Pirofosforany inozytolu odgrywają istotną rolę w patologiach ludzkich, takich jak nowotwory, cukrzyca i otyłość; jednak dokładny mechanizm ich działania pozostaje kwestią sporną. Brak komercyjnie dostępnych pirofosforanów inozytolu sprawia, że szczegółowe badania są problematyczne. W niniejszej pracy opisujemy prosty protokół produkcji i izolacji miligramowych ilości pirofosforanów inozytolu.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie wysokiej jakości pirofosforanów inozytolu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mio-inozytol występuje w naturze w formie niezmodyfikowanej lub w postaci bardziej złożonych pochodnych fosforylowanych. Spośród tych ostatnich, dwiema najliczniej występującymi w komórkach eukariotycznych są inozytolopentakisfosforan (IP5) oraz inozytolheksakisfosforan (kwas fitowy lub IP6). IP5 i IP6 są prekursorami cząsteczek pirofosforanów inozytolu, które zawierają jedno lub więcej wiązań pirofosforanowych1. Fosforylacja IP6 prowadzi do powstania difosfoinozytolopentakisfosforanu (IP7 lub PP-IP5) oraz bisdifosfoinozytoltetrakisfosforanu (IP8 lub (PP)2-IP4). Pirofosforany inozytolu wyizolowano ze wszystkich dotychczas przebadanych organizmów eukariotycznych. Ponadto dwie odrębne klasy enzymów odpowiedzialnych za syntezę pirofosforanów inozytolu są wysoce konserwowane w toku ewolucji2-4.
Kinazy IP6 (IP6Ks) wykazują ogromną elastyczność katalityczną, przekształcając odpowiednio IP5 i IP6 w PP-IP4 oraz IP7, a następnie, wykorzystując te produkty jako substraty, wspomagają generowanie bardziej złożonych cząsteczek5,6. Niedawno zidentyfikowano drugą klasę enzymów generujących pirofosforany w postaci białka drożdżowego VIP1 (zwanego również PP-IP5K), które jest zdolne do przekształcania IP6 w IP7 oraz IP87,8.
Pirofosforany inozytolu regulują wiele różnych procesów komórkowych, takich jak sekrecja insuliny9, długość telomerów10,11, chemotaksja12, transport pęcherzykowy13, homeostaza fosforanów14 oraz uwalnianie białka gag HIV-115. Dla tej klasy cząsteczek zaproponowano dwa mechanizmy działania. Mogą one wpływać na funkcje komórkowe poprzez allosteryczne oddziaływanie ze specyficznymi białkami, takimi jak AKT16. Alternatywnie, grupa pirofosforanowa może przekazać grupę fosforanową białkom uprzednio ufosforylowanym17. Ogromny potencjał tej dziedziny badań jest ograniczany przez brak komercyjnego źródła pirofosforanów inozytolu, co uniemożliwia wielu naukowcom badanie tych cząsteczek oraz tej nowej modyfikacji potranslacyjnej. Metody obecnie dostępne do izolacji pirofosforanów inozytolu wymagają zaawansowanej aparatury chromatograficznej18,19. Procedury te wykorzystują warunki kwasowe, które mogą prowadzić do degradacji pirofosforanów inozytolu20, a tym samym do niskiej wydajności odzysku. Ponadto uciążliwe procedury odsalania po kolumnie ograniczają ich zastosowanie do wyspecjalizowanych laboratoriów.
W niniejszym badaniu opisujemy prostą metodę generowania, izolacji i oczyszczania produktów reakcji kinazy IP6 oraz kinaz PP-IP5. Metoda ta stała się możliwa dzięki zdolności elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) do rozdzielania silnie fosforylowanych polifosforanów inozytolu20. Po przeprowadzeniu reakcji enzymatycznych IP6K1 i PP-IP5K z użyciem IP6 jako substratu, wykorzystano PAGE do rozdzielenia powstałych pirofosforanów inozytolu, które następnie eluowano w wodzie.
Protokół
1. Reakcja enzymatyczna - dzień 1 (1 godzina po południu)
- Pierwszym krokiem jest przygotowanie 10-20 niezależnych reakcji enzymatycznych, w których IP6K1 lub VIP1 przekształcają IP6 w izoformy pirofosforylowane.
- Stosujemy enzymy His-IP6K1 i GST-Vip1 oczyszczone z E. coli zgodnie z wcześniej opisanym protokołem17,18.
- Przygotować reakcje o objętości 50 μL zawierające 1X bufor reakcyjny (30 mM Hepes pH 6.8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO4, 1 mM DTT), 6 mM fosfokreatynę (PCr), 25 U/mL kinazę kreatynową (CPK), 5 mM ATP (sól Mg), 0.3 mM IP6 oraz 0.05-0.1 μg His-IP6K1 lub GST-Vip1. Objętość uzupełnić wodą ddH2O MiliQ.
- Krótko odwirować reakcję i inkubować w 37°C przez noc przy jednoczesnym obracaniu.
2. Odlewanie i załadunek żelu poliakrylamidowego - dzień 2 (4 godziny po południu)
- Żel poliakrylamidowy przygotowuje się przy użyciu szklanych płytek o długości 24 cm i szerokości 18 cm oraz przekładek o szerokości 1,5 mm. Zazwyczaj stosuje się grzebień 16-dołkowy lub preparatywny grzebień jednoślizgowy.
- Przygotować mieszaninę (50 mL/żel) zawierającą: 35,5% (w/v) akryloamidu:bis-akryloamidu 19:1, 1X Tris/Borat/EDTA (TBE), 0,05% (w/v) persiarczanu amonu (APS), 0,05% (w/v) Temed. Wlać mieszaninę pomiędzy wcześniej przygotowane szklane płytki, włożyć grzebień i pozostawić do polimeryzacji na 30-60 minut w RT.
- Po spolimeryzowaniu żelu przenieść aparat do pomieszczenia chłodniczego i przeprowadzić wstępny rozbieg w 1X TBE przez około 30-60 minut przy napięciu 200-300 V.
- Do każdej reakcji dodać 1X barwnika OrangeG (10 mM Tris-HCl pH7.0, 1 mM EDTA, 30% glicerolu, 0,1% OrangeG). Przygotować próbkę zawierającą 2 nmol IP6 do naniesienia jako kontrolę standardową.
- Każdy dołek dokładnie wypłukać buforem do elektroforezy za pomocą strzykawki z igłą 21G, aby usunąć wszelkie osady, a następnie nanieść próbki na żel. Unikać nakładania próbek do bocznych dołków.
- Elektroforezę prowadzić przez noc przy napięciu 450-550 V (7 mAmp/żel), aż prążek barwnika OrangeG znajdzie się w obrębie ostatnich 10 cm od dołu żelu.
3. Izolacja IP7 - dzień 3 (4 godziny) i dzień 4 (6-7 godzinny proces suszenia w SpeedVac)
- Zdemontować aparat do elektroforezy żelowej i ostrożnie wyjąć jedną płytkę szklaną, pozostawiając żel na drugiej. Wyciąć niewielki fragment żelu od miejsca tuż nad prążkiem barwnika OrangeG do dołu, obejmujący standard IP6 oraz jedną ścieżkę z próbką, zgodnie z Rysunkiem 1.
- Przebarwić wycięty fragment żelu błękitem toluidyny (0,1% (w/v) błękitu toluidyny, 20% (w/v) metanolu, 2% (w/v) glicerolu) przez kilka minut (1-3 min) lub do momentu pojawienia się prążka pirofosforanu inozytolu. Nałożyć wcześniej zdjętą płytkę szklaną z powrotem na wierzch żelu, aby zapobiec wysychaniu niebarwionego fragmentu żelu.
Prążek IP7 powinien być widoczny, ponieważ wędruje nieco wolniej niż standard IP6. ATP, który wędruje szybciej niż IP6, również powinien być widoczny (Rysunek 1). Przenieść zabarwioną część żelu do roztworu odbarwiającego (20% (w/v) metanolu) na kilka minut, wypłukać nadmiar błękitu toluidyny i umieścić żel ponownie obok żelu niezabarwionego.
Jeśli wymagana jest wizualizacja wyższych izoform pyrofosfororylowanego inozytolu (IP8 i IP9), należy barwić żel roztworem błękitu toluidyny przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy wypłukać błękit toluidyny, używając roztworu odbarwiającego przez około 15 minut.
- Za pomocą żyletki wyciąć prążek IP7 z niebarwionej części żelu, opierając się na pozycji migracji IP7 wyznaczonej na żelu barwionym (Rysunek 1).
- Wycięty z żelu prążek IP7 umieścić w probówce o pojemności 15 mL i dodać 10 mL wody MilliQ ddH2O. Probówki inkubować w rotatorze przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odlać ciecz, aby usunąć nadmiar TBE oraz mikroskopijne cząstki akrylamidu.
- Następnie przeprowadzić dwa cykle dehydratacji i rehydratacji. Do probówki z kawałkiem żelu zawierającego IP7 dodać 5 mL 50% (w/v) metanolu i rotować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Przenieść fragment żelu do nowej probówki 15 mL zawierającej 5 mL wody MilliQ ddH2O i rotować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Nie wylewać metanolu ani wody MilliQ H2O z probówek. Powtórzyć cykl dehydratacji i rehydratacji jeszcze raz, ponownie przenosząc żel poliakrylamidowy do wcześniej użytych probówek 15 mL. Jedno z płukań można przeprowadzić przez noc.
- Aby skoncentrować eluowany IP7, odparować łącznie 10 mL cieczy (5 mL MilliQddH2O i 5 mL 50% (w/v) metanolu) za pomocą SpeedVac w temperaturze 60°C.
- Gdy próbki będą prawie suche, przenieść pozostałą ciecz (300-600 μl) do probówki wirówkowej 1,5 mL i wirować przez 2 minuty przy 5000 rpm.
- Zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki wirówkowej 1,5 mL; pozostawić dolne 20-30 μL, ponieważ mogą one zawierać cząstki akrylamidu.
- W razie potrzeby kontynuować proces suszenia w niepodgrzewanym SpeedVac. Odzysk IP7 jest drastycznie ograniczony, jeśli próbki całkowicie wyschną, dlatego należy przerwać proces suszenia, gdy objętość próbek osiągnie 100-300 μL.
4. Oznaczenie stężenia i czystości IP7.
- Użyć 2-5 μL odzyskanej próbki IP7 do elektroforezy w żelu PAGE, analogicznie do sekcji 2.2-2.5. W ramach standardu stężenia nanieść kilka rozcieńczeń IP6 (tj. 0,5, 1, 2, 4 nmol) oraz 4 nmol markera Poly-P. Po przeprowadzeniu elektroforezy izoformy pirofosforanów inozytolu należy zwizualizować poprzez barwienie i odbarwianie całego żelu roztworem błękitu toluidyny, zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 3.2 (Rysunek 2A).
- Po barwieniu błękitem toluidyny stężenia można określić poprzez skanowanie żelu i porównanie różnic w intensywności między IP6 a IP7, wykorzystując oprogramowanie do analizy obrazu, takie jak Image-J, jak pokazano na Rysunku 2B.
5. Reprezentatywne wyniki:
Preparatywną konwersję enzymatyczną IP6 do IP7 z wykorzystaniem enzymów IP6K1 i VIP1 można łatwo rozdzielić za pomocą analizy PAGE (Rycina 1). Naniesienie IP6 w celu kontroli wielkości wraz z barwieniem żelu błękitem toluidynowym umożliwia identyfikację pochodnych pyrophosforylowanych, ponieważ migrują one wolniej w zależności od liczby grup fosforanowych obecnych w pierścieniu inozytolu. Opisana powyżej procedura pozwala na łatwe oczyszczenie IP7. Analiza oczyszczonego pyrophosforanu inozytolu metodą PAGE wykazała czystość otrzymanego IP7 (Rycina 2A). Co ciekawe, izomer 1/3PP-IP5 produktu IP7 wytwarzanego przez VIP1 migruje nieco wolniej niż izomer 5PP-IP5 IP7 generowany przez IP6K1. Zastosowanie standardów IP6 pozwala na łatwe określenie stężenia oczyszczonego IP7 (Rycina 2B). Przed wykorzystaniem IP7 w dalszych eksperymentach można ocenić jego aktywność biologiczną
(Rycina 3). 5PP-IP5 inkubuje się z VIP1 oraz z fosfatazą IP7 DDP1 (dyfosfoinozytolopolifosforanową fosfohydrolazą). Rutynowo oczyszczony IP7 jest konwertowany do IP8 przez VIP1 oraz do IP6 przez DDP1 (Rycina 3).
Rycina 1: Barwienie PAGE błękitem toluidynowym i izolacja prążka IP7. Fragment żelu zawierający standard (IP6) został wycięty i zabarwiony roztworem błękitu toluidynowego. Trzy prążki reprezentują (od góry do dołu) IP7, IP6 oraz ATP. Zabarwiony fragment żelu został następnie dopasowany do pozostałej części żelu. Pozwala to na zlokalizowanie fragmentu żelu zawierającego IP7, który może zostać wycięty i poddany puryfikacji (przerywana ramka).
Rysunek 2: Analiza PAGE produktów reakcji IP6K1 i VIP1. A) Analiza IP6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) przy użyciu barwienia błękitem toluidynowym w celu oznaczenia stężenia IP7 oczyszczonego z reakcji IP6K1 (5PP-IP5) i VIP1 (1/3PP-IP5). B) Analiza wykresu rozrzutu w celu oznaczenia stężenia oczyszczonego IP7. Stężenia określono na podstawie intensywności prążków, obliczonej przy użyciu oprogramowania ImageJ, w porównaniu do wcześniej określonych ilości IP6. Oś X reprezentuje intensywność; oś Y reprezentuje stężenia wyrażone w nmol.
Rysunek 3: Analiza aktywności biologicznej IP7. Aby określić jakość oczyszczonego IP7, inkubowano 5PP-IP5 (IP7 wygenerowany przez IP6K1) z VIP1 lub z fosfatazą IP7 DDP1, a następnie produkty reakcji rozdzielono za pomocą PAGE. Barwienie DAPI i toluidyną wykazało oczekiwaną produkcję IP8 przez VIP1 oraz konwersję IP7 do IP6 przez DDP1.
Dyskusja
Zastosowanie pirofosforanów inozytolu w biochemii jest w znacznym stopniu ograniczone przez brak dostępności komercyjnej takich związków oraz niską czułość istniejących metod detekcji. Połączenie elektroforezy PAGE, która umożliwia rozdzielenie cząsteczek posiadających różną liczbę grup fosforanowych, oraz błękitu toluidyny (Rycina 1), barwnika metachromatycznego wiążącego się z grupami fosforanowymi, pozwala na łatwą detekcję izoform pirofosforanów inozytolu, otwierając nowe kierunki badań20.
Opisane zastosowanie technologii PAGE do oczyszczania produktów reakcji enzymatycznej przeprowadzanej przez IP6K1 lub VIP1 w celu uzyskania pirofosforanów inozytolu jest prostą, ekonomiczną i niezawodną metodą, która pozwala na produkcję dużych ilości wysokiej jakości IP7. Powyższa metoda nie ogranicza się jedynie do prostego oczyszczania IP7; niewielkie modyfikacje opisanego protokołu mogą umożliwić oczyszczanie innego zakresu pirofosforanów inozytolu. Izoformy pirofosforanów inozytolu o wyższym stopniu fosforylacji, zawierające więcej niż osiem grup fosforanowych, można wykryć, stosując IP7 lub różne ilości IP6 jako substrat20,6. Pirofosforany inozytolu te można wykryć poprzez wydłużenie procedury barwienia, a następnie je oczyścić (sekcja 3.2). Ponadto zastosowanie IP5 jako substratu w reakcji enzymatycznej pozwoliłoby na oczyszczanie PP-IP5 oraz innych pirofosforanów inozytolu zawierających grupę hydroksylową w pierścieniu inozytolu.
Podsumowując, ta niedemandingowa metoda pozwala na niezawodną puryfikację ilości miligramowych pirofosforanów inozytolu przy użyciu powszechnie dostępnych urządzeń, otwierając tym samym nowe możliwości w tej obiecującej dziedzinie badań.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy A. Riccio za pomocne uwagi oraz przeczytanie manuskryptu. Praca ta była wspierana przez finansowanie Medical Research Council (MRC) dla Cell Biology Unit oraz przez grant Human Frontier Science Program (RGP0048/2009-C).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas fitowy (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (heksametafosforan sodu) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| Sól ATP-Mg2+ | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| Fosfokreatyna (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Kinaza kreatynofosforanowa (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Dostępne w laboratorium | Dostępne w laboratorium | |
| Akrylamid:Bis-Akrylamid 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Persiarzan amonu (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borat/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Błękit toluidyny | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Aparatura do elektroforezy żelowej | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Kolektor próżniowy | Christ | Alpha 2-4 | |
| Pompa próżniowa | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
Bibliografia
- Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling. Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).
- Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. Are inositol pyrophosphates signalling molecules? J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).
- Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function. Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).
- Shears, S. B. Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers. Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).
- Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases. Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).
- Draskovic, P. Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups. Chem Biol. 15, 274-286 (2008).
- Mulugu, S. A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate. Science. 316, 106-109 (2007).
- Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases. J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).
- Illies, C. Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells. Science. 318, 1299-1302 (2007).
- Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).
- York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. Inositol diphosphate signaling regulates telomere length. J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).
- Luo, H. R. Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions. Cell. 114, 559-572 (2003).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).
- Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).
- Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).
- Bhandari, R. Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1). Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).
- Otto, J. C. Biochemical analysis of inositol phosphate kinases. Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).
Przedruki i uprawnienia
