Model miażdżycy tętnic szyjnych wywołanej zaburzonym przepływem przez częściowe podwiązanie i prosta metoda izolacji RNA ze śródbłonka tętnicy szyjnej

Ten film przedstawia operację częściowego podwiązania tętnicy szyjnej, w której tętnica szyjna zewnętrzna, tętnica szyjna wewnętrzna i tętnica potyliczna są podwiązywane u znieczulonej myszy w celu wywołania zaburzonych warunków przepływu, a następnie szybkiego rozwoju miażdżycy. Powodzenie operacji weryfikuje się za pomocą ultradźwięków, następnie od poddanej eutanazji myszy pobiera się podwiązane i kontrolowane tętnice szyjne i uzyskuje się RNA śródbłonka o wysokiej czystości. Cześć, nazywam się Doug Na i pracuję w laboratorium Hon Jo na Wydziale Inżynierii Biomedycznej i Kardiologii na Georgia Tech i Uniwersytecie Emory.

Cześć, nazywam się Amir Revan. Również z JO Lab. Będę demonstrować ultradźwiękową weryfikację podwiązania I jestem CHI również z laboratorium szczękowego.

Dzisiaj zademonstruję wewnętrzną preparację RNA. Pokażemy Ci procedurę częściowego podwiązania tętnicy szyjnej, USG, weryfikację podwiązania oraz metodę izolacji intymnego RNA. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania wpływu zwykłego stresu na miażdżycę.

Więc zacznijmy. Przed rozpoczęciem tej procedury sprawdzono głębokość znieczulenia wywołanego ketaminą i ksylazyną. W przypadku ośmiotygodniowej myszy przez uszczypnięcie palca u nogi umieść mysz na stoliku chirurgicznym w pozycji podlinii, przyklej cztery łapy do sceny, dłońmi do góry.

Następnie przyklej taśmą tylne łapy, podeszwy w dół. Użyj gazy jako poduszki na szyję myszy. Następnie nałóż dużą ilość środka do depilacji na szyję zwierzęcia między żuchwą a mostkiem.

Delikatnie masuj obszar, aż wszystkie włosy zostaną usunięte. Za pomocą bawełnianego aplikatora usuń środek do depilacji. Następnie nałóż dużą ilość Betadine za pomocą małych ostrych nożyczek.

Wykonaj pionowe nacięcie o długości od czterech do sześciu milimetrów na środku szyi zwierzęcia, przecinając zarówno skórę, jak i leżącą pod nią powięź. Za pomocą kleszczy preparacyjnych delikatnie przesuń lewą tętnicę szyjną od linii środkowej do lewej strony zwierzęcia. Dosadnie wypreparuj tkankę za pomocą kleszczy preparacyjnych.

Aby odsłonić pulsującą tętnicę szyjną pospolitą. Podążaj za wspólną tętnicą szyjną rozpieszczonie. Aby zlokalizować rozwidlenie.

Ostrożnie przeanalizuj bifurkację, aby odsłonić następujące elementy. Cztery dystalne gałęzie lewej tętnicy szyjnej wspólnej, tętnicy szyjnej zewnętrznej, tętnicy szyjnej wewnętrznej, tętnicy potylicznej i tętnicy tarczycy górnej. Naczynia te, zwłaszcza tarczyca górna, mogą być bardzo delikatne.

Przełóż jeden zestaw kleszczy pod zewnętrzną tętnicą szyjną powyżej górnej tarczycy i chwyć jednocalowy kawałek sześciu jedwabnych szwów z innej pary kleszczy. Delikatnie pociągnij szew, aby przejść pod tętnicą. Mocno zwiąż zewnętrzną tętnicę szyjną, unikając otaczającej tkanki.

Stosując tę samą technikę, zwiąż tętnice szyjne wewnętrzne i potyliczne jednym węzłem. Po sprawdzeniu położenia szwów i drożności tętnicy tarczycy górnej za pomocą oględzin, należy cofnąć śliniankę przyuszną, zbliżyć skórę i użyć tkanek do zamknięcia skóry. Po zabiegu chirurgicznym umieść mysz w komorze grzewczej, aż dojdzie do siebie.

Zwykle od 30 do 60 minut. Myszy można następnie przenieść do ich zwykłego obszaru utrzymania. Umieść trochę jedzenia na dnie klatki, ponieważ myszy mogą czuć się nieswojo, sięgając po jedzenie pierwszego dnia.

Następnego dnia należy podać pojedynczą dawkę buprenorfiny w celu złagodzenia bólu. Jeden dzień po podwiązaniu. Przygotuj znieczulone fluorem zwierzę do badania ultrasonograficznego, umieszczając je na stoliku do obrazowania brzuchem do góry.

Przyklej ręce i nogi do czujnika EKG. Nałóż żel echo na szyję zwierzęcia. Temperatura ciała zwierzęcia powinna być monitorowana przez cały czas trwania zabiegu.

Włącz komputer i oprogramowanie do obrazowania. Wybierz odpowiedniego użytkownika i sondę echa. Ustaw ultradźwięki w trybie pszczoły.

Następnie, trzymając pokrętło sondy skierowane w stronę nosa myszy, opuść sondę na szyję myszy, aż do uzyskania obrazu. Manipuluj stolikiem sondy w prawo i w lewo, aż będzie można zidentyfikować tchawicę. Następnie znajdź lewą tętnicę szyjną wspólną i przechyl stolik obrazowania tak, aby powstał kąt między płaszczyzną obrazowania a tętnicą szyjną.

Przełącz ultradźwięki z trybu B na dopplera fali tętna, utrzymując sondę w środku lewej tętnicy szyjnej wspólnej. Użyj pokrętła korekcji kąta, aby wyregulować kąt tak, aby linia korekcji kąta była równoległa do wspólnej tętnicy szyjnej. Zrób zdjęcie, naciskając przycisk przechowywania klatek.

Profil prędkości krwi w tętnicy szyjnej wspólnej zostanie udokumentowany. Spodziewane jest odwrócenie profilu prędkości podczas rozkurczu. Powtórz kolejne kroki na prawej wspólnej tętnicy szyjnej dla porównania.

Prędkość będzie wyższa i nie będzie widać odwrócenia w prawej tętnicy szyjnej wspólnej. Po uzyskaniu zadowalających obrazów wyłącz znieczulenie i zetrzyj żel echo z myszy. Uwolnij mysz od ograniczeń taśmy.

Umieść zwierzę w ogrzewanej komorze rekonwalescencji. Powrót do zdrowia po wdychaniu izofluoru następuje zwykle w czasie krótszym niż pięć minut. Przyklej pauzę myszy poddanej eutanazji dwutlenkiem węgla do ręcznika papierowego za pomocą nożyczek.

Przetnij skórę myszy od brzucha do górnej części klatki piersiowej. Następnie za pomocą ostrych nożyczek otwórz ścianę brzucha poniżej klatki piersiowej za pomocą kleszczy. Podnieś mostek i przetnij przeponę.

Odetnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Następnie przeciąć żyłę CVA, używając zestawu do perfuzji motyla, perfuzję ciśnieniową przez dwie do trzech minut zwykłą solą fizjologiczną zawierającą 10 jednostek na mililitr heparyny przez lewą komorę, aż płuca i wątroba staną się blade. Po perfuzji soli fizjologicznej przeciąć skórę szyi i usunąć wszystkie mięśnie tłuszczowe i tkanki łączne, aż do odsłonięcia tętnic szyjnych.

Teraz umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą punktowego otworu igły o rozmiarze 29 tuż poniżej miejsc podwiązania w lewej tętnicy szyjnej w celu drugiej perfuzji. Ponownie wykonać perfuzję ciśnieniową przez około minutę przez lewą komorę, upewniając się, że lewa tętnica szyjna jest dobrze ukrwiona po drugiej perfuzji. Użyj kleszczyków z cienką końcówką i małych nożyczek sprężynowych, aby ostrożnie usunąć tkanki okołozębne otaczające tętnice szyjne.

Uważaj, aby nie ściskać ani nie rozciągać tętnic szyjnych podczas tego etapu czyszczenia między łukiem aorty a punktami podwiązania powyżej rozwidlenia tętnicy szyjnej. Przetnij lewą tętnicę szyjną, a następnie między prawą podobojczykową a punktem rozgałęzienia tętnicy a rozwidleniem tętnicy szyjnej. Przeciąć prawą tętnicę szyjną.

Przenieść tętnice szyjne do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego zawierającego lodowaty HBSS. Ostrożnie usuń pozostałą tkankę przybyszową. Włożyć strzykawkę insulinową z igłą o rozmiarze 29 do jednego końca tętnicy szyjnej i chwycić tętnicę szyjną oraz końcówkę igły kleszczami.

Szybko i ostrożnie. Przepłucz każdą tętnicę szyjną 150 mikrolitrami buforu do lizy cazo, zbierając bufor w 1,5 mililitrowej probówce oznaczonej intima eit. Na koniec opłucz każdą tętnicę szyjną raz w HBSS.

Następnie umieść go w 1,5-mililitrowej mikrotubie fuge z etykietą media plus adventitia i zatrzask. Zamroź go w ciekłym azocie. RNA można następnie wyekstrahować z zamrożonych próbek za pomocą ginu.

Zestaw Micro RZ mini. Badanie ultrasonograficzne myszy przeprowadzono dzień po częściowym podwiązaniu lewej tętnicy szyjnej, jak pokazano na tym rysunku, udane częściowe podwiązanie zmniejsza prędkość przepływu krwi i odwraca przepływ w lewej tętnicy szyjnej wspólnej podczas częściowego podwiązania rozkurczowego myszy z nokautem APOE na diecie wysokotłuszczowej indukuje solidną miażdżycę w lewej tętnicy szyjnej wspólnej, ale nie w przeciwległej prawej tętnicy szyjnej o dwa tygodnie. Miażdżyca jest pokazana za pomocą barwienia czerwienią olejową dla lipidów i barwnika przeciwstawnego hemat toiny dla jąder.

RNA pobrane z błony wewnętrznej tętnicy szyjnej zawiera geny markerowe śródbłonka, takie jak pcam, jeden marker komórek mięśni gładkich przyśrodkowej. Geny, takie jak alfa SMA, są nieobecne w RNA pobranym z pozostałej części tętnicy, oznaczonym m plus A dla media plus przydanka, marker mięśni gładkich jest obecny, podczas gdy marker śródbłonka jest nieobecny. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać częściowe podwiązanie tętnicy szyjnej.

Użyj ultradźwięków, aby zweryfikować ligację, a także metodę izolacji wewnętrznego RNA Podczas wykonywania tej procedury konieczne jest prawidłowe zidentyfikowanie gałęzi wspólnej prawidłowej tętnicy i upewnienie się, że górny wzór odtworzenia tętnicy tarczycowej, podczas gdy inne gałęzie są ściśle podwiązane. Ważne jest, aby zweryfikować wynik podwiązania za pomocą ultradźwięków podczas, w prostym preparacie, należy zwrócić uwagę, aby przepłukany iLet nie miał kontaktu z żadną inną częścią tętnicy poza światłem. To powiedziawszy, dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.