc na 50% przy ostatnim zanurzeniu.
  3. Przemyj preparaty przez 5 min. w 1x PBS.
  4. Przeprowadź permeabilizację komórek, zanurzając preparaty w 0,2% roztworze Triton-X na 5 min. (roztwór przygotowywany na świeżo przed każdym użyciem).
  5. Przygotuj preparaty do mikrofalowej odnowy antygenowej tkanki. Umieść preparaty w zlewce szklanej z odpowiednią ilością buforu cytrynianowego sodu 0,01M pH 6,0, tak aby roztwór przykrywał preparaty warstwą 5 cm powyżej ich górnej krawędzi, aby zrekompensować straty wynikające z parowania.
  6. Naświetlaj preparaty w mikrofalówce, aż roztwór zacznie wrzeć (3-10 min. przy pełnej mocy). Zmniejsz moc do poziomu, przy którym roztwór będzie powoli wrzał (10-80%) i kontynuuj proces przez kolejne 20 min. Okresowo sprawdzaj mikrofalówkę, aby upewnić się, że roztwór powoli wrze.
  7. Postaw zlewkę z preparatami na blacie i pozwól im powoli ostygnąć do temperatury pokojowej (około 2 godziny).
  8. Używając termometru, potwierdź, że preparaty osiągnęły temperaturę pokojową.
  9. Zanurz preparaty w 1,5N HCL na 40 min. w temperaturze pokojowej.
  10. Przemyj preparaty dwukrotnie w 1X PBS, po 5 min. na każde przemycie.

4. Przeciwciała pierwotne i wtórne

  1. Ważne jest, aby preparaty pozostały bardzo wilgotne przez cały protokół. Wysuszona tkanka będzie wykazywać znacznie silniejszą autofluorescencję, co sprawi, że uzyskane obrazy będą nieużyteczne. Aby zapobiec wysychaniu, należy przetwarzać jeden preparat naraz.
  2. Obrysuj każdy przekrój na preparatach za pomocą płynnego pisaka blokującego (np. woskowego). Umieść preparaty z powrotem w pojemniku z 1x PBS.
  3. Przygotuj wilgotną komorę inkubacyjną, kładąc mokre ręczniki papierowe płasko na dnie szczelnego plastikowego pojemnika.
  4. Przygotuj roztwór blokujący z 10% serum osła rozcieńczonego w 1x PBS. Ważne jest, aby całkowicie pokryć każdy przekrój roztworem. Dla przekrojów tkankowych o wymiarach 1 x 1,5 cm wystarczająca jest objętość 50 µL roztworu na przekrój.
  5. Dodaj roztwór blokujący do preparatów. Wyjmij preparat z 1x PBS i usuń nadmiar cieczy, delikatnie stukując krawędź preparatu o stos suchych ręczników papierowych. Umieść preparat w komorze inkubacyjnej i dodaj 50 µL 10% roztworu blokującego do każdego przekroju. Po przygotowaniu wszystkich preparatów zamknij pojemnik i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  6. Przygotuj rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego do wykrywania IdU. Rozcieńcz mysie anty-BrdU w stosunku 1:250 w 5% serum osła w 1x PBS. Odlej roztwór blokujący z preparatu i umieść go z powrotem w komorze inkubacyjnej. Dodaj powyższe przeciwciało pierwszorzędowe do każdego przekroju i inkubuj przez noc w temperaturze 4°C.
  7. Przygotuj płukanie o wysokiej rygorystyczności (które minimalizuje wiązanie antysera mysiego anty-BrdU z CldU). Przygotuj świeży bufor TBST o niskiej zawartości soli (36mM Tris, 50mM NaCl, 0,5% tween-20; pH 8,0). Będziesz potrzebować 40 mL buforu na parę preparatów. Dodaj 40 mL buforu do każdej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Przed dodaniem preparatów podgrzej roztwór do 37°C.
  8. Wyjmij preparaty z komory inkubacyjnej po dwa, połóż je plecami do siebie (tak, aby próbki tkanki były zwrócone od siebie) i odlej nadmiar przeciwciała pierwszorzędowego. Umieść preparaty w probówkach wypełnionych TBST o niskiej zawartości soli i przykryj. Agituj probówki przez 20 min w inkubatorze do kultur bakterii z wytrząsaniem, w temperaturze 37°C i przy prędkości ustawionej na 225 rpm.
  9. Przepłucz preparaty dwa razy w świeżym 1X PBS. 5 min na każde płukanie.
  10. Przygotuj kolejny roztwór przeciwciała pierwszorzędowego do wykrywania CldU oraz antygenu tkankowego, jeśli jest to wymagane. Rozcieńcz szczurze anty-BrdU w stosunku 1:250 w 5% serum osła w 1x PBS. Rozcieńcz antysera pierwszorzędowe przeciwko antygenowi tkankowemu do stężenia roboczego w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych.
  11. Odlej nadmiar 1x PBS z preparatów i umieść je w komorze inkubacyjnej. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe do każdego przekroju i inkubuj przez noc w temperaturze 4°C.
  12. Przepłucz preparaty dwa razy w świeżym 1X PBS. 5 min na każde płukanie.
  13. Przygotuj roztwór przeciwciał wtórnych. Rozcieńcz Cy2 osie anty-szczur w stosunku 1:250 i Cy5 osie anty-mysie w stosunku 1:500 w roztworze 1X PBS zawierającym 5% serum osła. Dodaj wtórne przeciwciało Cy3 do wykrycia gatunku pierwszorzędowego antyserum przeciwko antygenowi tkankowemu. Rozcieńcz również roztwór zapasowy DAPI o stężeniu 0,4 mg/mL w stosunku 1:150 w roztworze przeciwciał wtórnych.
  14. Odlej nadmiar 1X PBS z preparatów i umieść je w komorze inkubacyjnej. Dodaj roztwór przeciwciał wtórnych do każdego przekroju i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  15. Przepłucz preparaty dwa razy w świeżym 1X PBS. 5 min na każde płukanie.
  16. Odlej nadmiar 1X PBS z preparatów i przytwierdź szkiełko przykrywowe za pomocą medium montażowego Prolong Gold anti-fade (NIE używaj Vectashield z barwnikami dyaninowymi!). Dociśnij szkiełka przykrywowe, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Przechowuj w temperaturze 4°C.

5. Obrazowanie i analiza

  1. Obrazować badaną tkankę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w wysokoenergetyczne źródło światła, obiektywy plan-apochromatyczne oraz wysokowydajną kamerę mikroskopową (np. Hamamatsu Orca ER). Pozyskać obrazy w kanałach AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (antygen tkankowy) i Cy5 (IdU). Połączyć obrazy w celu utworzenia pojedynczego wielowarstwowego pliku obrazu.
  2. Przy prawidłowym wykonaniu jądra barwione DAPI będą jednorodnie jasne. Antygen tkankowy (np. insulina) powinien ujawnić komórki zainteresowania. Jeśli barwienie DAPI lub antygenem tkankowym jest słabe lub niespójne, zanurzyć preparat w 1X PBS na noc, aby usunąć szkiełko nakrywne, a następnie powtórzyć aplikację przeciwciał wtórnych.
  3. Ustawić ostrość na antygen tkankowy w kanale Cy3. Sprawdzić barwienie CldU i IdU w kanałach Cy2 i Cy5, przełączając się między kanałami. Poszukać potencjalnej reaktywności krzyżowej między markerami, objawiającej się nadmierną ko-pozytywnością IdU i CldU. Poszukać tkanek zawierających wyłącznie CldU lub IdU. Brak jąder pozytywnych pod kątem CldU lub IdU może wskazywać na problem techniczny z etykietowaniem lub barwieniem. W takim przypadku należy poszukać tkanki o wysokiej aktywności replikacyjnej (np. węzła chłonnego).
  4. Przeanalizować obrazy. Wyświetlić warstwy zawierające DAPI i antygen tkankowy. Używając markera do tablic w ręce dominującej oraz licznika komórek w ręce niedominującej, oznaczyć każde jądro kontrastującym znakiem za pomocą markera suchościeralnego (tzw. markera do tablic). Policzyć komórki pozytywne pod kątem DAPI w badanej tkance. Zapisać całkowitą liczbę komórek. Usunąć oznaczenia za pomocą gumki do suchościerania. Wyświetlić warstwy zawierające DAPI, antygen tkankowy i CldU. Policzyć komórki pozytywne pod kątem CldU w badanej tkance. Zapisać liczbę komórek CldU, ale nie usuwać oznaczeń. Zmienić wyświetlanie, aby zwizualizować warstwy zawierające antygen tkankowy, CldU i IdU. Policzyć komórki podwójnie pozytywne pod kątem CldU i IdU. Zapisać wartość, usunąć wszystkie oznaczenia i wyświetlić warstwy zawierające DAPI, antygen tkankowy i IdU. Policzyć całkowitą liczbę komórek pozytywnych pod kątem IdU w badanej tkance. Zapisać liczbę komórek IdU.

6. Reprezentatywne wyniki

Myszy żeńskie w wieku 6 tygodni znakowano sekwencyjnie CldU przez jeden tydzień, a następnie IdU przez dwa tygodnie, po czym niezwłocznie poddano je utylizacji. Trzustki barwiono w celu wykrycia CldU, IdU i insuliny (antygen tkankowy), a także DAPI. Wyspy były jednorodnie zabarwione na insulinę. Jądra zabarwione CldU były odróżnialne od jąder zabarwionych IdU (Rycina 2). Wiele jąder poza obrębem wyspy było współdodatnich dla CldU i IdU (Rycina 2, prawy dolny róg, białe strzałki). Pojedyncza komórka dodatnia pod względem insuliny wykazywała barwienie jądra zarówno dla CldU, jak i IdU (Rycina 2, prawy dolny róg, purpurowa strzałka).

Myszy. Wszystkie eksperymenty z udziałem myszy przeprowadzono zgodnie z wytycznymi komitetu IACUC Szpitala dla Dzieci w Filadelfii (Children's Hospital of Philadelphia). Samice myszy typu dzikiego B6.129 F1 zakupiono w firmie Taconic (Germantown, Nowy Jork); myszy przetrzymywano w jednostce doświadczalnej Szpitala dla Dzieci w Filadelfii i karmiono dietą dla myszy Mouse Diet 5015 z firmy PMI Nutrition International (Richmond, Indiana).

Strategia znakowania. Poprzez znakowanie pierwszego zdarzenia podziału komórki CldU (oznaczone na zielono na tym schemacie) oraz drugiego podziału komórki IdU (oznaczone na czerwono na tym schemacie), sekwencyjne podziały komórkowe prowadzą do powstania komórek współznakowanych zarówno CldU, jak i IdU (zielony/czerwony).

Reprezentatywne wyniki znakowania tymidyną w celu oceny obrotu komórek trzustki u myszy. Obraz immunofluorescencyjny trzustki mysiej z wyspą Langerhansa w centrum. Myszy podawano CldU przez 1 tydzień, a następnie IdU przez 2 tygodnie w wodzie pitnej przed natychmiastowym ubojem. Próbkę trzustki przetworzono zgodnie z opisem w protokole. Obrazy wykonane obiektywem 40x, z wyświetlonymi wyraźnymi warstwami odpowiednimi do liczenia. Obrazy scalone zawierają DAPI (biały), CldU (zielony), IdU (czerwony) oraz insulinę (żółty). (góra, lewo) DAPI i insulina. (góra, prawo) CldU i insulina. (dół, lewo) IdU i insulina. (dół, prawo) CldU, IdU i insulina. Pasek skali: 100μm.

figure-protocol-1
Rycina 1. Strategia znakowania. Poprzez znakowanie pierwszego podziału komórki CldU (oznaczone na zielono na tym schemacie) i drugiego podziału IdU (oznaczone na czerwono na tym schemacie), sekwencyjne podziały prowadzą do powstania komórek podwójnie znakowanych zarówno CldU, jak i IdU (zielony/czerwony).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki znakowania tymidyną obrotu komórek trzustki u myszy. Obraz immunofluorescencyjny trzustki myszy z wysepką Langerhansa w centrum. Myszy podawano CldU przez 1 tydzień, a następnie IdU przez 2 tygodnie w wodzie pitnej przed natychmiastowym uśmierceniem. Próbkę trzustki przetworzono zgodnie z opisem w protokole. Obrazy wykonane obiektywem 40x, z wyświetlonymi wyraźnymi warstwami odpowiednimi do liczenia. Obrazy scalone zawierają DAPI (biały), CldU (zielony), IdU (czerwony), insulinę (żółty). (góra, lewo) DAPI i insulina. (góra, prawo) CldU i insulina. (dół, lewo) IdU i insulina. (dół, prawo) CldU, IdU i insulina. Pasek skali: 100μm.

Dyskusja

Nasze podejście do znakowania wymiany komórkowej oparte na tymidynie ma wiele potencjalnych zastosowań w badaniach biomedycznych. Do tej pory koncentrowaliśmy się na trzustce, ale zastosowaliśmy tę strategię również do badania wymiany komórkowej w skórze, jelitach, wątrobie, nadnerczach, nerkach, jądrach, jajnikach, tarczycy, węzłach chłonnych, hematopoezie oraz mózgu 1. Ponieważ tempo wymiany komórkowej różni się w zależności od tkanki, strategie znakowania powinny być dostosowane w celu uzyskania najbardziej przekonujących informacji z badanego organu. Morrison i współpracownicy stosowali CldU i IdU przez 1 dzień każdy, aby znakować hematopoezę 2. Kuhn i współpracownicy stosują CldU i IdU przez 4 dni każdy, aby wykryć podziały komórkowe w regenerującym się mięśniu sercowym 3. W przeciwieństwie do nich, my stosowaliśmy CldU i IdU przez łącznie do 9 miesięcy, aby znakować wymianę komórek podstawnych w wysepkach trzustkowych, czyli w tkance o minimalnej wymianie komórkowej wraz z wiekiem zwierzęcia 1,4-6. Najbardziej oczywistym potencjalnym zastosowaniem naszej strategii znakowania są badania mające na celu określenie wymiany komórkowej w ramach homeostazy tkankowej. Jednak nasza technika ma kilka innych potencjalnych zastosowań. Na przykład niedawno zastosowaliśmy tę metodę do identyfikacji transformacji onkogennej w tkankach, gdzie ogniskowe obszary zwiększonej replikacji można łatwo zidentyfikować poprzez zwiększone wbudowanie CldU lub IdU 5. Morrison i współpracownicy wykorzystali CldU i IdU przez 1 dzień każdy, aby przetestować zdolność do zatrzymywania znacznika przez hematopoetyczne komórki macierzyste 2. Zastosowaliśmy również sekwencyjne znakowanie analogami tymidyny, aby określić, czy komórki przejściowo amplifikujące przyczyniają się do wzrostu lub odnowy tkanek 1. W tym zastosowaniu sekwencyjna administracja analogów tymidyny stanowi nowatorskie podejście do badania pochodzenia i przeżywalności komórek zaangażowanych w homeostazę tkankową.

Analogów tymidyny nie należy stosować bez zachowania ostrożności. Syntetyczne analogi tymidyny mogą wykazywać toksyczność wobec dzielących się komórek, a ich zastosowanie mogłoby teoretycznie upośledzić wymianę komórkową u rosnących zwierząt. Analogi tymidyny były stosowane jako środki radiouczulające u pacjentów z nowotworami i mogą spowalniać wymianę komórkową. Dlatego zachęcamy badaczy do uważnego sprawdzania potencjalnej toksyczności w analizowanych tkankach. Na przykład Trumpp i współpracownicy odkryli, że systemowe podawanie BrdU może wymusić wejście komórek macierzystych krwi w cykl komórkowy 7. Z kolei Rutter i współpracownicy zaobserwowali, że wysokie dawki analogów tymidyny są toksyczne dla rozwijającej się trzustki 8. Niedawno Hellerstein i współpracownicy z firmy KineMed, Inc. ustalili, za pomocą zastrzeżonej techniki znakowania wodą ciężką, że podawanie BrdU spowalnia proliferację wewnątrzwysepkową o 16-25% 9. Preparaty całych wysepek stosowane przez Hellersteina i współpracowników zawierały wiele innych typów komórek endokrynnych i nieendokrynnych, które mogły stanowić nawet 50% całkowitej masy preparatów wysepek. Jednakże stwierdziliśmy, że przedłużona infuzja BrdU nie wpływa na proliferację komórek beta u młodych dorosłych myszy, co zmierzono poprzez ekspresję ki67 4. Podobnie długotrwałe podawanie CldU i IdU nie wydaje się upośledzać zwiększania masy komórek beta 1. Co więcej, tempo proliferacji komórek beta jest porównywalne u myszy znakowanych BrdU przez długi czas oraz u myszy znakowanych tylko przez kilka godzin (tempo zostało znormalizowane do odpowiadających sobie okresów czasu). Wspólnie wyniki te sugerują, że myszy mogą bezpiecznie znosić długotrwałe podawanie małych dawek analogów tymidyny. Niemniej jednak nie możemy wykluczyć potencjalnej toksyczności analogów tymidyny w odniesieniu do wzrostu komórek beta trzustki. W konsekwencji nadal przeprowadzamy kontrole podczas znakowania myszy analogami tymidyny i zachęcamy innych badaczy, aby również tak postąpili.

Nasza technika sekwencyjnego znakowania analogami tymidyny nie jest wolna od problemów i wyzwań technicznych. W związku z tym szczególnie istotne są preparaty kontrolne. Przygotowaliśmy preparaty kontrolne składające się z różnych tkanek pochodzących od: 1.) myszy znakowanych wyłącznie CldU; 2.) myszy znakowanych wyłącznie IdU; 3.) myszy znakowanych sekwencyjnie najpierw CldU, a następnie IdU; 4.) myszy znakowanych sekwencyjnie w odwrotnej kolejności, najpierw IdU, a potem CldU; 5.) myszy poddanych znakowaniu pozorowanemu przy użyciu samej wody. Podczas nauki znakowania z użyciem CldU i IdU badacze powinni zawsze przeprowadzić cały protokół z wykorzystaniem wszystkich 5 powyższych zestawów preparatów z tkanek będących przedmiotem zainteresowania.

Niewielka reaktywność krzyżowa pomiędzy CldU a IdU jest niefortunną, lecz nieuniknioną wadą znakowania oboma analogami tymidyny. Technika z użyciem CldU i IdU opiera się na różnicach w powinowactwie antisera, które pierwotnie opracowano przeciwko BrdU u różnych gatunków (myszy i szczura). Nasz protokół, choć pracochłonny, został zaprojektowany tak, aby zminimalizować taką reaktywność krzyżową. W związku z tym zalecamy ostrożność badaczom rozważającym pominięcie poszczególnych kroków procedury. W szczególności napotkaliśmy problemy z antisera wtórnymi, które wykazują reaktywność krzyżową między myszą a szczurem. Można to zminimalizować poprzez zastosowanie antisera firmy Jackson, które są w pełni adsorbowane krzyżowo między myszą a szczurem.

Czasami nie udaje się wystarczająco wykryć wbudowania tymidyny. W takich przypadkach kluczowe jest użycie płytek kontroli pozytywnej, aby ustalić, który odczynnik lub etap nie zadziałał. Trudności wynikają zazwyczaj z wadliwych alikwotów antyserów, wyschniętych płytek lub niewystarczającej permeabilizacji jąder. Nie udało nam się skutecznie oznakować rozwijających się embrionów za pomocą IdU. Zatem nie wszystkie tkanki mogą być przepuszczalne dla IdU.

Na horyzoncie pojawiają się alternatywy dla CldU i IdU w podwójnym znakowaniu analogami tymidyny. EdU (5-etynyl-2'-deoksyurydyna) może służyć jako substrat w detekcji opartej na chemii klikowej katalizowanej miedzią 10,11. Metody detekcji EdU nie wymagają rozdzielania nici DNA, przez co są wysoce podatne na analizę metodą cytometrii przepływowej 12. EdU jest kompatybilne z BrdU, ale nie wykazuje z nim reaktywności krzyżowej 10. EdU było wykorzystywane do ilościowego określania wymiany komórek w różnych tkankach myszy, w tym w beta-komórkach trzustki 13, jelitowych komórkach L 14 oraz naskórku 15. EdU jest obecnie dość kosztowne (1000 USD za 500mg). Niemniej jednak detekcja EdU wydaje się być znacznie bardziej czuła niż detekcja BrdU 10. W związku z tym ekonomicznie uzasadnione może być połączenie EdU i BrdU zamiast CldU i IdU. Metoda ta mogłaby również pozwolić na detekcję trzech różnych rund podziałów komórkowych u myszy potrójnie znakowanych EdU, CldU i IdU.

Podsumowując, nasza technika sekwencyjnego znakowania analogami tymidyny jest nowatorskim podejściem do wykrywania obrotu komórkowego. Mamy nadzieję, że nasza metoda umożliwi innym naukowcom dokładniejszą kwantyfikację podziałów komórkowych i oczekujemy, że otworzy ona nowe paradygmaty w badaniach nad homeostazą tkankową.

Oświadczenia

Wszystkie eksperymenty z udziałem myszy przeprowadzono w jednostce doświadczalnej The Children's Hospital of Philadelphia zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Podziękowania

Wsparcie projektu zapewniły: JDRF, NIH (R01-DK081469), Commonwealth of Pennsylvania (grant Center for Excellence in Regenerative Medicine 4100043362), March of Dimes (Basil O'Connor Starter Scholar Research Award) oraz grant pilotażowy i wykonalności University of Pennsylvania DERC (DK19525).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-chloro-2-deoxyurydyna (CldU)MP Biomedicals0210547891
5-jodo-2-deoxyurydyna (IdU)MP Biomedicals0210035701
4% ParaformaldehydUSB Corp., Affymetrix19943
10% Buforowana formalinaFisher Scientific23-427-098
KsylenyVWR internationalEM-XX0060-4
Etanol, bezwodny (histologiczny)Fisher ScientificA405P-4
PBS, 10X koncentrat w proszkuFisher ScientificBP665-1
Triton –X-100Fisher ScientificBP151-500
Kwas solnyVWR internationalBDH3028-2.5LG
Normalne surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-121
Przeciwciało mysie anty-BrdUBD Biosciences347580
Szczurzy mab anty-BrdUAccurate Chemical & Scientific CorporationOBT0030
Cy2 osie anty-szczurzeJackson ImmunoResearch712-225-153W pełni adsorbowane przeciwciała wtórne od Jackson (minimalna reaktywność krzyżowa).
Cy5 osie anty-mysieJackson ImmunoResearch715-175-151Patrz powyżej
Szklane szkiełka przykrywoweSigma-AldrichC9056-1CS
Filtr YFPChroma Technology Corp.49003 ET EYFPRedukuje autofluorescencję w kanale Cy2
Filtr Cy3Chroma Technology Corp.49004 ET Cy3
Filtr Cy5Chroma Technology Corp.49006 ET Cy5
Kamera mikroskopowa ORCA ERHamamatsu Corp.C4742-95-12ERDoskonała detekcja fluoroforów
Reagent antyblaknący ProLong GoldInvitrogenP36930Nie używać Vectashield (toksyczny dla barwników cyjaninowych).

Bibliografia

  1. Teta, M. Growth and regeneration of adult Beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12 (5), 817-817 (2007).
  2. Kiel, M. J. Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU. Nature. 449 (7159), 238-238 (2007).
  3. Bersell, K., Arab, S., Haring, B., Kuhn, B. Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell. 138, 257-257 (2009).
  4. Rankin, M. M., Kushner, J. A. Adaptive Beta Cell Proliferation Is Severely Restricted with Advanced Age. Diabetes. , (2009).
  5. He, L. M. Cyclin D2 Protein Stability Is Regulated in Pancreatic Beta Cells. Mol Endocrinol. , (2009).
  6. Kushner, J. A. Beta-cell growth: an unusual paradigm of organogenesis that is cyclin D2/Cdk4 dependent. Cell Cycle. 5 (3), 234-234 (2006).
  7. Teta, M. Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice. Diabetes. 54 (9), 2557-2557 (2005).
  8. Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1118 (2008).
  9. Van Nest, G., Raman, R. K., Rutter, W. J. Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development. Dev Biol. 98 (2), 295-295 (1983).
  10. Githens, S., Pictet, R., Phelps, P., Rutter, W. J. 5-bromodeoxyuridine may alter the differentiative program of the embryonic pancreas. J Cell Biol. 71 (2), 341-341 (1976).
  11. Walther, B. T., Pictet, R. L., David, J. D., Rutter, W. J. On the mechanism of 5-bromodeoxyuridine inhibition of exocrine pancreas differentiation. J Cell Biol. 249 (6), 1953-1953 (1974).
  12. Chen, S. Measurement of pancreatic islet cell proliferation by heavy water labeling. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (5), E1459-E1459 (2007).
  13. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2415 (2008).
  14. Best, M. D. Click chemistry and bioorthogonal reactions: unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules. Biochemistry. 48 (28), 6571-6571 (2009).
  15. Buck, S. B. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44 (7), 927-927 (2008).
  16. Huising, M. O. CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 912-912 (2008).
  17. Reimann, F. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metab. 8 (6), 532-532 (2008).
  18. Doupe, D. P., Klein, A. M., Simons, B. D., Jones, P. H. The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate. Dev Cell. 18 (2), 317-317 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Barwienie Cldu Iduanaliza podzia w kom rkowychprzygotowanie przekroj w tkankowychprotok odmaskowywania antygen winkubacja z przeciwcia em pierwszorz dowymbarwienie przeciwcia em drugorz dowymobrazowanie za pomoc mikroskopii fluorescencyjnejliczenie kom rek podw jnie dodatnich

Powiązane artykuły