Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

W tym filmie obrazy 3D komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do natywnych w rozdzielczości molekularnej są generowane za pomocą kriotomografii elektronowej. Osiąga się to poprzez pierwsze zamrożenie wgłębne nienaruszonych komórek lub alternatywnie zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i kriosekcję granulek komórek. Seria obrazów projekcyjnych M jest pozyskiwana i wykorzystywana do generowania rekonstrukcji 3D lub Toma Grahama, która jest segmentowana i dalej analizowana obliczeniowo.

Cześć, nazywam się Grant Jensen z Wydziału Biologii w Caltech, a to jest Sonya Chen, która zorganizowała naszą prezentację. Dzisiaj pokażemy, jak wykonać kriotomografię elektronową komórek bakteryjnych. Zazwyczaj jedna osoba wykonuje całą procedurę, ale ponieważ nasze protokoły zostały opracowane na podstawie wspólnych doświadczeń, uwzględnimy wszystkich, którzy obecnie pracują w laboratorium.

Oprócz Sonyi i mnie w teledysku zobaczycie Megan Dobro, Arianę, Bri, Miguela, Alistaira McDowella, Marka Rodinsky'ego i Jen. Wraz z innymi członkami laboratorium wykonała zrzuty ekranu komputera i pomogła przygotować towarzyszący im pisemny protokół, w tym Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova i Dylan Morris. Ariana rozpocznie nas od pokazania, jak zanurzamy zamrażanie komórek bakteryjnych.

W przypadku cienkich komórek bakteryjnych zawiesina nienaruszonych komórek jest zamrażana w poprzek siatki EM. Tutaj proces jest demonstrowany przy użyciu komercyjnej automatycznej zamrażarki wgłębnej, zacznij od zbadania kultur bakterii, aby upewnić się, że są wolne od zanieczyszczeń, a przy odpowiednim zbiegu lub stężeniu rozładowuj jarzeniowo pokrytą węglem siatkę EM przez dwie do czterech minut. Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów roztworu złota koloidalnego z 25 mikrolitrami 5% roztworu BSA.

Odwirować mieszaninę w stężeniu 18 000 G przez 15 minut. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić złotą granulkę. W 20 mikrolitrach roztworu komórkowego umieść siatkę EM w bocie Vitra o wilgotności 100%.

Następnie nałóż cztery mikrolitry mieszaniny komórek na rozładowaną jarzeniową siatkę EM. Siatka jest automatycznie osuszana z obu stron bibułą filtracyjną w celu usunięcia nadmiaru cieczy, a następnie szybko zanurzana w ciekłej mieszaninie etanu i propanu, która jest chłodzona ciekłym azotem. Ostrożnie wyjmij siatkę z mieszaniny etanu i propanu i szybko przenieś ją do schowka siatkowego umieszczonego pod ciekłym azotem W przypadku grubszych ogniw zamrażanie pod wysokim ciśnieniem zapobiega krystalizacji lodu.

Późniejsza kriosekcja sprawia, że próbki są wystarczająco cienkie, aby mogły się pojawić. Obrazowanie rozpoczyna się od odwirowania 15 mililitrów komórek przy 1000 obr./min przez trzy minuty. Po odwirowaniu usunąć sklarowany sklarant wymieszać 0,5 mililitra pozostałego osadu hodowlanego z 0,5 mililitra 20% krioprotektantu dekstrynowego.

Następnie ponownie odwirować z prędkością 13 000 obr./min przez 15 sekund. Po granulowaniu komórek wyjmij pipetę supernatantu 0,1 mililitra pasty super granulek do zgrzewanej na gorąco końcówki mikropipety, która zawiera już 0,2 mililitra wirówki krioprotekcyjnej 20% dekstryny. Mieszanina w końcówce mikropipety pod ciśnieniem 13 000 KM przez 30 sekund.

Po wirowaniu usunąć supernatant. Na uszczelnionej końcówce widać szczelny granulek o pojemności od pięciu do 10 mikrolitrów. Przenieś pastę na jedną połówkę kopuły mosiężnej kopuły pokrytej teflonem, która jest już zamontowana w ramieniu uchwytu zamrażarki wysokociśnieniowej, a następnie uszczelnij ją płaską mosiężną nasadką.

Następnie niezwłocznie włóż zespół ramienia do zagruntowanej zamrażarki wysokociśnieniowej. Przy ciśnieniu 2100 barów połączona mosiężna jednostka planche zawierająca ogniwa jest szybko chłodzona strumieniem ciekłego azotu pod wysokim ciśnieniem. Po schłodzeniu komórek szybko wyjmij zespół ramienia i szybko zanurz go w kąpieli z ciekłym azotem, aby zapobiec nagrzewaniu się planszety.

Następnie przenieś planszetę do wstępnie schłodzonego uchwytu przypominającego imadło kriomikrotomu, bezpiecznie zamontowanego w komorze mikrotomu kriogenicznego, aby odsłonić dobrze zamrożoną kopułę komórek do cięcia. Dwie mosiężne deski są ostrożnie oddzielone pod ciekłym azotem. Idealnie zamrożona kopuła komórek będzie miała szklisty wygląd i będzie wolna od pęknięć i szczelin zarodkowych lodu.

Za pomocą mikrotomu kriogenicznego ukształtuj zewnętrzny obszar kopuły do mniej niż 0,2 milimetra kwadratowego za pomocą diamentowego narzędzia do przycinania z dużą prędkością cięcia i głębokością około 200 mikrometrów z antystatycznym natryskiem skierowanym na nóż o niskim kącie i miedziane siatki nośne. W bliskiej odległości ostrożnie przesuń nóż diamentowy do polerowanej powierzchni bloku, używając prędkości cięcia około 0,4 milimetra na sekundę i wąskiego okna cięcia. Rozpocznij krojenie plastrów o grubości od 50 do 350 nanometrów.

Manewruj cienkim aplikatorem do rzęs, aby zaczepić wczesne sekcje, zsuwając się z krawędzi noża diamentowego o niskim kącie oraz podeprzeć i poprowadzić wstążki sekcji po podporze siatki miedzianej. Po załadowaniu siatki użyj schłodzonej, polerowanej srebrnej sondy, aby mocno docisnąć taśmy. Przechowuj siatki w skrzynkach siatkowych w suchym transporterze chłodzonym ciekłym azotem, aż mikroskop będzie gotowy.

Komórki bakteryjne na siatce można obrazować za pomocą mikroskopu krioświetlnego. W tym przypadku zostanie użyty niestandardowy mikroskop odwrócony firmy Nikon, TIB ze zmodyfikowanym stolikiem kriogenicznym FEI. Załaduj kratki do wkładów na stacji kriogenicznej i przypnij je za pomocą miedzianych pierścieni zaciskowych, a następnie umieść wkład w probówce w ciekłym azocie w celu przeniesienia.

Załaduj do dwóch wkładów do wstępnie schładzonego stopnia kriogenicznego i przenieś siatkę do viewokienko. Następnie opuść soczewkę kondensatora i skup soczewkę obiektywu na siatce. Znajdź komórki i zrób zdjęcia.

Do skorelowanych badań LM i EM. Siatka jest skanowana wokół obszaru komórek w celu zlokalizowania komórek w późniejszym czasie. Po zobrazowaniu siatki włóż wkład z powrotem do probówki i trzymaj probówkę w ciekłym azocie, aż będzie gotowa do obrazowania w EM w celu uzyskania TOM 3D komórki bakteryjnej.

Seria obrazów projekcyjnych jest wykonywana, gdy próbka jest stopniowo przechylana wzdłuż jednego lub dwóch E w krioterapii TEM tutaj, procedura jest demonstrowana przy użyciu legon z kriogenicznym obciążeniem T-E-M-F-E-I-T-F 30 biegunowym do sześciu wkładów do uchwytu wielokrotnego wyboru na stacji kriogenicznej. Następnie podłącz go do jednego wkładu TF 30 Polar Select i włóż go do kolumny EM. Uruchom legendę w oprogramowaniu klienckim na komputerze EM.

Wprowadź warunki obrazu dla legendy podczas sesji. Wybierz cele na obrazach, zaczynając od najmniejszego powiększenia i wyślij je do następnego kroku z większym powiększeniem. Następnie ustaw w kolejce wszystkie cele do pobrania serii wychylenia i prześlij je wszystkie do ostatniego etapu tomografii.

Zdobądź serię obrazów. Próbka będzie stopniowo przechylana wzdłuż jednej lub dwóch osi w kriogenicznym TEM. Po zakończeniu eksperymentu pobierz ukończoną serię przechyłu na lokalną stację roboczą w celu rekonstrukcji.

Tomo Grahams komórek bakteryjnych są obliczane za pomocą specjalistycznego oprogramowania. Program Raptor służy do automatycznej rekonstrukcji Tomów, a e tomo może być używany do robienia tego półautomatycznie. Sprawdź serię przechyłu za pomocą przeglądarki modów 3D Im MOD i odrzuć wszystko, co z powodu śledzenia lub innych błędów prawdopodobnie nie powstanie.

Dobry tommo raptor jest uruchamiany dystrybuowany na maszynach z systemem Linux w laboratorium przy użyciu podstawowych ustawień. Wygenerowanie tomografu zajmuje od 20 minut do dwóch godzin, w zależności od rozmiaru pliku. Gdy Raptor zawiedzie lub badacz chce upewnić się, że rekonstrukcja jest optymalna, EMO może być użyte do starannego ręcznego wyrównania obrazów.

Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w każdej zakładce w graficznym interfejsie użytkownika e tomo, aby zrekonstruować Toma Grahama z serii Tilt. Korzystamy z internetowej wewnętrznej bazy danych do organizowania wyszukiwania sklepów i dystrybucji danych tomograficznych. Główna strona przeglądania przedstawia miniaturę obrazu i polecany film podobny do YouTube.

Dla każdego tomo Grahama. Po uzyskaniu Tommo, Grahams, poszczególne cechy można podzielić na segmenty, aby pomóc w wizualizacji ich kształtów. W segmentacji 3D to proces przypisywania każdej wartości obrazu 3D do określonego regionu lub materiału.

W tym przypadku oprogramowanie lustrzane służy do generowania modelu powierzchni, w którym każdy obszar jest pokazany w innym kolorze i oglądany w filmach 3D i animacjach tomo. Grahams może być wykorzystany do podsumowywania projektów i ilustrowania wyników w grafice 3D. Reprezentacja. Oprogramowanie, takie jak Amira lub Kymera, może być używane do renderowania poszczególnych nieruchomych klatek filmu i reklamy.

Oprogramowanie do edycji filmów, takie jak Adobe Premier, może być używane do edycji komercyjnego oprogramowania filmowego. Do generowania animacji używany jest program Maya. Może pobierać powierzchnie z Amiry, konstruować klatki kluczowe i renderować je w filmie.

Tutaj pokazano reprezentatywną serię danych o nachyleniu całych komórek dla Spiro Treponema Promesa, po której następuje widok zrekonstruowanego Toma Agrama wycinek po wycinku. Segmentacja komórki T Promesa wyróżnia jej błonę zewnętrzną, błonę wewnętrzną i struktury powierzchniowe, w tym misy powierzchniowe i arkadę haka powierzchniowego. Bakterie to wici i silnik ularny, stożek plazmatyczny okołobiegunowy i pillai.

Ten model mechaniczny pokazuje, jak krętek krętka Promesa pływa, a wewnętrzny cylinder lub rdzeń jest otoczony zewnętrzną osłoną. Wici poruszają się jak wałki malarskie między wewnętrznym cylindrem a zewnętrzną osłoną. Gdy wici się obracają, wewnętrzny licznik cylindra obraca się w zewnętrznej osłonie.

W nielepkim środowisku komórka obraca się bezużytecznie, ale w lepkich środowiskach, takich jak te, w których T Promesa występuje w naturze, zewnętrzne włókna lub inne obiekty opierają się obracaniu zewnętrznej osłony, przyspieszając obrót wewnętrznego cylindra i dostarczając materiałów, na które komórka może naciskać, gdy wierci się do przodu. Pokazane tutaj są rzeczywiste limfocyty T promeus obserwowane przez mikroskop świetlny. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać kriotomografię elektronową komórek bakteryjnych.

Oczywiście zdajemy sobie sprawę, że tego typu prace wymagają dużych inwestycji. Mikroskopy krioelektronowe i fluorescencyjne są wyrafinowane i drogie, a także muszą być odpowiednio cytowane. Na przykład fundamentem tego pomieszczenia jest mechanicznie izolowana płyta o grubości kilku stóp, spoczywająca na specjalnie ubitym gruncie.

System klimatyzacji jest również specjalnie zaprojektowany z dużymi kanałami i łagodnymi krzywiznami, aby utrzymać stałą temperaturę bez przeciągów i turbulencji. Zasłony, które widzisz, są umieszczone w celu zmniejszenia hałasu akustycznego. I na koniec sprawdzamy, czy to pomieszczenie jest wolne od zakłócających pól elektromagnetycznych.

Chociaż operacje, które pokazaliśmy Ci pod mikroskopem, są teraz w dużej mierze zautomatyzowane, problemy nadal często się pojawiają i wymagają specjalistycznej diagnozy. Niemniej jednak mamy nadzieję, że obejrzenie tego filmu pomogło Ci docenić procedury i oprzyrządowanie związane z tego typu pracą. Dziękuję państwu za uwagę.