Opisujemy adaptację optycznej tomografii projekcyjnej (OPT)1 do obrazowania w bliskiej podczerwieni oraz implementację szeregu narzędzi obliczeniowych. Protokoły te umożliwiają ocenę masy β komórek trzustki (BCM) w większych próbkach, zwiększają wielokanałowość techniki i poprawiają jakość danych OPT.
Artykuł metodologiczny
Tomografia optyczna w bliskiej podczerwieni do oceny rozkładu masy komórek β w badaniach nad cukrzycą
* These authors contributed equally
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Dostosowując OPT do możliwości obrazowania w widmie bliskiej podczerwieni (NIR), tutaj ilustrujemy możliwość obrazowania większych ciał tkanki trzustkowej, takich jak trzustka szczura, oraz zwiększenie liczby kanałów (typów komórek), które mogą być badane w pojedynczej próbce. Dalej opisujemy implementację szeregu narzędzi obliczeniowych, które zapewniają: 1/ dokładne ustawienie środka ciężkości próbki (w naszym przypadku trzustki) (COM) na osi obrotu (AR)2; 2/ Ulepszono algorytmy strojenia po wyrównaniu, które zapobiega zniekształceniom geometrycznym podczas rekonstrukcji tomograficznej2 i 3/ Protokół wyrównywania intensywności w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu w oznaczeniach BCM opartych na OPT3. Dodatkowo opisujemy uchwyt na próbkę, który minimalizuje ryzyko niezamierzonych ruchów próbki podczas akwizycji obrazu. Łącznie protokoły te umożliwiają ocenę rozmieszczenia BCM i innych cech, które można przeprowadzić w całej objętości nienaruszonej trzustki lub innych narządów (np. w badaniach przeszczepu wysp trzustkowych), z rozdzielczością aż do poziomu poszczególnych wysp Langerhansa.
Wprowadzenie
Komórki produkuj β ące insulinę są kluczowe dla zdolności organizmu do kontrolowania homeostazy glukozy we krwi. W związku z tym oceny dystrybucji BCM w trzustce są niezbędne w wielu obszarach przedklinicznych badań nad cukrzycą. Na przykład w ocenach schematów terapeutycznych wpływ celowanej ablacji genów na różnicowanie komórek endokrynnych lub badania etiologii cukrzycy w modelach gryzoni często zależą od takich analiz. Tradycyjnie, tego typu oceny opierały się na czasochłonnych podejściach stereologicznych, które są trudne do wykonania ze względu na rozmiar i złożoną budowę anatomiczną trzustki. Większość metod obrazowania o wysokiej rozdzielczości (zazwyczaj optycznych) nie zapewnia wystarczającej głębokości penetracji, aby umożliwić obrazowanie całej trzustki u gryzoni. I odwrotnie, metody obrazowania, które nie są ograniczone głębokością penetracji (zwykle jądrowe), zapewniają słabą rozdzielczość w celu rozpoznania pełnego rozkładu BCM i są utrudnione przez brak odpowiednich środków kontrastowych4,5.
Optyczna tomografia projekcyjna to metoda obrazowania 3D, która umożliwia ocenę próbek biomedycznych w wysokiej rozdzielczości w skali od mm do cm6. W ten sposób informacje na temat położenia przestrzennego i objętości poszczególnych wysp Langerhansa wykazujących ekspresję insuliny można uzyskać w całej objętości trzustki u myszy zdrowych i chorych na cukrzycę3,7-10. Celem obecnego badania jest dalsze zwiększenie zdolności tej techniki do oceny komórek β trzustki; ich endogenna dystrybucja, po wszczepieniu do innych tkanek, ich związek z innymi składnikami trzustki (takimi jak typy komórek naciekających) oraz w większych preparatach trzustkowych niż było to wcześniej możliwe.
Ustawienia optycznej tomografii projekcyjnej bliskiej podczerwieni (NIR-OPT)
W poniższych protokołach opisany i używany jest skaner OPT oparty na oryginalnej konfiguracji opisanej przez Sharpe'a i wsp.1, przystosowany do obrazowania w zakresie bliskiej podczerwieni. Do jednokanałowej oceny trzustki myszy (np. BCM) można użyć skanera SkyScan 3001 (Bioptonics).
Lampa metalohalogenkowa, która zapewnia wyższą energię wzbudzenia niż lampa łukowa rtęciowa o długości fali powyżej 650nm, dostarcza światło wzbudzające. Światło jest przenoszone przez płynny światłowód. Użyteczną kombinację fluorochromów i filtrów pasmowoprzepustowych do obrazowania fluorescencji NIR i separacji kanałów pokazano na rysunku 3. Emitowane światło jest wykrywane za pomocą kamery CCD podświetlanej od tyłu, o wysokiej wydajności kwantowej w widmie NIR. Skanowanie OPT jest zautomatyzowane za pomocą platformy LabView, która steruje kamerą i silnikiem krokowym. Aby podtrzymać próbki wielkości nienaruszonej trzustki szczura, stosuje się chronione lustro pokryte srebrem i dużą kuwetę. Na koniec zaprojektowano uchwyt na próbkę, który eliminuje niepożądane ruchy pionowe próbki podczas skanowania.
Protokół
1. Przygotowanie i skanowanie próbek
1.1 Przygotowanie próbki
Poniższa procedura jest wykonywana zasadniczo tak, jak opisano wcześniej: 7.
- Zbierz trzustkę. Użyj lodowatego PBS, aby uniknąć degradacji proteolitycznej.
- Utrwal tkankę w 4% PFA w PBS na lodzie przez 2-3 godziny. Upewnij się, że płaty są "rozłożone" podczas utrwalania. Ułatwi to identyfikację anatomicznych punktów orientacyjnych po rekonstrukcji.
- Umyć nadmiar PBS przez 30 min.
- Odwadniaj trzustkę krok po kroku w metanolu (33, 66%, 100%), 15 min/krok. Minimalizuje to tworzenie się pęcherzyków podczas bielenia (patrz krok 5) i zapobiega niszczeniu komórek podczas zamrażania i rozmrażania (patrz krok 7).
- Inkubować tkankę w świeżo przygotowanym buforze wybielającym MeOH:DMSO:H2O2w stosunku 2:1:3 w temperaturze pokojowej przez 24 godziny w celu wygaszenia endogennej fluorescencji tkanek. W przypadku większych próbek należy wymienić na nowy bufor wybielający i inkubować przez kolejne 24 godziny.
- Umyć nadmiar MeOH, ON.
- Zamrażać i rozmrażać przez co najmniej 5 cykli w temperaturze -80 °C - RT, aby ułatwić penetrację przeciwciał.
- Nawadniaj stopniowo z powrotem do TBST (33, 66%, 100%), 15 min/krok.
- Blok w TBST z 10% surowicą (najlepiej z tego samego gatunku, w którym wytworzone zostało przeciwciało drugorzędowe), 5% DMSO i 0,01% NaAz przez 12-24 godziny w RT
- Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami w buforze blokującym przez 48 godzin, w temperaturze pokojowej, przedłużyć do 72 godzin w przypadku większych próbek (stosowane tutaj przeciwciała są wymienione w tabeli odczynników).
- Umyć nadmiar TBST, WŁ.
- Inkubować z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi przez 48 godzin, w temperaturze pokojowej, przedłużyć do 72 godzin w przypadku większych próbek.
- Umyć nadmiar TBST, WŁ.
1.2
Poniższa procedura opisuje, jak zamontować próbkę w agarozie i przymocować ją do specjalnie wykonanego uchwytu na próbkę (patrz Rysunek 7) przed skanowaniem OPT.
- Oddziel płaty śledziony, dwunastnicy i żołądka zgodnie z ryciną 3A w Hörnblad i wsp. 3. Związek między płatami jest bardziej wyjaśniony w Hörnblad i wsp. 11.
- Przygotować agarozę o niskiej temperaturze topnienia 1,5% (m/v) wdH2O, przefiltrować, pozostawić do ostygnięcia do 37 °C i spłukać chusteczkę w dH2O, aby zmyć detergent i usunąć bąbelki przed zatopieniem agarozy na lodzie.
- Wytnij blok agarozy otaczający próbkę i pozostaw ~1 cm odstęp między próbką a podstawą agarozy. Przytnij ostre krawędzie (≤ 90 °) bloku agarozy, aby zmniejszyć rozpraszanie światła.
- Odwadniaj próbkę krok po kroku w MeOH (33, 66%, 100%), pozostawiając czas na zrównoważenie między każdym krokiem. Kiedy próbka tonie, uważa się, że jest zrównoważona.
- Wyczyść próbkę w roztworze alkoholu benzylowego w stosunku 1:2: benzoesan benzylu (BABB), aż stanie się przezroczysta. Wymień roztwór BABB i inkubuj przez dodatkowe 12 godzin.
- Umieść oczyszczoną próbkę w uchwycie na próbkę i zabezpiecz ją, wkładając 2 igły przez przekładkę agarozową przez wywiercone otwory w kołnierzach uchwytu.
- Umieść próbkę w skanerze i zanurz ją w kuwecie wypełnionej roztworem czyszczącym BABB. Porównując serię trzustki, należy użyć tego samego powiększenia dla wszystkich skanów. Powiększenie powinno być zoptymalizowane dla największej próbki w serii.
1.3 Pozycjonowanie próbki w AR
Poniższy protokół opisuje procedurę precyzyjnego pozycjonowania próbki za pomocą algorytmu COM-AR. Ta procedura ma zastosowanie tylko wtedy, gdy zwrot z inwestycji obejmuje całą próbkę. Szczegółowe opisy algorytmów znajdują się w Cheddad i wsp. 2.
- Uzyskaj obrazy próbki w dwóch pozycjach zarówno dla anatomii, jak i kanałów sygnałowych. Pozycja1 pod kątem 0 ° (skojarzona z osią X), wyświetlająca największy obszar rzutowania, i pozycja2 pod kątem 90 ° (skojarzona z osią Z). Używamy kanału GFP do wizualizacji anatomii.
- Zastosuj algorytm maksymalizacji oczekiwań (EM) na obrazach anatomicznych, aby określić próg zwrotu z inwestycji.
- Oblicz punkty COM (współrzędne x) obrazów binarnych uzyskanych w kroku 2 zarówno dla rzutu 0 °, jak i 90 °.
- Nałóż pionową linię przechodzącą przez zidentyfikowany punkt COM obliczony w kroku 3 na obrazy 0 ° i 90 ° kanału sygnałowego.
- Użyj obrazów uzyskanych w kroku 4 jako odniesień, aby przesunąć próbkę tak, aby linia środkowa pola widzenia przechodziła przez znalezione punkty COM próbki.
1.4 Skanowanie
- Dostosuj czasy ekspozycji, aby uzyskać najwyższy możliwy stosunek sygnału do szumu bez nasycania jakichkolwiek obszarów obrazów projekcyjnych. Powtórz te czynności dla wszystkich kanałów, które mają być skanowane.
- Wybierz zestaw filtrów dla pierwszego kanału fluorescencji, który ma zostać przeskanowany. Emisja z krótszych fluoroforów λ może wzbudzić fluorofory o dłuższym λ, a tym samym spowodować wybielanie zdjęć. Aby zminimalizować tę możliwość, należy najpierw zeskanować fluorofor o najdłuższym wzbudzeniu λ .
- Otwórz migawkę, aby oświetlić próbkę i zbierz sygnał fluorescencji w zakresie 360 °, obracając próbkę wzdłuż osi pionowej dla każdego kanału. Kąt kroku stosowany w konfiguracji NIR-OPT wynosi 0,9 °, a w przypadku skanera Bioptonics 3001 0,45 °.
- Wybierz odpowiedni filtr dla następnego kanału i postępuj jak wyżej.
2. Przetwarzanie i rekonstrukcja obliczeniowa
2.1 Wykrywanie i korygowanie niewspółosiowości po przejęciu (dostrajanie wartości A)
W tomografii projekcyjnej zazwyczaj konieczne jest przypisanie projekcjom wartości po wyrównaniu, aby precyzyjnie dostroić położenie obrazów wzdłuż osi obrotu przed rekonstrukcją. Jednak niewielka aberracja w kącie kamery w stosunku do osi optycznej może powodować niejednorodne wartości A na całej długości próbki, a tym samym wywoływać zniekształcenia geometryczne. Aby uniknąć takich zniekształceń, można zastosować metodę obliczeniową w celu znalezienia dokładnej i ujednoliconej wartości po wyrównaniu (wartość A) w całej próbce2.
- Użyj dyskretnej transformaty Fouriera, aby podzielić rzut określonego sygnału pod kątem 0 ° i 180 ° na bloki wysokości 8 pikseli i obliczyć przesunięcie wzdłuż osi x (wartość A) między każdym blokiem.
- Zastosuj liniową regresję metodą najmniejszych kwadratów, aby pomóc w obliczeniu kąta θ', który opisuje nachylenie przesunięcia osi x wzdłuż długości próbki, oraz w celu znalezienia obrotowego punktu środkowego.
- Skoryguj niewspółosiowość podczas skanowania, obracając wszystkie występy θ'/2 wokół punktu środkowego obrotu.
2.2 Adaptacyjna korekcja histogramu z ograniczonym kontrastem (CLAHE)
Aby ułatwić wykrywanie i segmentację obiektów (wysepek) wykazujących bardzo słabe sygnały, które są zagrożone "wygięciem" podczas rekonstrukcji i/lub segmentacji do ocen ilościowych, algorytm CLAHE może być zastosowany do obrazów projekcyjnych. Operacja CLAHE jest wykonywana z dwoma głównymi transformacjami intensywności:
- Kontrast lokalny jest szacowany i wyrównywany w obrębie nienakładających się bloków na obrazie projekcyjnym.
- Intensywności są następnie normalizowane w regionach granicznych między blokami poprzez interpolację dwuliniową.
Nazwa ograniczona kontrastem odnosi się do limitu klipów, który jest ustawiony tak, aby uniknąć nasycenia pikseli na obrazie. W tym protokole użyto wbudowanej funkcji MATLAB "adapthisteq" i zastosowano ją z domyślnym limitem klipów wynoszącym 0,01 i rozmiarem kafelka 256. Należy pamiętać, że optymalny rozmiar płytki musi zostać przetestowany empirycznie i może się różnić w zależności od analizowanej próbki. Więcej szczegółów na temat algorytmu i przykłady można znaleźć w Hörnblad i wsp. 3.
Uwaga! Wyżej wymienione kroki przetwarzania obliczeniowego (w tym COM-AR, A-Value Tuning i CLAHE, patrz 1.3-2.2) są zbudowane na standardowych algorytmach i są wykonywane w MATLAB (Mathworks).
2.3 Rekonstrukcja tomograficzna i renderowanie izo-powierzchni
- Korzystając z filtrowanego algorytmu projekcji wstecznej, skorygowane i znormalizowane obrazy mogą być teraz rekonstruowane z ujednoliconą kompensacją niewspółosiowości i minimalnym wymogiem optymalizacji zakresu dynamicznego. W tym protokole wszystkie rekonstrukcje wykonywane są przy użyciu metody filtrowanej projekcji wstecznej dostępnej w oprogramowaniu NRecon (Skyscan), wersja 1.6.8 (http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Należy pamiętać, że powiększenie obrazowanego obiektu zależy od jego odległości od punktu ogniskowego obiektywu, chyba że w konfiguracji obrazowania zaimplementowano geometrię wiązki równoległej. Dlatego podczas importowania zestawu danych projekcji do oprogramowania NRecon ważne jest, aby uwzględnić prawidłową odległość obiektu od źródła (mm) i kierunek obrotu skanera (dla wejścia w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara "cc" i dla wejścia w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara "cw") w dołączonym pliku dziennika, aby uniknąć artefaktów wywołanych wiązką stożkową podczas rekonstrukcji.
- Aby zobrazować i określić ilościowo stos uzyskanych wirtualnych przekrojów, wygeneruj izo-powierzchnie 3D za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu, takiego jak Imaris lub Volocity.
Procedury izolacji i przeszczepu mysich wysp trzustkowych zostały przeprowadzone w Instytucie Badań nad Cukrzycą w Przedklinicznym Rdzeniu Przetwarzania Komórek i Modelu Translacyjnego zgodnie z protokołami sprawdzonymi i zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Miami. Komisja eczna ds. badań na zwierzętach w północnej Szwecji zatwierdziła wszystkie inne eksperymenty na zwierzętach.
Wyniki
W niniejszym raporcie opisujemy protokół ekstrakcji i komputerowego przetwarzania danych BCM z trzustek gryzoni (oraz innych tkanek) przy użyciu metody NIR-OPT (Rycina 1). Jak pokazano na Rycini 2, autofluorescencja tkanek z próbek trzustki jest, zgodnie z oczekiwaniami, wyraźnie zmniejszona w widmie NIR. Prowadzi to do znacznego wzrostu średniego stosunku sygnału do szumu (S:N) podczas oceny wysp Langerhansa znakowanych insuliną. Dzięki adaptacjom OPT do obrazowania w zakresie bliskiej podczerwieni (NIR), opisanym w niniejszym opracowaniu, możliwe jest wizualizowanie co najmniej trzech specyficznych kanałów z wystarczającym stosunkiem S:N, co pozwala na ocenę typów komórek znakowanych przeciwciałami w całej objętości trzustki mysiej z wyraźną separacją kanałów (patrz Rycina 3 i 4). Zastosowana do obrazowania procesów diabetogennych i/lub ogólnych ocen BCM technika ta umożliwia zatem wizualizację i kwantyfikację obszarów insulinowo-dodatnich w relacji do otaczających i/lub oddziałujących typów komórek (patrz Rycina 4). Takie oceny, dzięki zwiększonej głębokości penetracji tkanki uzyskiwanej w zakresie NIR, możliwe są do przeprowadzenia w znacznie większych próbkach niż dotychczas, w tym w trzustce szczura, która jest 3-5 razy większa od odpowiednika mysiego (patrz Rycina 5). Niezależnie od tego, czy wykorzystywane są długości fal widzialne czy NIR, zastosowanie algorytmu CLAHE może znacząco ułatwić oceny BCM oparte na OPT w różnych warunkach genetycznych i fizjologicznych poprzez zwiększenie czułości detekcji tej techniki (patrz Rycina 6). Schemat opracowanego uchwytu do próbek przedstawiono na Rycini 7.
Rycina 1. Schemat blokowy przedstawiający kluczowe etapy analizy BCM w trzustce mysiej z wykorzystaniem OPT. Czas wymagany do oceny typowej trzustki mysiej wynosi 13-14 dni. Większość tego czasu zajmuje obróbka tkanek i barwienie immunohistochemiczne (10 dni), przejrzyszczanie tkanek wymaga około 2 dni, natomiast czas skanowania zależy od wymaganego czasu ekspozycji (zazwyczaj około 1 hr). Następcza obróbka obliczeniowa jest zazwyczaj wykonywana w ciągu jednego dnia. Należy zauważyć, że stosunkowo długi protokół barwienia jest idealnie dostosowany do przetwarzania seryjnego większej liczby próbek.
Rycina 2. Stosunki sygnału do szumu dla ocen BCM przy różnych długościach fal. Płat trzustki dwunastniczej myszy, barwiony na insulinę oraz z użyciem koktajlu przeciwciał wtórnych sprzężonych z fluorochromami (Alexa 488, 594, 680 i 750), został wykorzystany do wyznaczenia stosunków S:N przy różnych długościach fal. A, Obrazy przedstawiają pierwszą ramkę projekcji dla każdego kanału sygnałowego. B, Wykres ilustrujący średni S:N dla każdego kanału sygnałowego. Stosunki określono jako średnią intensywność wysepek (na podstawie 215 wysepek) podzieloną przez intensywność tła (endogenna fluorescencja tkanki z tkanki egzokrynnej). C, Wykres pokazujący stosunki S:N dla poszczególnych wysepek w każdym kanale, znormalizowane do S:N uzyskanego dla kanału Alexa 594. Do analiz statystycznych wykorzystano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA). Wskazane poziomy istotności odpowiadają **p<0.01. Pasek skali w (A) odpowiada 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.
Rycina 3. Separacja kanałów. A, Przeciwciała wtórne koniugowane z barwnikami Alexafluor wymienionymi w tabeli zostały unieruchomione oddzielnie na kuleczkach proteinG-sepharose. B, Fluorescencyjne kuleczki osadzono następnie na różnych poziomach w fantomie agarozowym i obrazowano przy użyciu wskazanych filtrów.
Rycina 4. Wielokanałowe obrazowanie w oparciu o OPT w badaniach nad cukrzycą. A, Rekonstrukcja izopowierzchni w oparciu o OPT trzustki (12 tygodni, płat dwunastniczy) z modelu Non Obese Diabetic (NOD) dla cukrzycy typu 1. Preparat został zabarwiony na insulinę (β-komórki wysepek, pseudo-kolor niebieski), α-aktynę mięśni gładkich (naczynia krwionośne, czerwony) oraz CD3 (infiltrujące limfocyty T, zielony). Odpowiednio zastosowano następujące przeciwciała wtórne: Cy3, IRDye-680 oraz DyeLight-750. Wstawki (A'-A''') przedstawiają poszczególne kanały sygnałów. B, Obraz OPT (widok powiększony) płata wątroby myszy (lobus sinister lateralis) z przeszczepionymi syngeniczna wysepkami, obrazowany za pomocą NIR-OPT dwa tygodnie po transplantacji. Wysepki wykazujące ekspresję insuliny są zaznaczone pseudo-kolorem niebieskim, a naczynia dodatnie pod kątem α-aktyny mięśni gładkich – kolorem czerwonym. Podejście to umożliwia ocenę rozmieszczenia przeszczepionych wysepek w obrębie sieci naczyniowej. Paski skali odpowiadają 1 mm.
Rysunek 5. NIR-OPT umożliwia obrazowanie większych preparatów. A, Rendering izopowierzchni rozkładu BCM w trzustce szczura z modelu Zucker Fatty dla cukrzycy typu 2 (płat śledzionowy w wieku 9 miesięcy), obrazujący możliwość obrazowania preparatów w skali trzustki szczura za pomocą NIR-OPT. Zgodnie z tą techniką przedstawiony płat jest około 6 razy większy (v/v) od swojego odpowiednika u myszy i zawiera 10139 wysepek Langerhansa wykazujących ekspresję insuliny, których objętość komórek β stanowi 1,32% całkowitej objętości płata. B, Przekrój tomograficzny odpowiadający linii przerywanej w (A), ilustrujący wykrycie wysepek ze wszystkich głębokości tkanki. C, Rendering izopowierzchni rozkładu BCM w trzustce myszy (płat śledzionowy w wieku 8 tygodni) przedstawiony jako odniesienie wielkości. Przedstawiony płat zawiera 2490 wysepek wykazujących ekspresję insuliny, których objętość komórek β stanowi 0,89% całkowitej objętości płata. Trzustki zostały zabarwione przeciwciałami GP anty-insulinowymi, a następnie odpowiednio sprzężonymi z Alexa594 kozimi anty-GP (mysz) oraz sprzężonymi z IRDye 680 osiołkowymi anty-GP (szczur). Preparaty w (A-C) są przedstawione w odpowiedniej skali, a pasek skali w (C) odpowiada 2 mm.
Rysunek 6. Metoda CLAHE ułatwia wykrywanie wysepek w trzustce mysiej za pomocą obrazowania OPT. A-C, Reprezentatywne obrazy OPT z renderowaniem izopowierzchni trzustki myszy C57Bl/6 (płat śledzionowy w 8. tygodniu), znakowane pod kątem insuliny. Rekonstrukcje izopowierzchni obrazów OPT wykonano przed (A, kolor pseudobarwny zielony) oraz po zastosowaniu protokołu CLAHE (B, kolor pseudobarwny czerwony). C, Nałożenie danych nienormalizowanych z (A) i danych przetworzonych metodą CLAHE z (B). C'-C'', Reprezentatywne nałożenie obrazów nienormalizowanych (A) i przetworzonych metodą CLAHE (B) przy dużym powiększeniu. Jak pokazuje obecność wysepek zaznaczonych tylko kolorem czerwonym, skrypt CLAHE ułatwia wykrywanie małych wysepek o niskiej intensywności sygnału. W niniejszym przykładzie przedstawiony preparat (po procesowaniu CLAHE) zawierał 2419 wysepek o objętości 1,74 mm3 (liczby oparte na odpowiadających im nieprzetworzonych danych projekcyjnych wynosiły 1057 wysepek o objętości 1,77 mm3). D i E, Przykładowe dane z grupy kontrolnej (D) oraz z modelu mysiego ob/ob dla cukrzycy typu 212 (E) w wieku 6 miesięcy z zastosowaniem protokołu CLAHE. Zwrócić uwagę na masowy ogólny wzrost rozmiaru wysepek w trzustce ob/ob (E). W (D) i (E) obrys trzustki (szary) oparto na sygnale z autofluorescencji tkanki. Pasek skali w C wynosi 500 μm w A-C. Pasek skali w C'' odpowiada 200 μm w C' i C''. Pasek skali w E odpowiada 1 mm w (D) i (E). Obrazy w (A-C) zostały zaadaptowane z pracy Hörnblad et al3 i zostały wygenerowane przy użyciu skanera Bioptonics 3001.
Rysunek 7. Uchwyt próbek do mocowania preparatów OPT. Próbka jest zabezpieczona poprzez wprowadzenie igieł przez dystans z agarozy przez wcześniej nawiercone otwory w kołnierzach. Uchwyt jest połączony z silnikiem krokowym za pomocą silnego magnesu umieszczonego w jego podstawie. Taki układ eliminuje konieczność stosowania niestabilnych klejów i zapobiega niepożądanym ruchom próbki podczas skanowania.
Dyskusja
Opisane techniki obrazowania OPT umożliwiają ekstrakcję parametrów przestrzennych i ilościowych w całej objętości mysiej trzustki. Ze względu na ograniczenia w osiągalnej rozdzielczości dla tego typu obrazowania mezoskopowego należy zauważyć, że podobnie jak w przypadku większości metod obrazowania, im większa próbka, tym niższa rozdzielczość (chociaż zastosowanie CCD o wyższej rozdzielczości powinno zwiększyć rozdzielczość skanu OPT). W związku z tym, w przypadku oceny nienaruszonych płatów trzustki myszy, technika ta obecnie nie zapewnia rozdzielczości pojedynczej komórki, chociaż jest ona bliska (ok. 15-20 μm)7. Mimo to, w celu ekstrakcji dystrybucji BCM w trzustce myszy, protokoły dostarczyły danych, które więcej niż dobrze pasują do tych uzyskanych np . za pomocą morfometrii zliczania punktów3,13 Należy zauważyć, że chociaż implementacja protokołu CLAHE pozwala na wykrycie znacznie większej liczby wysepek, wysepki te są na ogół mniejsze i nie przyczyniają się znacząco do ogólnej objętości komórek β.
Stosowane protokoły immunohistochemiczne są stosunkowo długie (do dwóch tygodni), ale rzeczywisty czas przygotowania próbki jest krótki, dlatego technika ta dobrze nadaje się do badania dużych kohort zwierząt9. Jeżeli w badaniu skupia się potencjał heterogenicznych wzorców dystrybucji, należy podkreślić, że należy zachować ostrożność na etapach dotyczących utrwalania i montowania, aby uniknąć niekorzystnego utrwalenia tkanki trzustki i dążyć do płaskiego ("rozłożonego") mocowania tkanki w celu ułatwienia takich ocen.
Ważną kwestią podczas wykonywania OPT jest to, że COM próbki jest ustalony na osi obrotu i nie porusza się, ani w pionie, ani w poziomie, podczas procedury skanowania. Dlatego ważne jest, aby mieć stabilną konfigurację mechaniczną i dobrze działający system mocowania próbki. Rozwiązaliśmy ten problem, konstruując nowy montaż (Rysunek 7).
Geometria równoległa nie była prawdziwa w przypadku naszego skanera NIR-OPT lub Bioptonics 3001, co zostało wykryte jako pionowe przesunięcie między tylną i przednią pozycją obiektów peryferyjnych na zarejestrowanych obrazach projekcyjnych. Dostosowując odległość obiektu do źródła w pliku dziennika odpowiedniego skanera (patrz 2.3.1), mogliśmy znacznie poprawić jakość naszych danych i skorygować zniekształcenia geometryczne na odległych krawędziach obrazów projekcyjnych, co ma szczególne znaczenie przy ocenie większych próbek.
W obecnym protokole podajemy propozycję zestawów filtrów, które umożliwiają wizualizację trzech różnych specyficznych kanałów i kanału "anatomicznego" w ocenie nienaruszonych preparatów trzustkowych. Oczywiście ustawienia te mogą być modulowane, aby lepiej pasowały do fluorochromów wykorzystywanych w danym badaniu, chociaż, podobnie jak w przypadku wszystkich form mikroskopii fluorescencyjnej, potencjalne ryzyko przebicia sygnału powinno być dokładnie ocenione. Badanie znakowanych insuliną wysp trzustkowych z fluorochromami, które są wzbudzone powyżej 750 nm, nie było jeszcze możliwe przy użyciu lampy metalohalogenkowej, którą wykorzystuje nasz zestaw. Możliwe, że kamera o jeszcze wyższej wydajności kwantowej w odpowiednich długościach fal w połączeniu z alternatywnymi źródłami światła (np. laserami diodowymi) mogłaby jeszcze bardziej zwiększyć potencjał NIR-OPT i umożliwić obrazowanie na jeszcze wyższych długościach fal.
Obrazowanie OPT jest bardzo wszechstronną techniką oceny przestrzennej i ilościowej próbek biomedycznych w skali mm-cm. Chociaż przedstawione tutaj protokoły zostały opracowane głównie w celu badań nad trzustką/cukrzycą, powinno być możliwe ich przełożenie na badania nad innymi gatunkami, typami próbek i markerami. Dzięki możliwości wizualizacji kilku odrębnych kanałów w nienaruszonych preparatach trzustkowych, obrazowanie NIR-OPT ma ponadto potencjał jako narzędzie do oceny swoistości wychwytu środków kontrastowych przeznaczonych do nieinwazyjnej oceny za pomocą innych metod obrazowania, o ile te środki kontrastowe mogą być zaprojektowane tak, aby przenosiły również fluorofor wykrywalny przez OPT.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Dr. P. Lindström jest znany za dostarczenie myszy ob/ob. J. Lehtonen jest doceniany za pomoc przy produkcji wideo, a J. Gilbert za pomoc w montażu. Badanie to zostało wsparte grantami Fundacji Instytutu Badań nad Diabetologią (A.P.), Fundacji Badań nad Cukrzycą Nieletnich (A.P. i U.A.), Komisji Europejskiej (FP-7, Umowa o grant nr: CP-IP 228933-2) (J.S. i U.A.), Fundacji Kempe, Uniwersytetu w Umeå oraz Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych dla U.A.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Metanol | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
| Alkohol benzylowy | Scharlau | AL01611000 | |
| Benzoesan benzylu | Scharlau | BE01851000 | |
| Agaroza o niskiej temperaturze topnienia | LONZA | 50100 | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Mysie przeciwciało anty-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Przeciwciało pierwszorzędowe |
| Królik anty-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Przeciwciało pierwszorzędowe |
| anty-Ins świnki morskiej | DAKO | A0564 | Przeciwciało pierwotne |
| Donkey anty GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Przeciwciało wtórne |
| Koza anty Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Przeciwciało drugorzędowe |
| Koza anty GP-Alexa594 | Sondy molekularne | A-11076 | Przeciwciało wtórne |
| Koza anty GP-Alexa488 | Sondy molekularne | A-11008 | Wtórne przeciwciało |
| Koza anty GP-Alexa594 | Sondy molekularne | A-11012 | Przeciwciało drugorzędowe |
| Koza anty GP-Alexa680 | Sondy molekularne | A-21076 | Przeciwciało drugorzędowe |
| Koza anty GP-Alexa750 | Sondy molekularne | A-21039 | Przeciwciało drugorzędowe |
| OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
| Leica MZ FLIII | Leica Mikroskop | stereoskopowy | |
| Leica Objective 0,5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
| Adapter do aparatu fotograficznego 1,0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
| EL6000 Metalohalogenkowy | |||
| Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52,5 mm | |
| Lustro | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
| Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | CCD |
| podświetlany Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 | |
| Zestaw filtrów | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Zestaw filtrów | Technologia Chroma | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| Kulki białkoG-sefaroza | GE Healthcare | 17-0618-01 | Białko G Sepharose 4 Szybki przepływ |
| Azydek sodu | Sigma-Aldrich | 08591 | Azydek sodu 0,1 M roztwór |
Bibliografia
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
- Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).
- Ahlgren, U., Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).
- Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070(2008).
- Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).
- Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936 (2010).
- Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753(2011).
- Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research
Posted by JoVE Editors on 11/05/2018. Citeable Link.
A correction was made to Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
