Powstawanie i rozmnażanie ludzkich guzów siatkówczaka u myszy z niedoborem odporności

Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie ortotopowego guza siatkówki u myszy z niedoborem odporności, zapewniając wygodny model do dalszych eksperymentów i umożliwiając namnażanie guza. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie komórek z guza pierwotnego lub ksenoprzeszczepu i hodowlę sfer nowotworowych in vitro. Drugim etapem procedury jest wstrzyknięcie wyhodowanych komórek nowotworowych do jamy ciała szklistego lub przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy z niedoborem odporności szmatowej o wartości zerowej.

Trzecim etapem procedury jest monitorowanie wstrzykniętych myszy pod kątem oznak powstawania guza, w tym powiększenia Leukocoria GLO i wzdęcia okołogałkowego. Ostatnim etapem zabiegu jest pobranie guza ksenoprzeszczepu. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują tworzenie się guza ortotopowego w oku myszy poprzez badanie histopatologiczne.

Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie ze względu na delikatny charakter wstrzyknięcia do gałki ocznej. Otaczające konstrukcje mogą zostać łatwo uszkodzone, jeśli nie zostaną odpowiednio zidentyfikowane. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie mają trudności, ponieważ umieszczenie wstrzyknięcia w jamie ciała szklistego wymaga precyzji, aby dostarczyć komórki nowotworowe we właściwe miejsce.

Teraz ta metoda może zapewnić wgląd w biologię guzów siatkówczaka. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak międzygałkowe podawanie wektorów do transferu genów. Najpierw przygotuj świeżo zdefiniowaną pożywkę z komórek macierzystych w sterylnym naczyniu poddanym działaniu kultury tkankowej o średnicy 10 centymetrów.

Umieść tkankę nowotworową siatkówczaka i odessaj nadmiar pożywki transportowej, pozostawiając tyle, aby zapobiec wysuszeniu, mechanicznie zdezagreguj tkankę skalpelem za pomocą techniki cięcia poprzecznego, natychmiast dodaj 100 mikrolitrów zdefiniowanej pożywki z komórek macierzystych do tkanki i delikatnie rozprowadź tkankę mieloną za pomocą skalpela. Następnie dodaj do naczynia 10 mililitrów zdefiniowanej pożywki z komórek macierzystych. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w nawilżonym inkubatorze i codziennie sprawdzaj pod kątem zmętnienia i zmian pH.

Niektóre kule nowotworowe powinny powstać z uszkodzonej tkanki nowotworowej niemal natychmiast, ze wzrostem liczby w ciągu siedmiu do 10 dni, gdy obserwuje się wystarczający nowy wzrost. A następnie co tydzień wirować kule guza pod ciśnieniem 300 razy G przez pięć minut. Resus, zawiesić je w świeżo przygotowanym zdefiniowanym pożywce z komórkami macierzystymi i pipetować w górę i w dół 10 razy, aby zakłócić większe centralnie martwicze sfery i umożliwić uformowanie nowych, zdrowych kulek.

Aby przygotować hodowane kulki nowotworowe do wstrzyknięcia, delikatnie przenieś kulki do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Delikatnie pipetuj w górę i w dół od 10 do 15 razy, aby rozerwać kulki. Policz komórki do wstrzyknięcia za pomocą hemocytometru przy użyciu błękitu trianowego, aby wykluczyć komórki niezdolne do życia.

Przygotuj się na tyle wstrzyknięć, ile potrzeba, w zależności od liczby dostępnych komórek i wymagań eksperymentalnych. Następnie odwiruj probówki o sile 300 razy G przez pięć minut. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach.

PBS powtórzyć etapy wirowania i aspiracji jeszcze raz. Na koniec należy ponownie zawiesić komórki w 10 mikrolitrach sterylnego PBS na wstrzyknięcie. Aby przygotować zwierzęta do zabiegu, zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy na podgrzewanej podkładce.

Aby utrzymać temperaturę ciała, podaj jedną kroplę propanu HCL do prawego oka i odczekaj minutę. Następnie podaj jedną kroplę fenylefryny HCL do prawego oka i odczekaj pięć minut. Jeśli rozszerzenie źrenicy nie nastąpiło, podaj kolejną kroplę i odczekaj kolejne pięć minut.

Umieść znieczulone zwierzę na boku pod mikroskopem, oprzyj głowę na gazie. Skieruj się prawą stroną do góry i wyśrodkuj oko, aby uzyskać czerwony refleks prawego oka. Dno oka, gdy jest obserwowane przez mikroskop, podeprzyj prawą gałkę ziemską, delikatnie naciskając jednocześnie dwoma palcami na powieki.

Utrzymuj tę pozycję stabilnie przez pozostałą część procedury. Za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 30 przymocowanej do strzykawki z blokadą przynęty. Przebij kulę ziemską bocznie przez spojówkę i twardówkę przylegające do rąbka rogówki w okolicy pars plana i tylko przez naczyniówkę do jamy ciała szklistego.

Wyjąć igłę z otworu. Wysterylizuj igłę Hamiltona wacikiem nasączonym alkoholem. Wciągnąć zawiesinę komórek do strzykawki Hamiltona i włożyć igłę do otworu, aż igła zostanie uwidoczniona przez mikroskop za soczewką w ciele szklistym, w pobliżu siatkówki.

Z pomocą drugiej osoby przytrzymać igłę stabilnie w tej pozycji, jednocześnie wciskając tłok, powoli wyjmować igłę. W razie potrzeby użyj bawełnianego wacika, aby wchłonąć krew lub płyn z otworu. Delikatnie zwolnij nacisk, aby zamknąć powieki myszy.

Umieść zwierzę z powrotem w podgrzewanej podkładce w celu odzyskania zdrowia. Codziennie po wstrzyknięciu należy badać oko pod kątem leukocorii. To zwykle staje się widoczne dwa do czterech tygodni po wstrzyknięciu.

Po wykryciu wzrostu guza należy poddać zwierzę eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Pod mikroskopem stereoskopowym wykonaj nacięcie obwodowe na rąbku, usuwając rogówkę i soczewkę, a następnie ostrożnie wypreparuj większość masy guza z innych tkanek za pomocą pęsety. Umieść guz w sterylnym RPMI 1640.

Media używają pęsety, aby powoli wyciągnąć otwartą kulę z gniazda, aż nerw wzrokowy zostanie odsłonięty. Delikatnie wyjmując kulę ziemską z gniazda. Użyj nożyczek, aby przeciąć nerw wzrokowy, pozostawiając jak najwięcej nerwu przyczepionego do gałki ocznej, aby ocenić inwazję nerwu wzrokowego przez guz w 10% neutralnej buforowanej formalinie do histologii widoczne.

Oto przykład hodowanych kul nowotworowych. Po trzech dniach wśród zdezagregowanej tkanki nowotworowej widocznych jest tylko kilka kulek nowotworowych. Jednak po 10 dniach liczba kul nowotworowych wzrosła.

Kulki mają wyraźną błonę zewnętrzną, jak pokazano we wkładce w prawym górnym rogu, kilka tygodni po wstrzyknięciu. Mysz, której wstrzyknięto implant, wykazuje leukocorię, biały odruch źrenicy jest spowodowany guzem zlokalizowanym w tylnej części oka. W tych przykładach wycinków oka barwionych h i d zwróć uwagę na guza siatkówczaka ksenoprzeszczepu wypełniającego jamę ciała szklistego po lewej stronie i brak takiego wzrostu w imitacji wstrzykniętego oka po prawej stronie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować hodowane komórki nowotworowe, prawidłowo wykonać wstrzyknięcie wewnątrzgałkowe w oko myszy i jak szukać progresji guza Po opanowaniu technikę wstrzykiwania można wykonać w około 30 minut na zwierzę. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, nie zapominaj, że komórki nowotworowe mogą być niebezpieczne, a środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej, w tym fartucha laboratoryjnego i masek, powinny być zawsze przyjmowane podczas wykonywania tej procedury. Ludzkie komórki rakowe powinny być zawsze manipulowane w dwóch warunkach.