Name: Wykorzystanie humanizowanej myszy BLT jako modelu guza terapii genowej opartej na komórkach macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Poznaj generowanie myszy z inżynieryjnym ludzkim układem odpornościowym poprzez przeszczep tkanki grasicy i komórek macierzystych CD34. Ta metoda umożliwia badanie odpowiedzi przeciwnowotworowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Alvinowi Welchowi i Larry'emu Pangowi za pomoc techniczną. Praca ta była finansowana częściowo z grantu National Institutes of Health (NIH) P50 CA086306, grantów California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) RC1-00149-1 i RS1-00203-1; CIRM New Faculty Award RN2-00902-1, Caltech-UCLA Joint Center for Translational Medicine, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH/NIAID AI028697, UCLA AIDS Institute, CIRM Tools and Technology Award RT1-01126 oraz UC Multicampus Research Program and Initiatives z California Center for Antiviral Drug Discovery (numer MRPI-143226).

<ol><li>McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCID-hu+mouse%3A+murine+model+for+the+analysis+of+human+hematolymphoid+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function.</a> Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).</li>
<li>Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+maintenance+of+SCID-hu+mice+for+HIV+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research.</a> Methods. 12 (4), 343-347 (1997).</li>
<li>Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+a+functional+human+immune+system+to+mice+with+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency.</a> Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).</li>
<li>Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li>
<li>Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+pre-exposure+prophylaxis+prevents+vaginal+transmission+of+HIV-1+in+humanized+BLT+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice.</a> PLoS Med. 5 (1), e16(2008).</li>
<li>Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarectal+transmission%2C+systemic+infection%2C+and+CD4%2B+T+cell+depletion+in+humanized+mice+infected+with+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1.</a> J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).</li>
<li>Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+short+hairpin+RNA+potently+down-regulates+CCR5+expression+in+systemic+lymphoid+organs+in+the+hu-BLT+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model.</a> Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).</li>
<li>V, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+HIV+Latency+in+Humanized+BLT+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice.</a> J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).</li>
<li>Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+from+antigen-specific+CD8+T+cells+generated+in+vivo+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Zmodyfikowany humanizowany model myszy BLT w połączeniu z obrazowaniem PET in vivo stanowi potężne narzędzie do badania przewlekłych ludzkich chorób. System ten bazuje na modelu mysim BLT i rozszerza jego zastosowanie poza ograniczony zakres badań nad HIV. Ponadto jest to doskonały układ do badania różnych protokołów terapii genowej, jak również technik diagnostycznych, zanim zostaną one wprowadzone do praktyki klinicznej. To ostatnie, w połączeniu z niskimi kosztami hodowli myszy w porównaniu z naczelnymi, czyn...

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Iscove's</td><td></td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td></td><td>16000085</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td></td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAza I</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Piptazo (Zosyn)</td><td>Pfizer</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://labeling.pfizer.com/showlabeling.aspx?id=416&quot; target=&quot;_blank"> Kombinacja piperacyliny i tazobaktamu &lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ficoll (Ficoll-Paque Plus)</td><td>Ge Healthcare Life Sciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Bufor MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Patrz uwagi</td><td>Bufor MACS: PBS uzupełniony o 0.5% płodowej surowicy bydlęcej i 2 mM cytrynianowo-dekstrozową formułę A </td></tr><tr><td>Zestaw mikrokulek CD34</td><td></td><td>130-046-702</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny LS</td><td></td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354263</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Baxter</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html&quot; target=&quot;_blank">http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Karprofen (Rimadyl)</td><td>Pfizer Animal Health</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://www.rimadyl.com/default.aspx&quot; target=&quot;_blank">https://www.rimadyl.com/default.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie humanizowanych myszy blt jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Modele małych zwierząt, takie jak myszy, są szeroko wykorzystywane do badania chorób ludzkich oraz opracowywania nowych interwencji terapeutycznych. Pomimo bogactwa informacji uzyskanych z tych badań, specyficzne cechy odporności myszy, a także specyficzność gatunkowa chorób wirusowych, takich jak zakażenie wirusem niedoboru odporności u ludzi (HIV), doprowadziły do opracowania zhumanizowanych modeli mysich. Wcześniejsze modele opierały się na wykorzystaniu myszy C. B 17 scid/scid i transplantacji ludzkiego płodowego grasicy oraz płodowej wątroby, co określano mianem thy/liv (SCID-hu) 1, 2, lub na adoptywnym transferze leukocytów z ludzkiej krwi obwodowej (SCID-huPBL) 3. Oba modele były wykorzystywane głównie do badania zakażeń HIV.
Jednym z głównych ograniczeń obu tych modeli był brak stabilnej rekonstytucji ludzkich komórek odpornościowych w obwodzie, co utrudniało uczynienie z nich fizjologicznie istotniejszych modeli do badania choroby HIV. W tym celu opracowano humanizowany model myszy BLT. Skrót BLT oznacza szpik kostny/wątrobę/grasicę (bone marrow/liver/thymus). W tym modelu myszy z niedoborem odporności rasy NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) w wieku od 6 do 8 tygodni otrzymują implanty grasicy i wątroby, podobnie jak w modelu myszy SCID-hu, po czym następuje drugi przeszczep ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych 4. Zaletą tego systemu jest pełna rekonstytucja ludzkiego układu odpornościowego w obwodzie. Model ten był wykorzystywany do badania infekcji i latencji HIV 5-8.
Stworzyliśmy zmodyfikowaną wersję tego modelu, w której wykorzystaliśmy genetycznie zmodyfikowane ludzkie macierzyste komórki krwiotwórcze (hHSC) do skonstruowania implantu thy/liv, a następnie zastosowaliśmy wstrzyknięcie transdukowanych autologicznych hHSC 7, 9. Podejście to prowadzi do wygenerowania genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych. Co ważniejsze, dostosowaliśmy ten system do zbadania potencjału generowania funkcjonalnych limfocytów T cytotoksycznych (CTL) wykazujących ekspresję receptora limfocytów T specyficznego dla czerniaka. Wykorzystując ten model, byliśmy w stanie ocenić funkcjonalność naszych transgenicznych CTL, stosując obrazowanie pozytonową tomografią emisyjną (PET) in vivo w celu określenia regresji guza (9).
Celem niniejszego protokołu jest opisanie procesu generowania tych myszy transgenicznych oraz ocena skuteczności in vivo z wykorzystaniem obrazowania PET na żywo. Należy zauważyć, że ze względu na wykorzystanie ludzkich tkanek oraz wektorów lentiwirusowych, nasze zaplecze spełnia wytyczne CDC NIH dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) ze specjalnymi środkami ostrożności (BSL2+). Ponadto myszy NSG są w ciężkim stanie immunokompromitacji, w związku z czym ich kwaterowanie i utrzymanie muszą być zgodne z najwyższymi standardami sanitarnymi (<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>).

Schemat procesu transplantacji przedstawiono na Rysunku 1A. Zdjęcie implantu thy/liv przedstawiono na Rysunku 1B. Tkanka grasicy rozwija się prawidłowo i wykazuje fizjologiczny rozkład ludzkich limfocytów T CD4 i CD8. Po rekonstytucji zwierzęta posiadają ludzki układ odpornościowy z prawidłowym rozkładem limfocytów T CD4, CD8 oraz innych linii komórek odpornościowych.
Rozbieżność między wielkością guza a żywą tkanką przedstawiono na Rysunku 2....

W niniejszym opracowaniu opisano generowanie i charakterystykę limfocytów T specyficznych dla nowotworu z wykorzystaniem myszy humanizowanych. Tkanka grasicy człowieka oraz genetycznie zmodyfikowane ludzkie komórki macierzyste krwi są przeszczepiane myszom z niedoborem odporności. Prowadzi to do rekonstrukcji zmodyfikowanego ludzkiego układu odpornościowego, co umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej in vivo.

Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

Modele małych zwierząt, takie jak myszy, są szeroko wykorzystywane do badania ludzkich chorób oraz opracowywania nowych interwencji terapeutycznych. Pomimo bogactwa...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie myszy posiadających zmodyfikowany ludzki układ odpornościowy. Osiąga się to poprzez przygotowanie myszy do zabiegu chirurgicznego, a następnie wprowadzenie fragmentu grasicy do trokara w drugim kroku. Matrigel miesza się z transdukowanymi komórkami CD 34 negatywnymi i CD 34 pozytywnymi, a następnie otrzymaną mieszaninę dodaje się do trokara.Następnie konstrukty z matrigelu zostają przeszczepione pod torebkę nerki. Ostatecznie odrzucenie docelowych nowotworów przez genetycznie zmodyfikowane limfocyty T CD8 można monitorować za pomocą obrazowania PET na żywo oraz fizycznych pomiarów guza. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak modele całkowicie neuronowe, jest to, że metoda ta pozwala na badanie rozwoju genetycznie zmodyfikowanych ludzkich komórek macierzystych w ludzkim grasicy oraz późniejsze testowanie skuteczności in vivo pochodnych linii komórkowych; procedurę zaprezentuje trzech techników z naszych laboratoriów: Gregory Bristol, Bernard Levin i Sean Kim.Na tym schemacie przedstawiono zmodyfikowany model BLT wykorzystany w niniejszych badaniach do generowania myszy chimerycznych niosący

using-blt-humanized-mouse-as-stem-cell-based-gene-therapy-tumor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie myszy humanizowanej BLT jako modelu guza w terapii genowej opartej na komórkach macierzystych

Ten film demonstruje metodę generowania podwójnie humanizowanej myszy BLT (szpik, wątroba i grasica) z funkcjonalnym ludzkim układem odpornościowym i stabilnym, wszczepionym ludzkim mikrobiomem jelitowym.

Generowanie podwójnie humanizowanego modelu myszy BLT (szpik kostny, wątroba, grasica)

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Tutaj prezentujemy nowy humanizowany model wątroby myszy wygenerowany u myszy z nokautem komórkowym za pośrednictwem receptora alb-toksyny (TRECK)/SCID po przeszczepie niedojrzałych i zdolnych do rozbudowy ludzkich komórek macierzystych wątroby.

Generowanie humanizowanej wątroby myszy przy użyciu ludzkich komórek macierzystych wątroby

Komórki macierzyste są obiecującymi nośnikami terapeutycznymi w leczeniu guzów mózgu ze względu na ich wewnętrzny tropizm nowotworowy. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg i wykazuje duży potencjał w zakresie translacji klinicznej. W artykule podsumowano podstawowe zasady podawania donosowych komórek macierzystych w mysim modelu glejaka.

Donosowe podawanie terapeutycznych komórek macierzystych do glejaka w modelu mysim

Opisujemy nowatorską metodę generowania podwójnie humanizowanych myszy BLT, które posiadają funkcjonalny ludzki układ odpornościowy i stabilny, wszczepiony ludzki mikrobiom jelitowy. Protokół ten może być stosowany bez konieczności stosowania myszy wolnych od zarazków lub urządzeń gnotobiotycznych.

Podwójnie humanizowany model myszy BLT ze stabilnym mikrobiomem jelitowym podobnym do ludzkiego i ludzkim układem odpornościowym

Ten protokół opisuje generowanie myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS) do badań immunoonkologicznych. Przedstawiono instrukcje i rozważania dotyczące stosowania tego modelu do testowania ludzkich immunoterapeutyków na ludzkich nowotworach wszczepionych w tym modelu z naciskiem na scharakteryzowanie odpowiedzi ludzkiego układu odpornościowego na guz.

Testowanie immunoterapeutyków przeciwnowotworowych w humanizowanym modelu mysim z ludzkimi nowotworami

Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu napędzanego przez typowe mutacje pacjentów do testów przedklinicznych jest kluczowe dla testów immunoterapeutycznych. Protokół ten opisuje metodę generowania mysich modeli guza mózgu przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA, które reprezentują typowe mutacje pacjentów, zapewniając w ten sposób dokładny, powtarzalny i spójny model myszy.

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Poznaj generowanie myszy z inżynieryjnym ludzkim układem odpornościowym poprzez przeszczep tkanki grasicy i komórek macierzystych CD34. Ta metoda umożliwia badanie odpowiedzi przeciwnowotworowych in vivo.

Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

Przeglądaj więcej filmów