Name: Metoda HPLC lektyny do wzbogacania selektywnie glikozylowanych peptydów ze złożonych próbek biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: Poznaj metodę HPLC lektyny do wzbogacania glikozylowanych peptydów z ludzkiej plazmy. Technika ta wykorzystuje chromatografię afinitacyjną z kulkami POROS do izolacji glikopeptydów w badaniach nad biomarkerami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez inicjatywę Clinical Proteomic Technologies for Cancer, 5U24CA126477-04.

1) Przygotowanie kolumn POROS sprzężonych z lektyną
<ol>
<li>Załóż maseczkę, aby chronić się przed wdychaniem kulek POROS-AL podczas kroków 1.1 – 1.2. Odważ pożądaną ilość kulek POROS (100 mg kulek/300 μl objętości końcowej) i przenieś je do czystej probówki typu Eppendorf.</li>
<li>Przemyj kulki, dodając 1 mL soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Osadź kulki poprzez wirowanie w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 3 minuty. Usuń nadosad i powtórz przemywanie.</li>
<li>Odważ pożądaną ilość nie sprzężonej lektyny (1 – 4 mg/ 200 μl kulek) i przenieś ją do czystej probówki typu Eppendorf. Dodaj PBS, aby przygotować roztwór o stężeniu 5 – 20 mg/mL. Odstaw 25 μl tego roztworu.</li>
<li>Przenieś pozostały roztwór lektyny do kulek POROS. Dodaj cyjanoborowodorek sodu do stężenia końcowego 50 mM. Umieść probówkę na kołysce i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej. (Uwaga: cyjanoborowodorek sodu jest toksyczny i musi być używany w dygestorium. Zanieczyszczone odpady należy zutylizować w odpowiedni sposób).</li>
<li>Osadź kulki POROS zgodnie z krokiem 1.2. Usuń nadosad i zachowaj go jako roztwór po sprzęganiu.</li>
<li>Przemyj kulki 1 mL buforu gaszącego (1 M Tris-Cl, pH 7.4). Osadź kulki zgodnie z krokiem 1.2 i bezpiecznie usuń nadosad.</li>
<li>Zablokuj pozostałe miejsca reakcyjne na kulkach POROS za pomocą 1 mL buforu gaszącego. Dodaj cyjanoborowodorek sodu do stężenia końcowego 50 mM. Umieść probówkę na kołysce i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
<li>Osadź kulki zgodnie z krokiem 1.2 i usuń nadosad.</li>
<li>Przemyj kulki 1 mL 1 M NaCl. Osadź kulki i usuń nadosad. Powtórz czynność cztery razy, aby łącznie wykonać pięć przemyć. Kulki są teraz gotowe do upakowania.</li>
<li>Aby określić ilość białka sprzężonego z kulkami POROS, wykonaj analizę stężenia białka w roztworach lektyny przed i po sprzęganiu. Różnica w stężeniach stanowi ilość białka sprzężonego z kulkami. Ilość białka sprzężonego w przeliczeniu na objętość kulek odpowiada stężeniu lektyny na kulkach. Docelowe stężenia lektyny wynoszą od 2 do 20 mg/mL.</li>
</ol>
2) Pakowanie kulek POROS sprzężonych z lektyną do kolumny PEEK
<ol>
<li>Zmontuj system do pakowania (opis poniżej) i zamocuj go na metalowym statywie pierścieniowym. System do pakowania składa się z następujących elementów, od dołu do góry: ogranicznik ciśnienia, końcówka kolumny 1, frit, kolumna (2 x 50 mm), końcówka kolumny 2, łącznik kolumny, końcówka kolumny 3, kolumna (4,5 x 50 mm), końcówka kolumny 4 oraz złączka końcowa. Górna kolumna służy jako zbiornik dla materiału wypełniającego.</li>
<li>Resuspenduj kulki POROS w odpowiedniej objętości Buforu A (10 mM bufor Tris, pH 7,4, 150 mM chlorku sodu, 10 mM chlorku wapnia, 10 mM chlorku magnezu). W przypadku pakowania jednej kolumny (objętość złoża ~200 μl), resuspenduj w 400 μl Buforu A.</li>
<li>Przenieś skoniugowane kulki POROS do górnej kolumny (zbiornika). Dolewaj Bufor A do zbiornika, aż bufor osiągnie górną krawędź kolumny. Ostrożnie nałóż złączkę końcową na górę kolumny, starając się uniknąć powstania pęcherzyków powietrza w kolumnie. Podłącz złączkę końcową górnej kolumny do systemu HPLC.</li>
<li>Spakuj kolumnę, przepuszczając Bufor A przez system. Zacznij od szybkości przepływu 0,5 mL/min. Zwiększaj szybkość przepływu o 0,5 mL/min w każdej minucie, aż do osiągnięcia 4 mL/min lub maksymalnego ciśnienia (3000 psi). Kontynuuj z maksymalną możliwą szybkością przepływu, dopóki przez kolumnę nie przepłynie co najmniej 35 mL Buforu A.</li>
<li>Wyłącz pompy i poczekaj, aż ciśnienie w kolumnie spadnie do &lt; 20 psi.</li>
<li>Ostrożnie rozmontuj system do pakowania, zaczynając od góry. Po dotarciu do końcówki kolumny 2 usuń ją ostrożnie. Część spakowanego materiału powinna wystawać ponad górną krawędź kolumny. Za pomocą żyletki lub podobnego ostrego narzędzia delikatnie usuń wystające kulki, tak aby powierzchnia złoża była zrównana z górną krawędzią kolumny. Podczas tej czynności nie wywieraj nacisku na kulki.</li>
<li>Zdejmij spakowaną kolumnę ze statywu pierścieniowego. Włóż nowy frit do nowej końcówki i odwróć spakowaną kolumnę, aby połączyć ją z fritem/końcówką na otwartym (wcześniej górnym) końcu kolumny.</li>
<li>Odpowiednio oznakuj kolumnę. Jest ona teraz gotowa do użycia. Gdy nie jest używana, kolumnę można przechowywać w PBS z 0,02% azotku sodu w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.</li>
</ol>
3) Zaprogramowanie metody HPLC
<ol>
<li>Szczegóły programowania urządzenia HPLC będą się różnić w zależności od specyfiki oprogramowania producenta. W naszej pracy wykorzystujemy HPLC Michrom Paradigm MG4. W tym urządzeniu metody są tworzone i wybierane w zakładce „Setup” u góry ekranu. Należy zaprogramować następującą metodę: 
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody >
 <tr>
 <td>Czas</td>
 <td>Szybkość przepływu (μl/min)</td>
 <td>% A</td>
 <td>% B</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0:00</td>
 <td>50</td>
 <td>100</td>
 <td>0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>9:00</td>
 <td>50</td>
 <td>100</td>
 <td>0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>9:01</td>
 <td>500</td>
 <td>0</td>
 <td>100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>13:50</td>
 <td>500</td>
 <td>0</td>
 <td>100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>13:51</td>
 <td>3000</td>
 <td>100</td>
 <td>0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>19:50</td>
 <td>3000</td>
 <td>100</td>
 <td>0</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
 Bufor A: 10 mM bufor Tris, pH 7.4, 150 mM chlorku sodu, 10 mM chlorku wapnia, 10 mM chlorku magnezu 
 Bufor B: 0.5 M kwas octowy 
 Detektor UV należy zaprogramować na odczyt przy 280 nm w czasie od 0:00 do 19:50. Oś y powinna być dostosowana do wykrywania niskich poziomów absorbancji, np. 0 - 50 AU.</li>
<li>Jeśli dostępny jest autosampler, należy zaprogramować następujący harmonogram zbierania frakcji. W przeciwnym razie frakcje należy zbierać ręcznie, zgodnie ze wskazówkami podczas przeprowadzania chromatografii. 
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Frakcja</td>
 <td>Opóźnienie rozpoczęcia zbierania od momentu wstrzyknięcia próbki</td>
 <td>Czas trwania zbierania (min)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przepływowa (Flow-through)</td>
 <td>2.8</td>
 <td>4.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Związana (Bound)</td>
 <td>9</td>
 <td>2.6</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
</li>
</ol>
4) Przygotowanie próbek do HPLC
<ol>
<li>Przed zastosowaniem w tym protokole osocze ludzkie należy opróżnić z 14 najliczniejszych białek przy użyciu kolumny MARS (Agilent; Santa Clara, CA). Opróżnione osocze, ludzką laktoferynę i inwertazę drożdżową należy oddzielnie poddać trawieniu trypsyną i odsolić zgodnie z wcześniejszym opisem 1.</li>
<li>Aby przygotować standard laktoferyny specyficzny dla lektyny, należy przeprowadzić chromatografię 50 ug laktoferyny trawionej trypsyną na kolumnie AAL lub SNA, stosując metodę opisaną w Części 3. Frakcja związana będzie zawierać glikopeptydy laktoferyny specyficzne dla lektyny. Próbki należy zneutralizować zgodnie z Częścią 4.4 i odsolić zgodnie z Częścią 6. Próbkę należy zawiesić ponownie w 1 mL Buforu A. Tak przygotowana próbka jest gotowa do użycia.</li>
<li>Należy wykonać trzy powtórzenia eksperymentalne. Aby przygotować próbkę dla trzech powtórzeń, należy dodać 3 pmol inwertazy trawionej trypsyną oraz 1 μl specyficznej dla lektyny laktoferyny (AAL-LAC lub SNA-LAC) do 30 μl ekwiwalentów osocza (PE) trawionych trypsyną i opróżnionych z białek za pomocą MARS. PE definiuje się jako objętość nieprzetworzonego/nienaruszonego/oryginalnego osocza, z którego pochodziła dana ilość przetworzonego osocza (opróżnionego z białek przez MARS i trawionego trypsyną). Do próbki należy dodać Bufor A do uzyskania końcowej objętości 330 μl.</li>
<li>Do fiolek na próbki, w których będzie zbierany eluat, należy dodać bufor neutralizujący (1 M Tris pH 8.0). Liczba i objętość fiolek zależy od ograniczeń zastosowanego autopróbnika. W przypadku urządzenia Paradigm MG4 jedna fiolka służy do zbierania frakcji niezatrzymanej, a dwie do zbierania eluatu. Do zneutralizowania 1 mL eluatu потребуется około 1,5 mL buforu Tris. Docelowe pH po neutralizacji wynosi 7,0-8,0; końcowe pH należy sprawdzić za pomocą papierka wskaźnika pH.</li>
</ol>
5) Przeprowadzenie chromatografii
<ol>
<li>Wszystkie następujące analizy prób i pomiary tła będą przeprowadzane zgodnie z metodą opisaną w części 1. Kolumna i bufory podczas użytkowania znajdują się w temperaturze pokojowej. Kolumny przechowuje się w temperaturze 4 °C, natomiast bufory w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Podłączyć do systemu HPLC kolumnę z lektyną AAL lub SNA i przeprowadzić dwie analizy tła (wstrzykując sam Bufor A). Należy upewnić się, że kolumna z lektyną odpowiada specyficznej dla danej lektyny laktoferrynie (część 2).</li>
<li>Przeprowadzić chromatografię trzech próbek osocza, wstrzykując próbkę tła pomiędzy każdą analizowaną próbką, co daje łącznie 7 przebiegów HPLC. Frakcje z analiz tła nie muszą być zbierane.</li>
</ol>
6) Odsolenie zebranych frakcji
Dla każdej frakcji należy wykorzystać jeden wkład SPE Waters Oasis HLB 1 mL w następujący sposób:
<ol>
<li>Przymocuj wymaganą liczbę kolumienek do manifoldu próżniowego.</li>
<li>Zwilż każdą kolumienkę za pomocą 1 mL 80% ACN w 1% kwasie mrowkowym (manometr próżniowy na manifoldzie powinien wskazywać 5 - 20 lnHg).</li>
<li>Zrównoważ kolumienki za pomocą 1,5 mL 0,1% kwasu mrowkowego (manometr próżniowy na manifoldzie powinien wskazywać 5 - 20 lnHg).</li>
<li>Nanieś całą objętość jednej próbki na jedną kolumienkę (manometr próżniowy na manifoldzie powinien wskazywać 2 - 2,5 lnHg, a szybkość przepływu nie powinna przekraczać 1 mL/min).</li>
<li>Przemyj kolumienki 3 x 1 mL 0,1% kwasu mrowkowego (manometr próżniowy na manifoldzie powinien wskazywać 5 - 20 lnHg).</li>
<li>Eluuj peptydy/glikopeptydy do opisanych probówek Eppendorf za pomocą 1 x 1 mL 80% acetonitrylu w 0,1% kwasie mrowkowym (manometr próżniowy na manifoldzie powinien wskazywać 2 - 2,5 lnHg, a szybkość przepływu nie powinna przekraczać 1 mL/min). Dla każdej kolumienki należy użyć osobnej probówki do zbierania eluatu.</li>
<li>Zneutralizuj eluat, dodając 60 μl 0,5 M wodorowęglanu amonu do każdej probówki. Docelowe pH po neutralizacji wynosi 7,0-8,0; sprawdź końcowe pH za pomocą papierka wskaźnikowego.</li>
<li>Skoncentruj eluoowane peptydy/glikopeptydy do objętości ~50 μL, odwirując je w wirówce próżniowej (np. Thermo Savant SpeedVac) przez ~2 h w temperaturze 35°C.</li>
</ol>
7) Trawienie PNGazą F
<ol>
<li>Zmierz pH próbki, aby upewnić się, że mieści się w zakresie 7,0 - 8,0. W razie potrzeby dodaj 50 mM wodorowęglanu amonu, aby zwiększyć pH. Jeśli końcowa objętość próbki wynosi &gt; 100 μl, odparuj ją w wirówce próżniowej (speedvac), aż osiągnie objętość między 50-100 μl.</li>
<li>Dodaj 0,5 μl (250 U) PNGazy F bez glicerolu do każdej probówki z próbką i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
</ol>
8) Próbki w końcówkach Zip Tip
<ol>
<li>Zaczynając od próbek poddanych trawieniu PNGazą F, przeprowadź oczyszczanie każdej z nich za pomocą ziptip w następujący sposób.</li>
<li>Zwilż ziptip 10 μl 100% acetonitrylu, a następnie 10 μl 80% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym.</li>
<li>Równoważ ziptip 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego.</li>
<li>Nanieś próbkę na ziptip, pipetując ją 10 razy w górę i w dół przez matrycę ziptip.</li>
<li>Przemyj ziptip, pipetując 10 μl 0,1% kwasu mrówkowego 5 razy.</li>
<li>Eluuj próbkę do czystej probówki eppendorfa za pomocą 10 μl 80% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym.</li>
<li>Powtórz elucję i dodaj kolejne 10 μl do tej samej probówki.</li>
<li>Odparuj próbki w Speedvacu do objętości &lt; 2 μl.</li>
<li>Resuspenduj próbki w 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Próbki są teraz gotowe do analizy LC-MS/MS.</li>
</ol>
9) Reprezentatywne wyniki:
Koniugacja z użyciem POROS zazwyczaj pozwala na uzyskanie stężeń lektyny na koralikach w zakresie 2 - 20 mg/mL. Jest to wartość optymalna dla chromatografii powinowactwa.
Chromatografia lektynowa plazmy ludzkiej po trawieniu trypsyną i usunięciu białek MARS zazwyczaj wzbogaca frakcję związaną w glikopeptydy. Ponieważ glikopeptydy są poddawane działaniu PNGase F przed analizą LC-MS/MS, są one identyfikowane jako peptydy z konsensusową sekwencją wiązania N-glikanów, NXS/T (gdzie X to dowolny aminokwas poza proliną), w których asparagina została przekształcona w kwas asparginowy w wyniku działania PNGase F. Peptydy o tych charakterystykach uznaje się za peptydy odglikozylowane (lub „deglikopeptydy”). Średnio frakcja przepływowa (FT) z chromatografii AAL lub SNA zawiera 2-4% deglikopeptydów, podczas gdy 30-50% peptydów odzyskanych we frakcji związanej to deglikopeptydy. Zazwyczaj, przy użyciu QStar Elite, we frakcji FT zostanie zidentyfikowanych 1000-1300 peptydów, a we frakcji związanej 200-400 peptydów. We frakcji FT powinny zostać zaobserwowane dwa lub więcej odrębnych deglikopeptydów inwertazy, a we frakcji związanej dwa lub więcej odrębnych deglikopeptydów laktoferyny (Tabela 1).
<img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="Tabela analizy białek z identyfikatorami, sekwencjami peptydów oraz teoretycznym m/z dla spektrometrii mas." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1.

<ol><li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li>
</ol>

Niniejszy protokół przedstawia szybką metodę izolacji i identyfikacji glikopeptydów w sposób specyficzny dla glikanów. Ponieważ glikozylacja ulega znacznym zmianom w obrębie organizmu, szczególnie podczas rozwoju i patogenezy, technika ta może znaleźć zastosowanie w odpowiedzi na szeroki zakres zagadnień. W szczególności wykorzystujemy tę metodę do selektywnego wzbogacania glikopeptydów zmodyfikowanych epitopami powiązanymi z nowotworami, jako pierwszy krok w procesie odkrywania biomarkerów.

<table><tbody><tr><td>Osocze ludzkie</td><td></td><td></td><td>Przygotowywane we własnym zakresie</td></tr><tr><td>Laktoferryna ludzka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0520</td><td>Trawienie trypsyną przed użyciem</td></tr><tr><td>Inwertaza drożdżowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0408</td><td>Trawienie trypsyną przed użyciem</td></tr><tr><td>Wkładnice SPE OAS HLB</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>Objętość 1 cc</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet ZipTip</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZTC1 8M0 96</td><td>Millipore, C18 do pipety 10 ml</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>99%</td></tr><tr><td>Węglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>99%</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>96%</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>98%</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>99.7%</td></tr><tr><td>Papierek wskaźnikowy pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>M95903</td><td>Zakres 0-14</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>99.9%</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28905</td><td>99%</td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>Bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>PNGaza F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0705L</td><td>Bez glicerolu</td></tr><tr><td>Kolby do filtrowania próżniowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVU05RE</td><td>Pory 0.2 mm</td></tr><tr><td>Kuleczki POROS-AL</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-6028-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aleuria aurantia&lt;/em&gt; lektyna</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1390</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra&lt;/em&gt; aglutynina</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1300</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoborowodorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296945</td><td>Roztwór 5.0 M</td></tr></tbody></table>

metoda hplc z wykorzystaniem lektyn do selektywnego wzbogacania glikopeptydów z złożonych próbek biologicznych

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glikany stanowią ważną klasę modyfikacji potranslacyjnych. Struktury glikanów, występujące zazwyczaj w cząsteczkach wydzielanych i zewnątrzkomórkowych, sygnalizują stan wewnętrzny komórki. Glikany w komórkach nowotworowych wykazują tendencję do obfitości reszt kwasu sialowego i fukozy. Proponujemy, aby te związane z nowotworami warianty glikanów zostały wykorzystane do opracowania biomarkerów służących do diagnostyki choroby we wczesnym stadium. W związku z tym opracowaliśmy procedurę opartą na spektrometrii mas, która obejmuje chromatografię na macierzach powinowactwa utworzonych z lektyn, czyli białek wiążących specyficzne struktury glikanów. Lektyny Sambucus nigra (SNA) oraz Aleuria aurantia (AAL), które wiążą odpowiednio kwas sialowy i fukozę, zostały kowalencyjnie sprzężone z koralikami POROS (Applied Biosystems) i zapakowane do kolumn PEEK do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). W skrócie, z osocza usunięto czternaście najliczniej występujących białek przy użyciu systemu usuwania wielokrotnego powinowactwa (MARS-14; Agilent). Oczyszczone osocze poddano trawieniu trypsyną, a następnie rozdzielono na frakcje przepływową i związaną za pomocą HPLC z użyciem SNA lub AAL. Frakcje potraktowano enzymem PNGaseF w celu usunięcia glikanów N-stycznych, a następnie przeanalizowano metodą LC-MS/MS na urządzeniu QStar Elite. Dane przeanalizowano za pomocą oprogramowania Mascot. Schemat doświadczalny obejmował kontrole pozytywne — fukozylowane i sialylowane glikopeptydy laktoferryny ludzkiej — oraz kontrole negatywne — glikopeptydy bogate w mannozę z Saccharomyces cerevisiae — które posłużyły do monitorowania swoistości wychwytu lektynowego. Kluczowe cechy tej procedury obejmują powtarzalność wynikającą z formatu HPLC, jednoznaczną identyfikację wychwyconych i potraktowanych PNGaseF glikopeptydów na podstawie ich deamidowanych motywów Asn-Xxx-Ser/Thr oraz ocenę jakości z użyciem wzorców glikoprotein. Optymalizacja protokołu obejmowała również określenie odpowiedniego stosunku materiału wyjściowego do pojemności kolumny, identyfikację najskuteczniejszych buforów do wychwytu i elucji oraz monitorowanie traktowania PNGaseF w celu zapewnienia pełnej deglikozylacji. Kierunki przyszłych badań obejmują wykorzystanie tej procedury do przeprowadzenia eksperymentów odkrywczych opartych na spektrometrii mas z wykorzystaniem osocza pacjentek z rakiem piersi oraz osób z grupy kontrolnej.

Do analizy HPLC wykorzystano kulki POROS sprzężone z lektynami. Standardy glikopeptydów posłużyły jako kontrole pozytywne i negatywne. Osocze ludzkie po usunięciu białek MARS-14 i trawieniu trypsyną poddano chromatografii, a następnie zebrano frakcje przepływowe (FT) oraz związane do analiz ESI-LC-MS/MS. W frakcji związanej odnotowano wzbogacenie glikopeptydów w porównaniu z frakcją FT.

Metoda HPLC z wykorzystaniem lektyn do selektywnego wzbogacania glikopeptydów z złożonych próbek biologicznych

Glikany stanowią istotną klasę modyfikacji potranslacyjnych. Struktury glikanów, występujące zazwyczaj w cząsteczkach wydzielanych i pozakomórkowych, sygnalizują...

Niniejsza procedura służy do izolacji specyficznie glikozylowanych glikopeptydów z ludzkiej osocza. Osocze poddawane jest trawieniu trypsyną w celu uzyskania mieszaniny peptydów oraz standardów glikopeptydów. Do osocza dodaje się kontrole pozytywne i negatywne dla chromatografii lektynowej.Próbkę poddaje się wysokosprawnej chromatografii cieczowej z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa do lektyn. Stosowane lektyny wiążą odpowiednio fukozę i kwas sjalowy, natomiast peptydy oraz nieistotne glikopeptydy są wymywane z kolumny w frakcji przepływowej. Do wymycia frakcji związanej z kolumny używa się kwasu octowego.Jest to wzbogacone o specyficznie zmodyfikowane glikopeptydy. Cześć, nazywam się Penny Drake i pracuję w laboratorium Susan Fisher w Departamencie Położnictwa, Ginekologii i Nauk o Rozrodzie oraz w placówce spektrometrii mas San Lamore na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. A ja jestem Eric Johansen, również z placówki spektrometrii mas Sandler Moore oraz z laboratorium Fisher.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przeprowadzania chromatografii lektynowej w celu wzbogacenia glikopeptydów z ludzkiej plazmy oraz innych złożonych mieszanin. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium jako uniwersalne narzędzie o licznych zastosowaniach. Odgrywa ona na przykład istotną rolę w naszym procesie poszukiwania biomarkerów raka piersi.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, załóż maskę, aby zapobiec wdychaniu kulek. Następnie odważ 100 mg kulek porowatych i przenieś je do czystej probówki typu eppendorf.Do zapakowania jednej kolumny potrzeba około 300 µL kulek. Dodatkowo należy odważyć niekonjugowaną lektynę i przenieść ją do czystej probówki typu einor. Stosowane są lektyny SNA oraz A A L.Następnie dodaj PBS do lektyny, aby przygotować roztwór o stężeniu od 5 do 20 mg/ml. Odstaw 25 µl tego roztworu wstępnie skoniugowanego. Następnie przemyj kuleczki (beads), dodając 1 ml PBS i wirując w mikrocentry fudze z maksymalną prędkością.Przez trzy minuty usuwaj supernatant i powtarzaj płukanie. Teraz pracuj pod wyciągiem i przelej pozostały roztwór lektyny do wypłukanych kulek poro. Następnie dodaj boro-wodorek sodu do stężenia końcowego 50 millimolar.Należy pamiętać, że borowodorek sodu jest toksyczny i odpady muszą być utylizowane w odpowiedni sposób. Szczelnie zamknąć probówkę za pomocą Parafilmu i umieścić na kołysce w celu przeprowadzenia reakcji przez noc w temperaturze pokojowej. Po nocnym wiązaniu lektyny z kuleczkami, odwirować kuleczki. Odmienić nadsącz i zachować go jako roztwór po sprzęganiu do blokowania pozostałych aktywnych miejsc na kuleczkach.Najpierw należy wyprać kuleczki, wirując je z jednym mililitrem buforu gaszącego składającego się z 1 M CL o pH 7.4. Następnie dodać jeden mililitr buforu gaszącego oraz wodorek sodu do stężenia końcowego 50 mM. Przenieść probówkę na wytrząsarkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Proces wygaszania reakcji został zakończony. Odwiruj kuleczki w wirówce, postępując zgodnie z wcześniejszą procedurą.Usuń nadsącz, a następnie pięciokrotnie przemyj kulki 1 mL 1 M NaCl, za każdym razem odrzucając nadsącz. Wykonaj pomiar stężenia białka w roztworach lektyny przed i po koniugacji, a różnicę wykorzystaj do określenia ilości białka skoniugowanego z kulkami porro. Docelowe stężenia lektyny wynoszą od 2 do 20 mg/mL, obliczane jako ilość białka skoniugowanego w odniesieniu do objętości kulek.Skoniugowane koraliki porro są teraz gotowe do zapakowania do kolumny. Aby zapakować koraliki do kolumny, należy złożyć układ do pakowania składający się z dwóch kolumn osadzonych na metalowym statywie pierścieniowym. Górna kolumna służy jako rezerwuar dla materiału do pakowania.System pakowania składa się z elementów ułożonych od dołu do góry: ogranicznika ciśnienia, sprzęgacza końcowego kolumny jeden przed kolumną docelową, sprzęgacza końcowego kolumny, konektora kolumny dwa, sprzęgacza końcowego kolumny trzy, kolumny zbiornika, sprzęgacza końcowego kolumny cztery oraz złączki końcowej. Następnie resuspender 300 µL porro speeds w 600.Mikrolitry buforu A. W celu zapakowania jednej kolumny, przenieś kuleczki do górnego zbiornika kolumny. Dodawaj bufor A, aż osiągnie on górną krawędź kolumny. Ostrożnie umieść złączkę końcową na górze kolumny.Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza w kolumnie. Połączyć końcówkę górnej kolumny z systemem HPLC. Spakować kolumnę, przepuszczając przez system bufor A lub PBS.Zacznij od przepływu wynoszącego 0,5 milliliters per minute. Zwiększaj przepływ o 0,5 milliliters per minute w każdej minucie, aż zostanie osiągnięta wartość 4 milliliters per minute lub maksymalne ciśnienie. Kontynuuj przy maksymalnym możliwym przepływie, dopóki przez kolumnę nie przepłynie co najmniej 35 milliliters buforu.Po zakończeniu wyłącz pompy i poczekaj, aż ciśnienie w kolumnie spadnie poniżej 20 PSI. Po upakowaniu kolumny ostrożnie rozmontuj system do pakowania, zaczynając od góry. Po dotarciu do końcowego łącznika kolumny dwa, ostrożnie go zdejmij.Używając żyletki, delikatnie usuń materiał wypełniający wystający z góry kolumny. Podczas tej czynności nie wywieraj nacisku na kulki. Odłącz wypełnioną kolumnę od statywu.Umieść nowy fryt w nowej złączce końcowej, a następnie odwróć upakowaną kolumnę, aby połączyć ją ze złączką końcową FR plus na otwartym końcu kolumny. Kolumna jest teraz gotowa do analizy HPLC. Gdy nie jest używana, kolumnę można przechowywać w PBS z 0,5% azotkiem sodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie sześć miesięcy.Szczegóły programowania urządzenia HPLC będą się różnić w zależności od konfiguracji sprzętowej oraz specyfiki oprogramowania producenta. W tym przypadku wykorzystano system HPLC microme paradigm MG four. Metody są tworzone i uruchamiane w zakładce setup w górnej części ekranu programu.Przedstawiona metoda jest również szczegółowo opisana w towarzyszącym protokole pisemnym. W przypadku korzystania z programu autoprobnika należy również postępować zgodnie z protokołem pisemnym. Należy użyć buforu A jak poprzednio oraz buforu B do przeprowadzenia analizy HPLC i utrzymywać bufory oraz kolumny w temperaturze pokojowej.Zaprogramuj detektor UV tak, aby odczytywał wartości dla 280 nm w przedziale czasowym od 0 do 19 minut i 50 sekund. Dostosuj oś Y, aby wykrywać niskie poziomy absorbancji w zakresie od 0 do 50 jednostek absorbancji. Następnie przygotuj próbki.Próbki testowe pochodzą z ludzkiej osocza, z której usunięto 14 najliczniejszych białek przy użyciu kolumny Mars. Wykorzystano próbki osocza po usuwaniu białek oraz dwa standardy. Ludzką laktoferrynę oraz inwertazę drożdżową poddano oddzielnie trawieniu trypsyną i odsalaniu zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.Aby zneutralizować próbki, należy przygotować bufor neutralizujący w probówkach, w których będzie zbierany EIT; dla paradygmatu MG 4 jedna probówka służy do zbierania części przepływowej, a trzy do zbierania eluatu. Do neutralizacji 1 mL EIT potrzeba około 1,5 mL buforu. Docelowe pH po neutralizacji powinno wynosić od 7,0 do 8,0.Należy sprawdzić końcowe pH za pomocą papierka wskaźnika pH. Próbki należy odsolić zgodnie z opisem zawartym w dalszej części niniejszego protokołu. Dla uzyskania najlepszych rezultatów próbkę należy ponownie zawiesić w jednym mililitrze buforu A.Przeprowadź trzy powtórzenia doświadczenia, aby umożliwić porównanie i połączenie danych. W celu przygotowania próbek dla trzech powtórzeń, dodaj trzy pikomole trypsyną trawionej inwertazy oraz jeden mikrolitr oczyszczonej metodą HPLC lektyny specyficznej dla laktoferryny do 30 mikrolitrów osocza uszczuplonego z trypsyny (plasma equivalents lub pe). Odpowiada to około 50 mikrogramom białka osocza wykorzystanego dla każdego powtórzenia. Dodaj bufor A do próbki, aby osiągnąć końcową objętość 330 mikrolitrów, co daje 110 mikrolitrów na jedno powtórzenie doświadczenia, korzystając z kolumny z lektyną AAL lub SNA. Najpierw przeprowadź dwa pomiary kontrolne (blank), wstrzykując wyłącznie bufor A. Upewnij się, że kolumna z lektyną odpowiada lektynie specyficznej dla laktoferryny użytej jako standard i wcześniej oczyszczonej chromatograficznie.Trzy próbki plazmy, wstrzykując próbę ślepą pomiędzy każdą wstrzykiwaną próbkę, co daje łącznie siedem przebiegów HPLC. Frakcji z przebiegów ślepych nie trzeba zbierać. Ponownie upewnij się, że próbki zostały zneutralizowane poprzez umieszczenie buforu neutralizującego w probówkach z próbkami, w których zbierany jest eluat po odsoleniu i trawieniu P-N-G-A-F; próbki będą wtedy gotowe do analizy spektrometrycznej.Do odsolenia każdej z frakcji HBLC standardu laktoferyny oraz próbek eksperymentalnych należy użyć jednego wkładu Waters Oasis HLB SPE o pojemności 1 ml. Rozpocznij od zamocowania wymaganej liczby wkładów w kolektorze próżniowym. Każdy wkład zwilż 1 ml 80% acetonitrylu w 1% kwasie mrówkowym.Wskazówka próżniomierza na kolektorze powinna wskazywać od 5 do 20 cali Hg. Równoważymy wkłady 1,5 ml 0,1% kwasu mrówkowego. Ponownie, wskazówka próżniomierza na kolektorze powinna wskazywać od 5 do 20 cali Hg.Nanieś całą objętość jednej próbki na jeden wkład. W tym momencie manometr próżniowy na kolektorze powinien wskazywać od 2 do 2,5 cala. Szybkość przepływu nie powinna przekraczać 1 ml/min.Przemyj kolumny trzy razy jednym mililitrem 0,1% kwasu mrawkowego, używając oddzielnej opisanej probówki do każdego wkładu. Eluuj glikopeptydy za pomocą jednego mililitra 80% acetonitrylu w 0,1% kwasie mrawkowym; zneutralizuj eluat, dodając 60 mikrolitrów 0,5 M wodorowęglanu amonu do każdej probówki. Docelowe zneutralizowane pH powinno wynosić od 7,0 do 8,0.Należy sprawdzić końcowe pH za pomocą papierka wskaźnika pH. Skoncentrować eluowane peptydy do objętości około 50 µL, używając wirówki próżniowej, takiej jak Thermo Savant SpeedVac, przez około dwie godziny w temperaturze 35 °C. Ponownie sprawdzić pH próbki po koncentracji, aby upewnić się, że mieści się ono w zakresie od 7,0 do 8,0. W razie potrzeby dodać 50 mM wodorowęglanu amonu, aby zwiększyć pH.Jeśli końcowa objętość próbki przekracza 100 µL, należy skoncentrować próbkę za pomocą wirówki próżniowej, aż osiągnie objętość od 50 do 100 µL. Następnie należy usunąć węglowodany typu N z peptydów, dodając 250 jednostek bezglikolowego P-N-G-A-F (peptide n glycosidase F) do każdej probówki z próbką i inkubując w temperaturze 37 °C przez noc. Po nocnej inkubacji z P-N-G-S-F należy użyć końcówek do pipet typu zip tip zawierających matrycę C 18 w odwróconej fazie, aby odsolić próbki przed rozpoczęciem procedury.Przygotuj dwie krople na kawałku parafilmu do mycia i elucji: jedną z 0,1% kwasu mrówkowego oraz drugą z 80% acetonitrylu z dodatkiem 0,1% kwasu mrówkowego. Stosowanie kropli zapobiega kontaminacji krzyżowej peptydów pomiędzy próbkami; dla każdej próbki pobieranej za pomocą zip tipa należy przygotować nowe krople. Rozpocznij od zwilżenia zip tipa roztworami acetonitrylu. Uzrównoważ zip tip, pobierając i wydmuchując trzykrotnie 10 µL 0,1% kwasu mrówkowego.Załaduj próbkę, pipetując ją w górę i w dół 10 razy. Następnie pięciokrotnie przemyj końcówkę 10 µL 0,1% kwasu mrawkowego. Na koniec dwukrotnie eluuj próbkę za pomocą 80% acetonidu trial w 1% kwasie mrawkowym, zbierając eluowane peptydy do probówki typu Eppendorf.Zredukuj objętość próbki do mniej niż 2 µL poprzez zagęszczanie w wirówce próżniowej, a następnie resuspenduj próbki w 20 µL 0,1% kwasu mrawkowego. Próbki są teraz gotowe do analizy metodą L-C-M-S-M-S. Koniugacja z porą zazwyczaj pozwala uzyskać stężenia lektyny na kuleczkach w zakresie od 2 do 20 mg/mL, co jest optymalne dla chromatografii powinowactwa.Chromatografia lektynowa ludzkiej plazmy zdepleconej z Mars, trawionej trypsyną, zazwyczaj wzbogaca frakcję związaną w glikopeptydy. Nasz schemat postępowania identyfikuje glikopeptydy z wiązaniem N, które zawierają niepowiązaną sekwencję konsensusową NXS lub NXT, gdzie X to dowolny aminokwas z wyjątkiem proliny. Obróbka PNGF usuwa niepowiązane glikany i deaminuje resztę asparaginy, do której przyłączone były glikany.Deamidacja powoduje przesunięcie masy o jeden Dalton w przypadku deglikozylowanego peptydy lub deglikopeptydu w stosunku do peptydu niemodyfikowanego. Zatem deglikozylowane glikopeptydy są identyfikowane jako peptydy zawierające sekwencję konsensusową wiązania N, w której reszta asparaginy w obrębie sekwencji konsensusowej jest deamidowana, co objawia się różnicą masy wynoszącą plus jeden w porównaniu z niemodyfikowaną resztą asparaginy. Tutaj dwa przykładowe widma ilustrują tę koncepcję.Górne widmo pokazuje fragmentację niemodyfikowanego peptydu zawierającego sekwencję konsensusową EnLink. Dolne widmo przedstawia fragmentację tego samego peptydu z deaminowaną resztą asparaginy w obrębie sekwencji konsensusowej EnLink. Zakreślone jony molekularne fragmentów Y7, Y8 i B3 deamidowanego peptydu wykazują wzrost masy o jeden Dalton w porównaniu do ich odpowiedników w peptydu niemodyfikowanym.Przesunięcie masy wskazuje, że peptyd na dolnym widmie zawiera odamidowaną resztę asparaginy. Zazwyczaj przy użyciu QStar elite identyfikuje się od 1000 do 1300 peptydów całkowitych w frakcji przepływowej oraz od 200 do 400 peptydów we frakcji związanej. Średnio frakcja przepływowa z chromatografii a l lub SNA zawiera od 2% do 4% deglikopeptydów, podczas gdy 30% do 50% peptydów odzyskanych we frakcji związanej to deglikopeptydy.Używamy określenia deglikopeptydy zamiast glikopeptydów, ponieważ podczas analizy spektrometrycznej obserwowane są cząsteczki deglikozylowane i deamidowane. Przypuszczamy jednak, że większość deglikopeptydów w naszych próbkach stanowiły wcześniej niezwiązane glikopeptydy, które zostały deglikozylowane i deamidowane w wyniku działania PN GF. Wzbogacenie w deglikopeptydy w naszej próbce związanej potwierdza tę hipotezę i pozwala nam wykorzystać detekcję deglikopeptydów jako wskaźnik glikopeptydów wyizolowanych za pomocą naszego protokołu chromatografii powinowactwa z lektynami.W frakcji przepływowej powinny być widoczne dwa lub więcej odrębnych glikopeptydów invertazy d, a we frakcji związanej dwa lub więcej odrębnych glikopeptydów laktoferyny de. Przedstawiliśmy sposób przygotowania kolumn lektynowych oraz przeprowadzenia chromatografii powinowactwa do lektyn w formacie HPLC. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zastosowanie wysokiej jakości próbek glikopeptydów, monitorowanie pH próbek przez cały czas trwania eksperymentu oraz potwierdzenie jakości chromatografii przy użyciu standardów glikopeptydów.To już wszystko. Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

a-lectin-hplc-method-to-enrich-selectively-glycosylated-peptides-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda HPLC z wykorzystaniem lektyn do selektywnego wzbogacania glikozolowanych peptydów ze złożonych próbek biologicznych

Opisujemy metodę analizy zmian w glikanach typu N w początkowej fazie życia glikoprotein po ich biosyntezie w komórkach ssaków. Jest to realizowane poprzez analizę pulse-chase metabolicznie znakowanych glikanów, ich enzymatyczne uwalnianie z glikoprotein oraz badanie za pomocą HPLC.

Analiza typu pulse-chase łańcuchów cukrowych wiązanych glikozydowo do azotu (N-glikanów) w glikoproteinach komórek ssaków

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Ten film demonstruje zasadę rozdzielania hydrofilowych związków polarnych za pomocą hydrofilowej chromatografii cieczowej. Technika ta pomaga w oczyszczaniu różnych analitów polarnych, w tym N-glikanów.

Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych: technika rozdzielania hydrofilowych analitów polarnych za pomocą kulek hydrofilowych

Białka powierzchniowe komórek są biologicznie ważne i szeroko glikozylowane. Przedstawiamy tutaj podejście do wychwytywania glikopeptydów w celu rozpuszczania, wzbogacania i deglikozylowania tych białek w celu łatwego analizowania proteomicznego opartego na LC-MS.

Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

Przedstawiono protokół wzbogacania białek komórek gospodarza (HCP) z produktów leczniczych (DP) i wykrywania peptydów za pomocą kulek wzbogacających proteom. Metodę demonstruje się przy użyciu wyprodukowanej we własnym zakresie substancji leczniczej (DS) opartej na przeciwciałach monoklonalnych (mAb), która jest dobrze scharakteryzowanym materiałem referencyjnym do oceny i porównywania różnych metod pod względem wydajności.

Analiza białek komórek gospodarza przy użyciu kulek wzbogacających w połączeniu z ograniczonym trawieniem

System do automatycznej i szybkiej analizy glikanów na białkach został wcześniej opracowany. W artykule przedstawiono protokół "analizy glikojakościowej", zoptymalizowany dla szerokiego spektrum użytkowników, takich jak osoby zajmujące się analizą struktur glikanów w biofarmaceutykach i innych materiałach glikokoniugatowych.

Szybka ocena glikojakościowa białek rekombinowanych przy użyciu w pełni zautomatyzowanego systemu

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Poznaj metodę HPLC lektyny do wzbogacania glikozylowanych peptydów z ludzkiej plazmy. Technika ta wykorzystuje chromatografię afinitacyjną z kulkami POROS do izolacji glikopeptydów w badaniach nad biomarkerami.

Metoda HPLC z wykorzystaniem lektyn do selektywnego wzbogacania glikopeptydów z złożonych próbek biologicznych

Przeglądaj więcej filmów