Wykorzystanie humanizowanej myszy BLT jako modelu guza terapii genowej opartej na komórkach macierzystych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyhodowanie myszy z zmodyfikowanym ludzkim układem odpornościowym. Osiąga się to, najpierw przygotowując mysz do operacji, a następnie ładując trokar kawałkiem grasicy w drugim kroku. Matrigel miesza się z transdukowanymi komórkami CD 34 ujemnymi i CD 34 dodatnimi, a następnie mieszaninę dodaje się do trokaru.

Następnie konstrukty matrigelu są przeszczepiane pod torebkę nerkową. Ostatecznie, odrzucenie docelowych guzów przez genetycznie zmodyfikowane limfocyty T CD eight może być monitorowane za pomocą obrazowania żywych zwierząt domowych i fizycznych pomiarów guza. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami metamfetaminy, takimi jak modele w pełni neuronowe, jest to, że metoda ta pozwala na badanie rozwoju genetycznie zmodyfikowanych ludzkich komórek macierzystych w ludzkiej grasicy, a następnie testowanie skuteczności in vivo pochodnych linii genetycznych, które zademonstrują procedurę, będą trzej technicy z naszych laboratoriów, Gregory Bristol, Bernard Levin, i Seana Kima.

Na tym schemacie ideowym przedstawiono zmodyfikowany model BLT zastosowany w tych badaniach do generowania chimerycznych myszy przenoszących mart, jedną specyficzną komórkę T. Implant ten jest rekonstruowany z transdukowanych i nietransdukowanych komórek CD 34 wyizolowanych z autologicznej wątroby płodu. Część transdukowanych komórek jest następnie zamrażana i wstrzykiwana napromieniowanym myszom cztery do sześciu tygodni później.

W tym filmie pokazano implantację żywego konstruktu, gdy zwierzęta stają się ospałe po znieczuleniu. Zacznij od ogolenia lewej strony każdej myszy od biodra do ramienia między środkiem pleców a brzuchem. Po zarejestrowaniu wagi każdego zwierzęcia, uderz je w uszy w celu ponumerowania i podskórnie wstrzyknij 0,3 mililitra karprofenu w każde z ramion.

Następnie połóż myszy na prawym boku zwrócone w lewo. Teraz przepłucz trokar igły do implantu raka o rozmiarze 16 z okrągłą końcówką pilnika za pomocą PBS. Za pomocą kleszczy igłowych dodaj kawałek grasicy do naczynia PBS, a następnie trzymaj trokar poziomo za pomocą pręta.

Tuż wewnątrz końcówki zassaj tkankę. Wsunięcie trokaru pod torebkę nerkową i wstrzyknięcie tkanki jest jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury. Następnie miej pomocnika.

Użyj pipety wyporowej eend orph, aby wymieszać pięć mikrolitrów zimnego matrigelu w jednej probówce z komórkami, delikatnie mieszając. Trzymanie trokara w pozycji poziomej. Powoli pociągnij pręt do tyłu, podczas gdy pomocnik pipetuje żel matri.

Wymieszaj z trokarem dla każdej myszy. Najpierw przetrzyj gołą skórę zwierzęcia Betadine, a następnie zetrzyj ją chusteczką izopropanolową. Dwa razy określ najciemniejsze miejsce pod skórą, wskazując lokalizację śledziony.

Nerka znajduje się około pięciu milimetrów grzbietowo do śledziony za pomocą kleszczy, aby podnieść skórę nad nerką. Wykonaj nacięcie o długości około 15 milimetrów w skórze równolegle do śledziony. Wykonaj podobne cięcie w warstwie mięśni otrzewnej poniżej.

U mężczyzn nerka powinna być bezpośrednio widoczna. Po prostu ściśnij brzuch, aby go wyskoczyć. Wywierając nacisk na brzuch lewą ręką, aby nerka była odsłonięta, u kobiet najpierw użyj hemostatu, aby podnieść jajnik, a następnie przeciągnij nerkę, aby pomóc utrzymać narząd na zewnątrz ciała.

Zerwij mały otwór w tylnym końcu torebki nerkowej, a następnie wsuń trokar do tego otworu i wzdłuż nerki, aż otwór trokaru zostanie całkowicie pokryty torebką nerkową. Następnie za pomocą małego palca prawej ręki wstrzyknij tkankę. Teraz użyj zamkniętego hemostatu, aby delikatnie wepchnąć nerkę z powrotem na miejsce.

Zawiąż jeden ścieg w otrzewnej podwójnym kokardą, ściskając skórę jak torebkę, a następnie włóż go do dwóch spinek na rany. Na koniec nałóż kroplę PBS na każde oko i połóż mysz na boku w klatce na wierzchu ściółki. Po wszczepieniu wszystkim myszom w ten sam sposób upewnij się, że zwierzęta wróciły do leżenia na brzuchu przed ich opuszczeniem.

Ten pierwszy rysunek przedstawia reprezentatywny obraz żywego implantu THI u humanizowanych myszy. Na tym rysunku wykazano prawidłowy rozwój tkanki grasicy i fizjologiczne rozmieszczenie tkanek ludzkiego CD 4 i CD 8 dodatniego T. Po rekonstytucji zwierzęta są nosicielami ludzkiego układu odpornościowego z normalnym rozkładem limfocytów T CD 4 i CD 8 dodatnich.

Tutaj pokazano reprezentatywny obraz myszy z guzem czerniaka. Szare obszary wskazują obraz tomografii komputerowej. Kolorowe obszary wskazują aktywność metaboliczną guza wykrytą przez skan PET.

Sama tomografia komputerowa w tym eksperymencie wykazała dużą masę guza w obszarze wskazanym przez białe kółko. Jednak, jak pokazuje obrazowanie PET in vivo, obszar ten składa się głównie z tkanki martwiczej i bliznowatej, co podkreśla użyteczność obrazowania PET jako bardziej czułego i dokładnego sposobu oceny regresji i usuwania guza. Po tej procedurze można przeprowadzić inne testy, takie jak limfocyty T, fenotypowanie i aktywacja ex vivo, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące funkcji komórek T.