Name: Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Poznaj kriotomografię elektronową do wizualizacji ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanie zbliżonym do natywnego. Naucz się technik zamrażania próbek i rekonstrukcji 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo wspierana przez granty Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) R01 AI067548, R01 GM081520, R01 GM086200, R01 AI049194 oraz P01 GM066521 przyznane GJJ, a także przez Howard Hughes Medical Institute, Instytut Beckmana na Caltech oraz darowizny dla Caltech z Gordon and Betty Moore Foundation oraz Agouron Institute. MSL jest wspierany przez grant NIH 2R37-A1041239-06A1 przyznany Pamele S. Björkman. Firma Leica Microsystems Inc. uprzejmie udostępniła materiały wideo z procesu pozyskiwania krioprzekrojów. Reprezentatywne wyniki dotyczące Treponema primitia zostały zebrane i opracowane przez Gavina E. Murphy'ego i opublikowane w czasopiśmie Molecular Microbiology pod tytułem „Novel ultrastructures of Treponema primitia and their implications for motility” (Murphy, G. et al., Mol. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

<ol><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%3A+a+new+view+into+microbial+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li>
<li>Iancu, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285-294 (2001).</li>
<li>Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+cryosectioning+of+cells%2C+facilitated+by+a+micromanipulator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator.</a> J. Microsc. 224, 129-134 (2006).</li>
<li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li>
<li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).</li>
<li>Fernando, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+tomography%3A+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

W niniejszym artykule wideo pokazujemy, jak przeprowadzać ECT komórek bakteryjnych. Ze względu na ograniczenia czasowe i przestrzenne przedstawiamy jedynie ogólny protokół. Więcej szczegółów można znaleźć w publikacjach, w internecie, w informacjach dostarczonych przez producentów sprzętu i twórców oprogramowania oraz w grupach badawczych zajmujących się ECT. W zależności od badanych gatunków bakterii, użytego sprzętu oraz interesujących nas struktur komórkowych, protokół i parametry eksperymentalne muszą zostać przetestowane i zoptymalizowane.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>roztwór 0.1%</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór koloidu złota</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Swojowa albumina bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>10%</td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Nr 1</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>15-25%, MW 39000</td></tr><tr><td>Kopułowy uchwyt mosiężny</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka wysokociśnieniowa Bal-Tec HPm 010</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kriomikrotom UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamentowy nóż do wstępnego przycinania cryo trim 45</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jonizator Static line II</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krioprzewozyer CX100 Dry shipper</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stacja wprowadzania próbek MSH</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop Ti E/B</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Własny</td></tr><tr><td>Stół kriomikroskopowy LM</td><td>FEI</td><td></td><td>Własny</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>Z kamerą UltraCam od Gatan</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

Choć wiele wiadomo już o podstawowym metabolizmie komórek bakteryjnych, wiele fundamentalnych pytań wciąż pozostaje zaskakująco bez odpowiedzi, w tym na przykład to, w jaki sposób generują i utrzymują one specyficzne kształty komórek, ustanawiają polarność, segregują swoje genomy i dzielą się. Aby zrozumieć te zjawiska, potrzebne są technologie obrazowania, które wypełnią lukę w rozdzielczości między fluorescencyjną mikroskopią świetlną a metodami o wyższej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i spektroskopia NMR.
Kriotomografia elektronowa (ECT) to rozwijająca się technologia, która pozwala na wizualizację ultrastruktury komórek w stanie zbliżonym do natywnego, w trzech wymiarach (3D), z rozdzielczością „makromolekularną” (~4nm).1, 2 W ECT komórki są obrazowane w szklistym stanie „zamrożonego nawodnienia” w kriomikroskopie elektronowym transmisyjnym (cryoTEM) w niskiej temperaturze (&lt; -180°C). W przypadku komórek smukłych (o grubości do ~500 nm3), nienaruszone komórki są mrożone metodą plunge-freezing w mediach na siatkach EM w kriogenach, takich jak etan lub mieszaniny etanu i propanu. Grubsze komórki oraz biofilmy mogą być również obrazowane w stanie szklistym poprzez uprzednie „mrożenie wysokociśnieniowe” (high-pressure freezing), a następnie „kriosekcjonowanie”. Następnie gromadzi się serię dwuwymiarowych obrazów projekcyjnych próbki, która jest stopniowo pochylana wzdłuż jednej lub dwóch osi. Z tych obrazów można następnie obliczyć rekonstrukcję trójwymiarową, czyli „tomogram”. Chociaż ECT wymaga drogiej aparatury, w ostatnich latach była ona wykorzystywana w kilku laboratoriach do ujawniania struktur różnych wyrostków zewnętrznych, struktur różnych otoczek komórkowych, pozycji i struktur filamentów cytoszkieletu oraz lokalizacji i architektury dużych kompleksów makromolekularnych, takich jak silniki flagellarne, przedziały wewnętrzne i macierze chemoreceptorów.1, 2
W tym artykule wideo przedstawiamy sposób obrazowania komórek za pomocą ECT, w tym procesy przygotowania próbek, zbierania danych, rekonstrukcji tomogramów oraz interpretacji wyników poprzez segmentację, a w niektórych przypadkach korelację z mikroskopią świetlną.

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Choć na temat podstawowego metabolizmu komórek bakteryjnych wiadomo już wiele, wiele fundamentalnych pytań pozostaje zaskakująco nieodpowiednich, w tym w odniesieniu do...

W niniejszym filmie, za pomocą krioelektronowej tomografii, generowane są obrazy 3D komórek bakteryjnych w stanach bliskich naturalnym z rozdzielczością molekularną. Osiąga się to poprzez wstępne zamrażanie szokowe całych komórek lub alternatywnie zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i kriosekcjonowanie osadów komórkowych. Pozyskiwana jest seria M obrazów projekcyjnych, które służą do wygenerowania rekonstrukcji 3D, czyli tomogramu, który następnie poddawany jest segmentacji i dalszej analizie komputerowej.Witajcie, jestem Grant Jensen z Wydziału Biologii w Caltech, a to jest Sonya Chen, która zorganizowała naszą prezentację. Dzisiaj pokażemy wam, jak przeprowadzić kriotomografię elektronową komórek bakteryjnych. Zazwyczaj całą procedurę wykonuje jedna osoba, ale ponieważ nasze protokoły zostały opracowane w oparciu o wspólne doświadczenia, w prezentacji weźmie udział każdy, kto obecnie pracuje w laboratorium.Oprócz Sony i mnie na nagraniu wideo pojawią się Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, mark Rodinsky oraz Jen. Przechwyty obrazu z ekranu komputera oraz przygotowanie towarzyszącego protokołu pisanego opracowali pozostali członkowie laboratorium, w tym Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova i Dylan Morris. Ariana rozpocznie prezentację, pokazując, w jaki sposób wykonujemy zamrażanie szokowe komórek bakteryjnych.W przypadku cienkich komórek bakteryjnych zawiesinę nienaruszonych komórek zamraża się metodą szybkiego zamrażania (plunge freezing) na siatce EM. W niniejszym materiale proces ten zostanie zaprezentowany z wykorzystaniem komercyjnej automatycznej zamrażarki typu plunge freezer. Należy rozpocząć od zbadania kultur bakteryjnych, aby upewnić się, że są one wolne od zanieczyszczeń i mają odpowiednią konfluencję lub stężenie. Następnie siatkę EM pokrytą węglem poddaje się procesowi glow discharge przez dwie do czterech minut. W kolejnym kroku należy zmieszać 100 µL roztworu złota koloidalnego z 25 µL 5% roztworu BSA.Wiruj mieszaninę przy 18 000 G przez 15 minut. Po wirowaniu odlej nadosad i resuspenduj osad złota. W 20 µL roztworu komórkowego umieść siatkę EM w urządzeniu Vitra bot przy 100% wilgotności.Następnie nanieś 4 µL mieszaniny komórkowej na siatkę EM poddaną wyładowaniom żarowym. Nadmiar cieczy jest automatycznie usuwany z obu stron siatki za pomocą papieru filtracyjnego, po czym siatka zostaje szybko zanurzona w mieszaninie ciekłego etanu i propanu chłodzonej ciekłym azotem. Ostrożnie wyjmij siatkę z mieszaniny etanu i propanu i szybko przenieś ją do pudełka do przechowywania siatek utrzymywanego w ciekłym azocie. W przypadku grubszych komórek mrożenie wysokociśnieniowe zapobiega krystalizacji lodu.Następnie wykonuje się kriosekcjonowanie, aby próbki były wystarczająco cienkie do em. Obrazowanie rozpoczyna się od wirowania 15 mililitrów komórek przy 1000 RPM przez trzy minuty. Po wirowaniu usuwa się nadsącz i miesza 0,5 mililitra pozostałego osadu z 0,5 mililitra 20% krioprotektantu dekstrynowego.Następnie ponownie odwiruj próbkę przy 13 000 RPM przez 15 sekund. Po sformowaniu granulatu komórkowego usuń nadsącz i za pomocą pipety przenieś 0,1 mililitra pasty z granulatu do zgrzanej termicznie końcówki mikropipety, która zawiera już 0,2 mililitra 20% krioprotektanta dekstrynowego. Odwiruj mieszaninę w końcówce mikropipety przy 13 000 RPM przez 30 sekund.Po wirowaniu należy usunąć supernatant. W zamkniętej końcówce widoczny jest zwarty pellet o objętości od 5 do 10 µL. Pastę przenosi się na jedną z półsferycznych powierzchni mosiężnego krążka z powłoką teflonową, zamontowanego już w ramieniu uchwytu mroźnika wysokociśnieniowego, a następnie uszczelnia płaskim mosiężnym kapeluszem.Następnie bezzwłocznie wprowadź zespół ramienia do przygotowanej zamrażarki wysokociśnieniowej. Przy ciśnieniu 2100 bar zintegrowana mosiężna jednostka planchety zawierająca komórki jest gwałtownie schładzana strumieniem ciekłego azotu pod wysokim ciśnieniem. Po schłodzeniu komórek szybko wyjmij zespół ramienia i błyskawicznie zanurz go w kąpieli z ciekłego azotu, aby zapobiec ogrzaniu planchety.Następnie przenieś planszetę do uprzednio schłodzonego uchwytu zaciskowego kriomikrotomu, zamontowanego stabilnie w komorze kriomikrotomu, aby odsłonić zamrożoną kopułkę komórek do sekcjonowania. Dwie mosiężne planszety rozdziela się ostrożnie w ciekłym azocie. Idealnie zamrożona kopułka komórek powinna mieć szklisty wygląd i być wolna od pęknięć oraz szczelin nukleacji lodu.Używając kriomikrotomu, uformuj zewnętrzny obszar kopuły do powierzchni mniejszej niż 0,2 mm² za pomocą diamentowego narzędzia do przycinania przy dużej prędkości sekcjonowania, zachowując głębokość około 200 µm, stosując spray antystatyczny skierowany na nóż o niskim kącie oraz miedziane siatki wspierające. W bliskiej odległości ostrożnie przysuń nóż diamentowy do polerowanej powierzchni bloku, stosując prędkość cięcia około 0,4 mm/s i wąskie okno cięcia. Rozpocznij wycinanie plastrów o grubości od 50 do 350 nm.Za pomocą precyzyjnego aplikatora do rzęs chwyć pierwsze sekcje, zsuwając je z krawędzi noża diamentowego o niskim kącie, a następnie podtrzymuj i prowadź wstęgi sekcji na podpórkę do siatek miedzianych. Po nałożeniu materiału na siatkę, użyj schłodzonej, wypolerowanej srebrnej sondy, aby mocno docisnąć wstęgi. Przechowuj siatki w pudełkach na siatki w suchym transporterze chłodzonym ciekłym azotem do momentu przygotowania mikroskopu.Komórki bakteryjne na siatce można obrazować za pomocą kriomikroskopu świetlnego. W tym przypadku zostanie użyty zmodyfikowany odwrócony mikroskop Nikon, TIB z zmodyfikowaną kriostrefą FEI. Załaduj siatki do kaset w stacji kriogenicznej i zabezpiecz je miedzianymi pierścieniami zaciskowymi, a następnie umieść kasetę w probówce z ciekłym azotem w celu transportu.Załaduj do dwóch wkładów do wstępnie schłodzonej komory kriogenicznej i przesuń siatkę do okna obserwacyjnego. Następnie obniż soczewkę kondensora i ustaw ostrość soczewki obiektywu na siatce. Znajdź komórki i wykonaj zdjęcia.Do skorelowanych badań LM i EM. Siatkę skanuje się w okolicy komórek, aby umożliwić ich późniejszą lokalizację w EM. Po obrazowaniu siatki należy włożyć kasetę z powrotem do probówki i przechowywać probówkę w ciekłym azocie do momentu obrazowania w EM w celu uzyskania 3D TOM komórki bakteryjnej.Seria obrazów projekcyjnych jest pobierana podczas stopniowego pochylania próbki wzdłuż jednej lub dwóch osi w cryo TEM; procedura ta jest zaprezentowana z wykorzystaniem legon z cryo T-E-M-F-E-I-T-F 30 polar; załaduj do sześciu wkładów do uchwytu wielowybieralnego na stacji cryo. Następnie podłącz go do TF 30 Polar, wybierz jeden wkład i włóż go do kolumny EM. Uruchom legend w oprogramowaniu klienckim na komputerze EM.Wprowadź warunki obrazowania dla legendy sesji. Wybierz cele na obrazach, zaczynając od najniższego powiększenia, i prześlij je do kolejnego etapu z wyższym powiększeniem. Następnie wprowadź wszystkie cele do kolejki w celu zebrania serii pochyleń i prześlij je wszystkie do końcowego etapu tomografii.Należy zebrać serię obrazów. Próbka będzie stopniowo pochylana wzdłuż jednej lub dwóch osi w kriomikroskopie elektronowym (cryo TEM). Po zakończeniu eksperymentu należy pobrać kompletną serię pochyleń na lokalną stację roboczą w celu przeprowadzenia rekonstrukcji.Tomogramy komórek bakteryjnych są obliczane przy użyciu specjalistycznego oprogramowania. Program Raptor służy do automatycznej rekonstrukcji tomogramów, natomiast e tomo może być wykorzystany do przeprowadzania tego procesu w sposób półautomatyczny. Należy sprawdzić serie pochyleń za pomocą przeglądarki 3D mod w programie Im MOD i odrzucić te, które ze względu na błędy śledzenia lub inne problemy są mało prawdopodobne do uzyskania.Program Raptor do tomografii jest uruchamiany w trybie rozproszonym na maszynach z systemem Linux w laboratorium przy użyciu ustawień podstawowych. Generowanie tomogramu trwa od 20 minut do dwóch godzin, w zależności od rozmiaru pliku. W przypadku niepowodzenia programu Raptor lub gdy badacz chce upewnić się, że rekonstrukcja jest optymalna, można użyć EMO do dokładnego, ręcznego wyrównania obrazów.Postępuj zgodnie z krokami w każdej zakładce interfejsu graficznego e tomo, aby zrekonstruować tomogram z serii zdjęć pod różnymi kątami nachylenia. Do organizacji, przechowywania, wyszukiwania i dystrybucji danych tomograficznych wykorzystujemy wewnętrzną bazę danych dostępną przez przeglądarkę internetową. Główna strona przeglądania prezentuje obraz miniatur oraz wyróżniony film w stylu YouTube.Dla każdego tomogramu, po uzyskaniu tomogramów, można przeprowadzić segmentację poszczególnych obiektów, aby pomóc w wizualizacji ich kształtów. Segmentacja 3D jest procesem przypisywania każdego woksela obrazu 3D do konkretnego obszaru lub materiału.W tym celu wykorzystuje się oprogramowanie do lustrzanego odbicia w celu wygenerowania modelu powierzchni, w którym każdy obszar jest przedstawiony za pomocą innego koloru i oglądany w filmach oraz animacjach 3D tomogramu. Można tworzyć zestawienia podsumowujące projekty oraz ilustrujące wyniki w formie grafiki 3D. Do renderowania poszczególnych klatek filmu i materiałów komercyjnych można użyć oprogramowania takiego jak Amira lub Kymera.Do edycji materiałów wideo reklamowych można wykorzystać oprogramowanie do montażu filmowego, takie jak Adobe Premier. Do generowania animacji używa się programu Maya. Może on pobrać powierzchnie z programu Amira, utworzyć klatki kluczowe i wyrenderować je do postaci filmu.Tutaj przedstawiono reprezentatywną serię przechyłów danych z całej komórki Spiro Treponema Promesa, a następnie widok warstwa po warstwie zrekonstruowanego tomogramu. Segmentacja komórki T Promesa pozwala wyróżnić jej błonę zewnętrzną, błonę wewnętrzną oraz struktury powierzchniowe, w tym wgłębienia powierzchniowe i łukowe haczyki powierzchniowe. Bakteria posiada wici i silniki polarne, stożek periplazmatyczny oraz pilli.Ten model mechaniczny pokazuje, w jaki sposób pływa krętek treponema Promesa; wewnętrzny cylinder lub rdzeń jest otoczony zewnętrzną osłoną. Flagella poruszają się niczym wałki malarskie pomiędzy wewnętrznym cylindrem a zewnętrzną osłoną. Podczas obrotu flagell, wewnętrzny cylinder obraca się w przeciwnym kierunku wewnątrz zewnętrznej osłony.W środowisku o niskiej lepkości komórka obraca się bezskutecznie, jednak w środowiskach lepkich, takich jak te, w których T Promesa występuje w naturze, włókna zewnętrzne lub inne obiekty stawiają opór rotacji zewnętrznej osłony, co przyspiesza obrót wewnętrznego cylindra i dostarcza materiałów, od których komórka może się odepchnąć, wiercąc się do przodu. Przedstawiono tutaj rzeczywiste komórki T promeus obserwowane pod mikroskopem świetlnym. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić kriotomografię elektronową komórek bakteryjnych.Oczywiście zdajemy sobie sprawę, że tego rodzaju prace wymagają znacznych inwestycji. Mikroskopy krioelektronowe i mikroskopy fluorescencyjne są zaawansowane i kosztowne, a dodatkowo muszą być odpowiednio umieszczone. Przykładowo, fundamentem tego pomieszczenia jest mechanicznie izolowana płyta betonowa o grubości kilku stóp, spoczywająca na specjalnie zagęszczonym gruncie.System klimatyzacji został również zaprojektowany na zamówienie, z dużymi kanałami i łagodnymi łukami, aby utrzymać stałą temperaturę bez przeciągów i turbulencji. Widoczne zasłony zostały rozmieszczone w celu redukcji szumów akustycznych. Na koniec weryfikujemy, czy w pomieszczeniu nie występują zakłócające pola elektromagnetyczne.Choć operacje na mikroskopie, które zaprezentowaliśmy, są obecnie w dużej mierze zautomatyzowane, wciąż często pojawiają się problemy wymagające eksperckiej diagnozy. Mamy jednak nadzieję, że obejrzenie tego filmu pomogło Państwu zrozumieć procedury oraz instrumentację wykorzystywaną w tego typu pracach. Dziękujemy za uwagę.

electron-cryotomography-of-bacterial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tomografia Kriogeniczna Elektronowa Komórek Bakteryjnych

Źródło: Chetrit, D., et al. Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020)Film opisuje, jak przygotować próbki Legionella pneumophila do kriotomografii elektronowej poprzez połączenie hodowli bakterii, znakowania nanocząstek złota i technik witryfikacji. Proces ten zachowuje natywne struktury komórkowe i umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości...

Przygotowanie bakterii Legionella pneumophila do kriogenicznej tomografii elektronowej

Aby zachować procesy neuronalne do analizy ultrastrukturalnej, opisujemy protokół posiewu pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, po którym następuje błyskawiczne zamrażanie, co daje próbki zawieszone w warstwie lodu szklistego. Próbki te można badać za pomocą mikroskopu krioelektronowego w celu wizualizacji struktur w skali nanometrowej.

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj kriotomografię elektronową do wizualizacji ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanie zbliżonym do natywnego. Naucz się technik zamrażania próbek i rekonstrukcji 3D.

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Przeglądaj więcej filmów