Name: Model miażdżycy tętnic szyjnych wywołanej zaburzonym przepływem przez częściowe podwiązanie i prosta metoda izolacji RNA ze śródbłonka tętnicy szyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-22T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj model miażdżycy tętnic szyjnych wywołanej zaburzonym przepływem u myszy oraz metodę izolacji RNA ze śródbłonka. Technika obejmuje częściowe podwiązanie tętnic z weryfikacją ultrasonograficzną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez fundusze z grantów NIH HL87012 (HJ), HL75209 (HJ), UO1HL80711 (DH, DG, HJ) oraz projektu World Class University (HJ) finansowanego przez Ministerstwo Nauki, Technologii i Edukacji Korei Południowej.

1. Częściowe podwiązanie lewej tętnicy szyjnej
 <ol>
 <li>Do doświadczeń wykorzystuje się myszy w wieku około 8 tygodni. Zaleca się, aby waga myszy wynosiła co najmniej 18 g.</li>
 <li>Sterylizuj narzędzia przez 30 s w sterylizatorze koralikowym i pozostaw do ostygnięcia.</li>
 <li>Wprowadź zwierzę w stan znieczulenia za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego (i.p.) Ketaminy (80 mg/kg) i Ksylazyny (10 mg/kg) lub alternatywnego środka znieczulającego zatwierdzonego przez IACUC. W przypadku wstrzyknięcia i.p., wykonaj zastrzyk w lewy dolny kwadrant brzucha myszy.</li>
 <li>Umieść mysz w komorze grzewczej do momentu pełnego znieczulenia. Zweryfikuj głębokość znieczulenia, sprawdzając reakcję na uciśnięcie palca u nogi.</li>
 <li>Umieść mysz na stole operacyjnym w pozycji grzbietowej (brzuchem do góry). Przymocuj łapami przednimi dłońmi do góry oraz łapami tylnymi podeszwami do dołu do stołu za pomocą taśmy.</li>
 <li>Nanieś obfitą ilość preparatu do depilacji (np. Nair) na szyję między żuchwą a mostkiem. Delikatnie masuj, aż do całkowitego usunięcia włosów.</li>
 <li>Zmyj preparat do depilacji i nanieś obfitą ilość Betadyny na zdepilowany obszar.</li>
 <li>Przygotuj fragmenty nici jedwabnej 6-0 o długości 1 cala do ligacji. Dla każdej myszy będą potrzebne dwa kawałki nici.</li>
 <li>Za pomocą ostrych, małych nożyczek wykonaj nacięcie pionowe o długości 4-6 mm na środku szyi. Należy przeciąć zarówno skórę, jak i leżącą pod nią powięź.</li>
 <li>Przesuń lewy gruczoł ślinowy przyuszny z linii środkowej w lewo i rozpocznij rozdzielanie tępe narzędziem tuż po prawej stronie tchawicy. Powinieneś być w stanie łatwo zidentyfikować pulsującą lewą tętnicę szyjną wspólną.</li>
 <li>Podążaj za tętnicą szyjną wspólną w kierunku ogonowym, aż zlokalizujesz miejsce jej rozwidlenia.</li>
 <li>Wykonaj rozdzielanie tępe w miejscu rozwidlenia, aby odsłonić cztery następujące odgałęzienia dystalne lewej tętnicy szyjnej wspólnej: tętnicę szyjną zewnętrzną, tętnicę szyjną wewnętrzną, tętnicę potyliczną i tętnicę tarczową górną. Naczynia te, szczególnie tętnica tarczowa górna, mogą być kruche. Zachowaj dużą ostrożność podczas rozdzielania.</li>
 <li>Podwiąż tętnicę szyjną zewnętrzną POWYŻEJ tętnicy tarczowej górnej, używając nici jedwabnej 6-0. Aby to zrobić, wprowadź jedną pęsetę pod tętnicę i chwyć kawałek wcześniej przeciętej nici za pomocą drugiej pęsety. Delikatnie pociągnij nić, aby przeszła pod tętnicą. Zawiąż ciasły węzeł, unikając uwięzienia w nim otaczających tkanek. Jeśli zawiążesz nić poniżej odejścia tętnicy tarczowej górnej, pod koniec procedury de facto wykonasz całkowitą ligację, co stanowi istotnie inny model.</li>
 <li>Podwiąż tętnicę szyjną wewnętrzną oraz tętnicę potyliczną jednym węzłem, stosując tę samą technikę.</li>
 <li>Zweryfikuj położenie szwów oraz drożność tętnicy tarczowej górnej.</li>
 <li>Zbliż brzegi skóry i zamknij ranę, używając niewielkiej ilości Tissue-Mend.</li>
 <li>Umieść myszy w komorze grzewczej do czasu wybudzenia. Wybudzenie trwa zazwyczaj od 30 do 60 minut.</li>
 <li>Pojedynczą dawkę Buprenorfiny (0,1 mg/kg) należy podać natychmiast po operacji, jeżeli zastosowane znieczulenie nie zapewnia przedłużonego uśmierzenia bólu (np. izofluran wziewny) lub jeśli zwierzę wykazuje oznaki stresu w ciągu pierwszych 24 godzin. W naszym doświadczeniu dawka Ketaminy podana w celu znieczulenia zapewnia wystarczającą analgezję, gdy operację wykonuje doświadczony chirurg i dalsza analgezja nie jest potrzebna.</li>
</ol>
2. Badanie USG tętnic szyjnych
 <ol>
 <li>Aby zweryfikować, czy częściowe podwiązanie spowodowało zaburzenia przepływu, należy zbadać przepływ w tętnicy szyjnej jeden dzień po zabiegu podwiązania</li>
 <li>Wprowadzić zwierzę w stan znieczulenia za pomocą izofluranu – w razie potrzeby można użyć komory do indukcji znieczulenia</li>
 <li>Umieścić znieczulone myszy na stole do obrazowania, brzuchy skierowane ku górze</li>
 <li>Przymocować łapy przednie i tylne taśmą do czujnika EKG na stole do obrazowania</li>
 <li>Usunąć owłosienie z szyi, obficie nakładając preparat Nair (ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy nie został wykonany przed procedurą podwiązania)</li>
 <li>Wprowadzić termometr rektalny w celu pomiaru temperatury</li>
 <li>Nałożyć żel do badań USG na szyję</li>
 <li>Rozpocząć badanie w trybie B-mode.</li>
 <li>Płaszczyzna obrazowania powinna być ustawiona pod kątem 90 stopni (pokrętło na głowicy powinno być skierowane w stronę nosa myszy)</li>
 <li>Obniżyć głowicę na szyję myszy, aż zostanie uzyskany obraz.</li>
 <li>Przesuwać stół w lewo i w prawo, aż do zidentyfikowania tchawicy (struktura w linii środkowej)</li>
 <li>Zidentyfikować lewą wspólną tętnicę szyjną</li>
 <li>Przechylić stół do obrazowania tak, aby powstał kąt między płaszczyzną obrazowania a tętnicą szyjną. Im większy będzie ten kąt, tym silniejszy będzie sygnał Dopplera.</li>
 <li>Umieścić próbkę Dopplera falowego w środkowej części lewej wspólnej tętnicy szyjnej.</li>
 <li>W razie potrzeby zastosować korekcję kąta.</li>
 <li>Powtórzyć pomiary na prawej wspólnej tętnicy szyjnej.</li>
 <li>Prawidłowe częściowe podwiązanie tętnicy szyjnej spowoduje ogólny spadek przepływu (~80-90%) w lewej wspólnej tętnicy szyjnej w porównaniu z prawą stroną, wraz z odwróceniem kierunku przepływu w stronę wlotu aorty podczas rozkurczu.</li>
 <li>Po uzyskaniu satysfakcjonujących obrazów wyłączyć znieczulenie, usunąć żel z ciał myszy i zdjąć taśmy mocujące. Umieścić myszy w ogrzewanej komorze wybudzeń.</li>
	</ol>
3. Izolacja RNA z wewnętrznej błony naczyń tętnic szyjnych
 <ol>
 <li>Uśmierć myszy poprzez inhalację CO2 zgodnie z instytucjonalnym protokołem IACUC</li>
 <li>Przymocuj łapy taśmą do ręcznika papierowego.</li>
 <li>Nacinij skórę myszy od brzucha do górnej części klatki piersiowej.</li>
 <li>Otwórz ścianę brzucha poniżej klatki piersiowej za pomocą ostrych nożyczek.</li>
 <li>Podnieś mostek pęsetą i przetnij przeponę, a następnie odetnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce.</li>
 <li>Przetnij żyłę główną nożyczkami.</li>
 <li>Przeprowadź perfuzję ciśnieniową (120 mmHg) przez 2 do 3 min roztworem soli fizjologicznej zawierającym 10 Units/mL heparyny przez lewą komorę, aż płuca i wątroba staną się blade.</li>
 <li>Nacinij skórę szyi i usuń cały tłuszcz, mięśnie oraz tkanki łączone, aż odsłonięte zostaną tętnice szyjne.</li>
 <li>Umieść mysz pod mikroskopem sekcyjnym.</li>
 <li>Wykonaj nakłucie bezpośrednio poniżej miejsc podwiązania w lewej tętnicy szyjnej w celu przeprowadzenia drugiej perfuzji.</li>
 <li>Ponownie przeprowadź perfuzję ciśnieniową przez ~ 1 min roztworem soli fizjologicznej zawierającym 10 Units/mL heparyny przez lewą komorę, upewniając się, że lewa tętnica szyjna jest dobrze przepłukana.</li>
 <li>Używając pęsety z cienką końcówką i małych nożyczek sprężynowych, ostrożnie usuń tkanki okołozewnętrzne otaczające tętnice szyjne. Należy uważać, aby nie ściskać ani nie rozciągać tętnic szyjnych podczas tego etapu oczyszczania.</li>
 <li>Odetnij lewą tętnicę szyjną między łukiem aorty a punktami podwiązania powyżej rozwidlenia tętnicy szyjnej.</li>
 <li>Odetnij prawą tętnicę szyjną między punktem odgałęzienia prawej tętnicy podobojczykowej a rozwidleniem tętnicy szyjnej.</li>
 <li>Przenieś tętnice szyjne do 35 mm szalki hodowlanej zawierającej lodowaty HBSS. W razie potrzeby ostrożnie usuń pozostałą tkankę okołozewnętrzną.</li>
 <li>Przygotuj strzykawkę insulinową (strzykawka 3/10 ml) z igłą 29g, napełniając ją 150 μl buforu lizującego QIAsol (Qiagen) na każdą tętnicę szyjną.</li>
 <li>Ostrożnie wprowadź końcówkę igły do jednego z końców tętnicy szyjnej.</li>
 <li>Trzymając tętnicę szyjną i końcówkę igły pęsetą, szybko (~ 1 sec) wypłucz bufor lizujący QIAsol (150 μl) do probówki 1,5 ml (eluat błony wewnętrznej).</li>
 <li>Przepłucz raz w HBSS pozostałość tętnicy szyjnej (błona środkowa+zewnętrzna), umieść ją w probówce 1,5 ml i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie.</li>
 <li>Eluat błony wewnętrznej oraz zamrożone pozostałości są następnie wykorzystywane do izolacji RNA z błony wewnętrznej lub błony środkowej+zewnętrznej przy użyciu zestawu miRNeasy mini kit (QIAGEN) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Wykonaliśmy częściową ligaturę lewej tętnicy szyjnej u myszy, a badanie ultrasonograficzne przeprowadzono dzień po zabiegu. Jak pokazano na Rysunku 1, pomyślna częściowa ligatura zmniejsza prędkość przepływu krwi i powoduje odwrócenie kierunku przepływu (przepływ zaburzony) w lewej wspólnej tętnicy szyjnej podczas rozkurczu. Częściowa ligatura u myszy z nokautem genu ApoE (KO), którym podawano dietę wysokotłuszczową, indukuje silną miażdżycę w lewej wspólnej tętnicy szyjnej (LCA), ale nie w przeciwległej tętnicy szyjnej prawej, w ciągu dwóch tygodni (Rysunek 2). RNA wyizolowane z błony wewnętrznej tętnicy szyjnej zawiera geny markerów śródbłonka, takie jak PECAM-1, przy jednoczesnym braku genów markerów komórek mięśni gładkich błony środkowej, takich jak a-SMA (Rysunek 3).
<img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig1.jpg" alt="Schemat łuku aorty przedstawiający podwiązania naczyń, pomiary i kierunki przepływu; badanie anatomiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Schemat anatomii i podwiązań tętnic szyjnych: Podwiązano trzy odgałęzienia lewej tętnicy szyjnej wspólnej (LCA) [tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA), tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) oraz tętnicę potyliczną (OA)], pozostawiając otwartą tętnicę tarczycy górną (STA).
<img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig2.jpg" alt="Wykresy przepływu Dopplera pokazujące zmiany prędkości w LCA i RCA przed i po ligacji w czasie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2: Obrazy ultradźwiękowe przedstawiają profile prędkości przepływu i wykazują, że częściowa ligacja indukuje odwrócenie przepływu (wskazane strzałkami) w LCA podczas rozkurczu. Przepływ w RCA pozostaje niezmieniony po ligacji.
<img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig3.jpg" alt="Postęp miażdżycy u myszy ApoE KO; przekroje histologiczne, LCA i RCA w 1-3 tygodniu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3: Częściowe podwiązanie i dieta wysokotłuszczowa szybko indukują miażdżycę w LCA u myszy ApoE KO. Myszy ApoE KO poddano częściowemu podwiązaniu i karmiono dietą wysokotłuszczową przez okres od 1 do 3 tygodni. Zamrożone przekroje LCA barwiono Oil-Red-O.
<img src="/files/ftp_upload/1861/1861fig4.jpg" alt="Wyniki PCR wykazujące ekspresję PECAM-1 i α-SMA; wykresy słupkowe porównują poziomy w błonie wewnętrznej i w warstwie środkowej+zewnętrznej (m+a)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Metoda preparacji RNA z błony wewnętrznej. RNA z błony wewnętrznej oraz RNA z warstwy środkowej i zewnętrznej (m+a) uzyskano z prawej tętnicy wieńcowej (RCA) i lewej tętnicy wieńcowej (LCA) u myszy C57BL/6 po zabiegu pozorowanym. RNA analizowano za pomocą półilościowego RT-PCR (A) oraz qPCR (B, C) pod kątem PECAM-1 i α-SMA, stosując 18s jako kontrolę wewnętrzną. Wykresy słupkowe przedstawiają średnią ± SEM, n=3.

<ol><li>Korshunov, V. A., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+vascular+remodeling+in+the+mouse%3A+a+model+for+carotid+intima-media+thickening%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-induced vascular remodeling in the mouse: a model for carotid intima-media thickening.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (12), 2185-2191 (2003).</li>
<li>Sullivan, C. J., Hoying, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+remodeling+in+the+carotid+artery+of+fibroblast+growth+factor-2+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent remodeling in the carotid artery of fibroblast growth factor-2 knockout mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (7), 1100-1105 (2002).</li>
<li>Nam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow%2C+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).</li>
</ol>

W tej procedurze niezbędna jest prawidłowa identyfikacja wszystkich odgałęzień tętnicy szyjnej wspólnej, w tym tętnicy szyjnej zewnętrznej, tętnicy szyjnej wewnętrznej, tętnicy potylicznej i tętnicy tarczyowej górnej. Ważne jest również zweryfikowanie wzorca przepływu za pomocą ultrasonografii, zgodnie z prezentacją. Dzięki naszemu doświadczeniu, skuteczność zabiegów częściowego podwiązania w oparciu o badania ultrasonograficzne przeprowadzone na ponad 500 myszach przekracza 90%. W przypadku przygotowania RNA z błony wew...

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna (0,9% NaCl)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>2B1323</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa (strzykawka 3/10 ml 29g)</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>8881600145</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Cellgro</td><td>21-023</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miRNeasy mini kit (w tym QIAzol)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>System wysokorozdzielczego obrazowania mikro Vevo 770</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>a.System Visualsonics 770 b.Stół do obrazowania c.Zintegrowany system szynowy Vevo d.Głowica skanująca RMV dla myszy</td><td>lub system podobny</td></tr><tr><td>Sznur jedwabny 6-0, sterylny</td><td>Covidien</td><td>s-1172 c2</td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5675</td><td>lub podobne</td></tr><tr><td>Pinceta anatomiczna</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>lub podobna</td></tr><tr><td>Tissue Mend II</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-856-7946</td><td></td></tr></tbody></table>

model miażdżycy indukowanej zaburzeniem przepływu w tętnicy szyjnej myszy poprzez częściowe podwiązanie oraz prosta metoda izolacji rna z endotelium tętnicy szyjnej

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Pomimo dobrze znanego bliskiego związku, brakowało bezpośrednich dowodów łączących zaburzony przepływ z aterogenezą. Niedawno zastosowaliśmy zmodyfikowaną wersję metod częściowego podwiązania tętnicy szyjnej [1,2], aby wykazać, że indukuje ona w sposób ostry warunki przepływu niskiego i oscylacyjnego — dwie kluczowe cechy przepływu zaburzonego — w wspólnej tętnicy szyjnej myszy. Wykorzystując ten model, dostarczyliśmy bezpośrednich dowodów na to, że zaburzony przepływ rzeczywiście prowadzi do szybkiego i silnego rozwoju miażdżycy u myszy z nokautem apolipoproteiny E [3]. Opracowaliśmy również metodę przygotowania RNA z endotelium o wysokiej czystości z błony wewnętrznej tętnicy szyjnej myszy [3]. Stosując ten model mysi oraz tę metodę, stwierdziliśmy, że częściowe podwiązanie powoduje dysfunkcję śródbłonka w ciągu tygodnia, po czym w ciągu dwóch tygodni następuje silne i szybkie formowanie się miażdżycy w hiperlipidemicznym modelu mysim, wraz z cechami tworzenia złożonych zmian, takimi jak neowaskularyzacja wewnątrzblaszczkowa do czwartego tygodnia. Ten szybkiin vivomodel i metoda przygotowania RNA z komórek śródbłonka mogą zostać wykorzystane do określenia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zależnej od przepływu regulacji biologii naczyń i chorób. Mogą one również służyć do testowania różnych interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na dysfunkcję śródbłonka i miażdżycę w znacznie krótszym czasie trwania badania.

Opisano tutaj zabieg częściowego podwiązania tętnicy szyjnej, który wywołuje zaburzenia przepływu krwi i późniejszy rozwój miażdżycy (w ciągu dwóch tygodni) z neowaskularyzacją wewnątrzblaszczkową (w ciągu czterech tygodni) w wspólnej tętnicy szyjnej myszy. Opisano również nową metodę izolacji RNA z błony wewnętrznej tętnicy szyjnej, zapewniającą wysoką czystość RNA śródbłonkowego.

Model miażdżycy indukowanej zaburzeniem przepływu w tętnicy szyjnej myszy poprzez częściowe podwiązanie oraz prosta metoda izolacji RNA z endotelium tętnicy szyjnej

Mimo powszechnie znanego ścisłego związku, brakowało bezpośrednich dowodów łączących zaburzenia przepływu z aterogenezą. Niedawno zastosowaliśmy zmodyfikowany...

W tym filmie zaprezentowano zabieg częściowego podwiązania tętnic szyjnych, w którym u znieczyszonych myszy podwiązuje się tętnicę szyjną zewnętrzną, tętnicę szyjną wewnętrzną oraz tętnicę potyliczną w celu wywołania zaburzeń przepływu i następującego po nich szybkiego rozwoju miażdżycy. Sukces operacji weryfikuje się za pomocą ultradźwięków, a następnie z uśpionej myszy pobiera się podwiązane i kontrolne tętnice szyjne, z których izoluje się wysoko oczyszczone RNA endotelialne. Cześć, nazywam się Doug Na, pracuję w laboratorium hon Jo w Zakładzie Inżynierii Biomedycznej i Oddziale Kardiologii na Georgia Tech oraz Emory University.Cześć, nazywam się Amir Revan. Również z JO Lab. Zaprezentuję weryfikację ligacji za pomocą ultradźwięków. A ja jestem CHI, również z JO Lab.Dzisiaj zaprezentuję przygotowanie wewnątrzpochodnego RNA. Przedstawimy procedurę częściowego podwiązania tętnicy szyjnej, badanie ultrasonograficzne, weryfikację podwiązania oraz metodę izolacji RNA z tkanek. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania wpływu naprężenia ścinającego na miażdżycę.Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem tej procedury należy zweryfikować głębokość znieczulenia indukowanego ketaminą i ksylazyną. U ośmiotygodniowej myszy wykonuje się to poprzez uciśnięcie palca u tylnej łapy. Umieść mysz w pozycji grzbietowej na stole operacyjnym, a następnie przymocuj taśmą cztery łapy do stołu, tak aby dłonie i stopy były skierowane ku górze.Następnie zaklej tylne łapy, kierując podeszwy w dół. Użyj gazy jako podkładki pod szyję myszy. Następnie nanieś obfitą ilość środka do depilacji na szyję zwierzęcia, w obszarze między żuchwą a mostkiem.Delikatnie masuj obszar do czasu usunięcia wszystkich włosów. Za pomocą aplikatora bawełnianego oczyść skórę z preparatu do depilacji. Następnie nałóż obfitą ilość Betadinu, używając małych, ostrych nożyczek.Wykonaj pionowe nacięcie o długości od czterech do sześciu milimetrów na środku szyi zwierzęcia, przecinając skórę oraz leżącą pod nią powięź. Używając pincety anatomicznej, delikatnie przesuń lewą żelazę szyjną z linii środkowej na lewą stronę zwierzęcia. Przeprowadź rozdzielenie tkanek metodą tępą, używając pincety anatomicznej.Aby odsłonić pulsującą tętnicę szyjną wspólną. Śledź ostrożnie tętnicę szyjną wspólną. Aby zlokalizować miejsce rozwidlenia.Ostrożnie przeprowadź preparację rozwidlenia, aby odsłonić następujące elementy: cztery dystalne odgałęzie lewej tętnicy szyjnej wspólnej – tętnicę szyjną zewnętrzną, tętnicę szyjną wewnętrzną, tętnicę potyliczną oraz tętnicę tarczycy górną. Naczynia te, w szczególności tętnica tarczycy górna, mogą być bardzo delikatne.Przerowadź jeden zestaw pęsety pod tętnicę szyjną zewnętrzną powyżej tętnicy tarczycowej górnej i chwyć fragment nici jedwabnej 6-0 o długości jednej cala z drugiej pęsety. Delikatnie pociągnij nić, aby przeprowadzić ją pod tętnicą. Mocno podwiąż tętnicę szyjną zewnętrzną, unikając pochwycenia okolicznej tkanki.Stosując tę samą technikę, podwiąż tętnicę szyjną wewnętrzną oraz tętnicę potyliczną za pomocą pojedynczego węzła. Po zweryfikowaniu położenia szwów i drożności górnej tętnicy tarczycy poprzez kontrolę wzrokową, odsuń gruczoł ślinowy przysuchedny, zbliż brzegi skóry i użyj klamer tkankowych do zamknięcia rany. Po zakończeniu procedury chirurgicznej umieść mysz w komorze grzewczej do czasu wybudzenia.Zazwyczaj od 30 do 60 minut. Następnie myszy można przenieść do ich regularnego miejsca zakwaterowania. Na dnie klatki należy umieścić niewielką ilość pokarmu, ponieważ w ciągu pierwszego dnia myszy mogą mieć trudności z sięganiem po jedzenie.W celu uśmierzenia bólu następnego dnia należy podać pojedynczą dawkę buprenorfiny. Jeden dzień po podwiązaniu. Zwierzę znieczulone izofluranem należy przygotować do badania USG, kładąc je na stole obrazującym brzuchem do góry.Przyklej kończyny przednie i tylne do czujnika EKG. Na szyję zwierzęcia nałóż żel do badań USG. Temperaturę ciała zwierzęcia należy monitorować przez cały czas trwania procedury.Włącz komputer oraz oprogramowanie do obrazowania. Wybierz odpowiedniego użytkownika i głowicę echo. Ustaw ultrasonograf w trybie bee.Następnie, kierując pokrętło sondy w stronę nosa myszy, opuść sondę na szyję myszy, aż do uzyskania obrazu. Przesuwaj stolik z sondą w prawo i w lewo, dopóki nie zostanie zidentyfikowana tchawica. Następnie odnajdź lewą wspólną tętnicę szyjną i przechyl stolik obrazujący tak, aby utworzył się kąt między płaszczyzną obrazowania a tętnicą szyjną.Przełącz aparat USG z trybu B na doppler pulsacyjny, utrzymując głowicę w połowie lewej tętnicy szyjnej wspólnej. Użyj pokrętła korekcji kąta, aby dostosować kąt tak, aby linia korekcji kąta była równoległa do tętnicy szyjnej wspólnej. Wykonaj zdjęcie, naciskając przycisk zapisu klatki (frame store).Zarejestrowany zostanie profil prędkości przepływu krwi w tętnicy szyjnej wspólnej. Przewiduje się odwrócenie profilu prędkości podczas rozkurczu. Powtórz powyższe kroki dla prawej tętnicy szyjnej wspólnej w celu porównania.Prędkość będzie wyższa i nie zaobserwuje się przepływu zwrotnego w prawej tętnicy szyjnej wspólnej. Po uzyskaniu satysfakcjonujących obrazów należy wyłączyć znieczulenie i wytrzeć żel do USG z myszy. Następnie należy uwolnić mysz z taśm stabilizujących.Umieść zwierzę w ogrzewanej komorze rekonwalescencyjnej. Wybudzanie po inhalacji izofluranu zazwyczaj następuje w czasie krótszym niż pięć minut. Przytwierdź łapę myszy uśpionej dwutlenkiem węgla do ręcznika papierowego za pomocą taśmy i nożyczek.Naciąć skórę myszy od brzucha do górnej części klatki piersiowej. Następnie, używając ostrych nożyczek, otworzyć ścianę brzucha poniżej klatki piersiowej, posiłkując się pęsetą. Unieść mostek i przeciąć przeponę.Odetnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Następnie przetnij żyłę główną dolną, a używając zestawu do perfuzji motylkowej, przeprowadź perfuzję pod ciśnieniem przez dwie do trzech minut roztworem soli fizjologicznej zawierającym 10 jednostek na mililitr heparyny przez lewą komorę, aż płuca i wątroba staną się blade. Po perfuzji solą fizjologiczną nacinij skórę szyi i usuń wszystkie tkanki tłuszczowe, mięśnie oraz tkanki łączące, aż do odsłonięcia tętnic szyjnych.Następnie umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą igły o rozmiarze 29 G wykonaj nakłucie bezpośrednio poniżej miejsc podwiązania lewej tętnicy szyjnej w celu przeprowadzenia drugiej perfuzji. Ponownie wykonaj perfuzję ciśnieniową przez około jedną minutę poprzez lewą komorę, upewniając się, że lewa tętnica szyjna jest dobrze przepłukana po drugiej perfuzji. Używając pęsety z cienkimi końcówkami i małych nożyczek sprężynowych, ostrożnie usuń tkanki okołoodnowne otaczające tętnice szyjne.Należy uważać, aby podczas tego etapu oczyszczania nie ścisnąć ani nie naciągnąć tętnic szyjnych w odcinku między łukiem aorty a punktami podwiązania powyżej rozwidlenia tętnicy szyjnej. Następnie należy przeciąć lewą tętnicę szyjną między punktem odgałęzienia prawej tętnicy podobojczykowej a rozwidleniem tętnicy szyjnej. Przeciąć prawą tętnicę szyjną.Przenieś tętnice szyjne do 35 milimetrowej szalki hodowlanej zawierającej lodowaty HBSS. Ostrożnie usuń wszelką pozostałą tkankę okołomAPAC. Wprowadź strzykawkę insulinową z igłą 29 G do jednego z końców tętnicy szyjnej, chwytając tętnicę i czubek igły pęsetą.Szybko i ostrożnie. Przepłucz każdą tętnicę szyjną 150 µL buforu lizującego cazo, zbierając bufor do probówki o pojemności 1,5 ml oznaczonej jako intima eit. Na koniec przepłucz każdą tętnicę szyjną raz w HBSS.Następnie umieść to w probówce do wirówki o pojemności 1.5 ml z etykietą „media plus adventitia” i zamknij ją. Zamroź próbkę w ciekłym azocie. Następnie z zamrożonych próbek można wyekstrahować RNA, korzystając z zestawów gin's.Zestaw Micro RZ mini. Badanie ultrasonograficzne myszy przeprowadzono jeden dzień po częściowym podwiązaniu lewej tętnicy szyjnej, jak pokazano na tej figurze; udane częściowe podwiązanie zmniejsza prędkość przepływu krwi i odwraca kierunek przepływu w lewej wspólnej tętnicy szyjnej podczas rozkurczu. Częściowe podwiązanie u myszy z nokautem genu APOE na diecie wysokotłuszczowej indukuje silną miażdżycę w lewej wspólnej tętnicy szyjnej, ale nie w przeciwległej tętnicy szyjnej prawej w ciągu dwóch tygodni. Miażdżycę wykazano za pomocą barwienia lipidów Oil Red O oraz przeciwbarwienia jąder hematoksyliną.RNA pobrane z wewnętrznej błony tętnicy szyjnej zawiera geny markerów śródbłonka, takie jak pcam 1, oraz marker komórek mięśni gładkich warstwy środkowej. Geny takie jak alpha SMA nie występują w RNA pobranym z pozostałej części tętnicy oznaczonej jako m plus A (warstwa środkowa plus zewnętrzna); w tym przypadku obecny jest marker mięśni gładkich, natomiast brak jest markerów śródbłonka. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić częściowe podwiązanie tętnicy szyjnej.Użyj ultradźwięków, aby zweryfikować podwiązanie, a także metodę izolacji RNA z błony wewnętrznej. Podczas wykonywania tej procedury niezbędne jest prawidłowe zidentyfikowanie odgałęzień tętnicy szyjnej wspólnej oraz upewnienie się, że tętnica tarczowa górna pozostaje drożna, podczas gdy pozostałe odgałęzienia są ściśle podwiązane. Ważne jest, aby zweryfikować wynik podwiązania za pomocą ultradźwięków; w prostym przygotowaniu należy zadbać o to, aby przepłukany iLet nie miał kontaktu z żadną inną częścią tętnicy poza jej światłem. Z tym wszystkim, dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

a-model-disturbed-flow-induced-atherosclerosis-mouse-carotid-artery

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model zaburzonego przepływu wywołującego miażdżycę w tętnicy szyjnej myszy poprzez częściowe związanie oraz prosta metoda izolowania RNA z endotelium tętnicy szyjnej

Opaska uciskowa przedstawiona w tym artykule została zaprojektowana w celu wywołania miażdżycy w tętnicy szyjnej wspólnej myszy. Dzięki stożkowatemu kształtowi wewnętrznego światła, wszczepiona opaska generuje wyraźnie określone obszary niskiego, wysokiego i oscylacyjnego naprężenia ścinającego, co wywołuje rozwój zmian miażdżycowych o różnych fenotypach zapalnych.

Implantacja mankietu tętnicy szyjnej w celu wywołania miażdżycy indukowanej naprężeniem ścinającym u myszy

Opisano model implantacji stentu w tętnicy szyjnej myszy. W porównaniu z innymi podobnymi metodami, procedura ta jest bardzo szybka, prosta i dostępna, oferując możliwość zbadania w wygodny sposób reakcji ściany naczyniowej na różne stenty uwalniające leki oraz molekularnych mechanizmów restenozy.

Mysi model implantacji stentu w tętnicy szyjnej do badania restenozy

Opisujemy technikę chirurgiczną, która powoduje uszkodzenie drutu w tętnicy udowej u myszy, aby wywołać przerost neointimalny, który służy jako modelowy system testowania dla okołonaczyniowego dostarczania związków terapeutycznych do hamowania restenozy.

Mysi model uszkodzenia drutu tętnicy udowej z implantacją okołonaczyniowego plastra do dostarczania leków

To badanie opisuje inwazyjną procedurę indukcji przyspieszonej miażdżycy u myszy. W porównaniu z innymi metodami wykorzystującymi urazy wywołane elektrycznością lub kriogenicznością, uraz wywołany mechanicznie naśladuje ludzki stan restenozy po terapiach rewaskularyzacyjnych i jest idealny do badania zaangażowanych mechanizmów molekularnych.

Indukcja przyspieszonej miażdżycy u myszy: model "urazu drutowego"

Zrozumienie komórkowych i molekularnych mechanizmów reendotelializacji po uszkodzeniu po denudacji tętnic ma ogromne znaczenie w zapobieganiu zakrzepicy i restenozie tętnic. W tym miejscu opisujemy protokół powtarzalnego uszkodzenia aorty brzusznej po obnażeniu tętnic. Procedura została opracowana w celu zbadania podstawowych mechanizmów regulujących regenerację śródbłonka przy użyciu modeli mysich.

Powtarzalne uszkodzenie denunacji tętnic przez podnerkowe zaciskanie aorty brzusznej w modelu mysim

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

Obecny protokół opisuje nową technikę opaski aortalnej u myszy w celu wywołania przeciążenia ciśnieniem przerostu mięśnia sercowego. Do banderolowania stosuje się gumowy pierścień o stałej średnicy wewnętrznej. Ta nowa technika obiecuje mniejszą wariancję i bardziej powtarzalne dane dla przyszłych eksperymentów.

O-ring aorty w porównaniu z tradycyjnym poprzecznym zwężeniem aorty w celu modelowania przerostu serca wywołanego przeciążeniem ciśnienia

Tutaj opisujemy dwuetapowy protokół trawienia komórkowego do przygotowania jednokomórkowego zawieszenia tętnic szyjnych myszy.

Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z tętnic szyjnych myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Niniejszy protokół opisuje standaryzowaną metodę chirurgiczną indukcji tętniaków szyjnych w modelu mysim poprzez pojedynczą operację chirurgiczną.

Model myszy powstawania tętniaka szyjnego

Celem tego badania jest opracowanie skutecznej metody osiągania hemostazy w tętnicach myszy.

Prosty i skuteczny zabieg na hemostazę w tętnicach myszy

Poznaj model miażdżycy tętnic szyjnych wywołanej zaburzonym przepływem u myszy oraz metodę izolacji RNA ze śródbłonka. Technika obejmuje częściowe podwiązanie tętnic z weryfikacją ultrasonograficzną.

Model miażdżycy tętnic szyjnych wywołanej zaburzonym przepływem przez częściowe podwiązanie i prosta metoda izolacji RNA ze śródbłonka tętnicy szyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Model miażdżycy indukowanej zaburzeniem przepływu w tętnicy szyjnej myszy poprzez częściowe podwiązanie oraz prosta metoda izolacji RNA z endotelium tętnicy szyjnej

Przeglądaj więcej filmów