Reakcja łańcuchowa polimerazy: podstawowy protokół oraz strategie rozwiązywania problemów i optymalizacji
May 22nd, 2012
PCR pojawił się jako powszechna technika w wielu laboratoriach biologii molekularnej. Poniżej znajduje się krótki przewodnik po kilku konwencjonalnych protokołach PCR. Ponieważ każda reakcja jest unikalnym eksperymentem, optymalne warunki wymagane do wytworzenia produktu są różne. Zrozumienie zmiennych w reakcji znacznie zwiększy skuteczność rozwiązywania problemów, zwiększając w ten sposób szansę na uzyskanie pożądanego rezultatu.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie etapów związanych z reakcją łańcuchową polimerazy lub PCR, która jest używana do wytworzenia wystarczającej ilości określonego segmentu DNA z niewielkiej ilości materiału wyjściowego. Najpierw zbierz odczynniki i materiały, które mają być użyte w reakcji PCR, a następnie ustaw mieszaninę reakcyjną, w tym cztery deoksy rybonukleotydy, matrycę DNA, startery i polimerazę DNA. Następnie zaprogramuj warunki cyklu termicznego i uruchom reakcję PCR.
Podążając za tym. Sprawdź wyniki, aby określić, czy reakcja zakończyła się sukcesem. Ostatecznie reakcja łańcuchowa polimerazy powinna dać określony amplikon o pożądanej wielkości produktu.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tym protokole będą miały trochę trudności z ustawieniem obliczeń każdego ze zmiennych odczynników, a czasami mają problemy z pipetowaniem, prawidłowymi objętościami, zwłaszcza z polimerazą, która zawiera glicerol. Rozpocznij eksperyment od świeżo napełnionego wiaderka na lód. Nosić rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia reakcji.
Mieszanina i odczynniki. Ułóż składniki PCR na lodzie, aby całkowicie się rozmroziły. Należą do nich startery matrycy DNA, polimeraza DNA 10 x bufor reakcyjny z chlorkiem magnezu lub bez, deoksynukleotydy, sterylna woda i chlorek magnezu.
Chlorek magnezu jest wymagany w przypadku stosowania buforu bez chlorku magnezu. Umieść 96-dołkową płytkę w wiaderku z lodem jako uchwyt na cienkościenne probówki do PCR o pojemności 0,2 mililitra. Teraz wyposaż stół warsztatowy w probówki i nakrętki do PCR.
Stojak na probówki do PCR, marker odporny na etanol i zestaw mikropipeterów. Zawsze twórz tabelę odczynników szczegółowo opisującą mieszaninę reakcyjną z kwantową sterylną wodą destylowaną, aby uzyskać końcową objętość 50 mikrolitrów. Na przykład przy użyciu pięciu mikrolitrów buforu bez magnezu, jednego mikrolitra 10 milimolowych DN NTP i zoptymalizowanego 4,0 milimolowego magnezu.
Jeden mikrolitr na każde 20 mikromolowych starterów, 0,5 mikrolitra dwóch nanogramów na mikrolitrową matrycę. A 0,5 mikrolitra polimerazy wymagałoby tylko 33 mikrolitrów sterylnej wody. Dodać chlorek magnezu, jeśli nie jest obecny w buforze 10 x lub jeśli jest to potrzebne do optymalizacji PCR.
Kontynuuj oznaczanie probówek PCR markerem odpornym na etanol do każdej probówki reakcyjnej. Najpierw dodaj obliczone ilości sterylnej wody, a następnie dodaj 10 x bufor i 10 milimolowych DN NTP. W tej reakcji przeprowadzamy miareczkowanie chlorkiem magnezu.
Ponieważ stężenie magnezu nie będzie stałe, chlorek magnezu dodaje się indywidualnie do probówek PCR, a objętość normalizuje się do 10 mikrolitrów sterylną wodą, tak że do każdej probówki PCR dodaje się 40 mikrolitrów końcowej mieszanki wzorcowej. Aby zakończyć reakcję o objętości 50 mikrolitrów i chlorku magnezu, kontynuuj dodawanie matrycy DNA i starterów. Na koniec dodaj od 0,5 do 2,5 jednostki polimerazy DNA na 50 mikrolitrów reakcji w 1,8 mililitrowej probówce z mikrofuge.
Przygotować roztwór mieszanki wzorcowej w ilości wystarczającej do uwzględnienia kontroli oraz strat związanych z przenoszeniem pipet. Ustawić mikropipeter na około połowę całkowitej objętości roztworu i delikatnie wymieszać przez pipetowanie. Dla każdej próbki testowej wymowny mistrz wymieszać z probówką PCR.
Teraz, aby uzyskać kontrolę ujemną bez matrycy DNA, dodaj wszystkie odczynniki i użyj sterylnej wody, aby skompensować brakującą objętość DNA. Następnie do kontroli pozytywnej należy użyć zestawu matrycowego DNA i starterów, które amplifikują znany fragment w tych samych warunkach, co eksperymentalne próbki PCR. Termocyklery PCR szybko podgrzewają i schładzają mieszaninę reakcyjną, umożliwiając indukowaną ciepłem denaturację dupleksu, klęczenie DNAA starterów do nici dodatnich i ujemnych matrycy DNA oraz wydłużenie produktu PCR.
Czasy cykli są oparte na wielkości matrycy i zawartości GC w DNA dla ogólnego wzoru. Zacznij od wstępnej denaturacji szablonu, a następnie zainicjuj od 25 do 35 rund trzyetapowego programu cyklu temperatury. Pierwszym krokiem tych cykli jest denaturacja matrycy DNA.
Następnie zaprogramuj optymalne, uklęknięcie starterów około pięciu stopni Celsjusza poniżej pozornej temperatury topnienia starterów, a następnie etap wydłużenia, aby doprowadzić polimerazę do matrycy DNA i zsyntetyzować produkt PCR. Teraz wprowadź liczbę cykli. Następny program.
Wydłużony etap wydłużania w celu zakończenia syntezy amplikonów. Na koniec dołącz etap zakończenia, schładzając mieszaninę do czterech stopni Celsjusza. Jeśli standardowe warunki PCR nie dają pożądanego amplikonu, konieczna jest optymalizacja PCR, aby osiągnąć lepsze wyniki.
Jeśli więc reakcje nie zadziałały za pierwszym razem, chcesz spróbować rozwiązać problem z reakcją. Więc najpierw chcesz się upewnić, że problem nie był błędem ludzkim. Może się to zdarzyć, jeśli wystąpi błąd w pipetowaniu lub jeśli zapomnisz dodać odczynnika do testu, jednej z probówek.
Następnie możesz spróbować zmienić niektóre z rygorystycznych warunków, aby zmienić konfigurację termocyklera lub możesz zmienić stężenie magnezu to inna alternatywna metoda. Możesz także spróbować dodać kilka dodatków do odczynnika, aby rozwiązać problemy. Alternatywnie, rozważ hot start PCR jako wszechstronną modyfikację, w której początkowy czas denaturacji jest znacznie wydłużony.
Elektroforeza żelowa AROS jest następnie stosowana do rozpuszczania PCR genu GAL trzy z genomowego DNA S seia w celu określenia optymalnego stężenia jonów magnezu dla tego zestawu odczynników, należy zauważyć, że produkt PCR o oczekiwanej wielkości. 2098 par zasad pojawia się, zaczynając od stężenia magnezu 2,5 milimola z optymalnym stężeniem przy czterech milimolach na różnych matrycach DNA amplifikacja pożądanego produktu PCR, ponieważ dyskretne pasmo wymaga dwóch magnez milimolowy. Zmniejszenie rygorystyczności reakcji do skutecznie nieoptymalnych warunków amplifikacji powoduje powstanie rozmazu niespecyficznych produktów.
Ponadto, przy ogólnej rygorystyczności redukcji reakcji, do utworzenia ikony amplikonu wymagana jest mniejsza ilość jonu magnezu. W ten sposób optymalizacja PCR przy jednoczesnym uwzględnieniu zmiennych może wytworzyć dyskretny pożądany produkt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować i przygotować reakcję łańcuchową polimerazy.
Celem jest zrozumienie zmiennych każdego PCR i tego, jak można nimi manipulować, aby stworzyć pożądany amplikon.
Przegląd
Ten artykuł zapewnia kompleksowy przewodnik po technice reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), szczegółowo opisując niezbędne kroki do udanego wzmocnienia DNA. Podkreśla znaczenie zrozumienia zmiennych reakcji dla rozwiązywania problemów i optymalizacji wyników PCR.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia molekularna
- Genetyka
- Biotechnologia
Tło
- PCR jest szeroko stosowaną metodą wzmacniania DNA.
- Każda reakcja PCR jest unikalna, wymagająca specyficznych warunków.
- Zrozumienie komponentów i ich ról jest kluczowe dla sukcesu.
- Typowymi wyzwaniami są błędy pipetowania i obliczenia reagentów.
Cel badania
- Aby pokazać kroki związane z ustawianiem reakcji PCR.
- Aby zapewnić wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów z typowymi problemami PCR.
- Aby podkreślić znaczenie optymalizacji warunków reakcji.
Stosowane metody
- Przygotowanie reagentów i materiałów PCR.
- Ustawienie mieszanki reakcyjnej z precyzyjnymi objętościami.
- Programowanie warunków cyklu termicznego dla wzmocnienia DNA.
- Używanie elektroforezy żelowej do analizy produktów PCR.
Główne wyniki
- Udało się uzyskać pomyślne wzmocnienie segmentów DNA.
- Optymalizacja stężenia jonów magnezu poprawiła wyniki.
- Zidentyfikowano typowe strategie rozwiązywania problemów.
- Zmienność warunków reakcji okazała się wpływać na wyniki.
Wnioski
- Zrozumienie komponentów PCR jest niezbędne dla efektywnego rozwiązywania problemów.
- Optymalizacja warunków może znacznie poprawić sukces PCR.
- Przyszłe eksperymenty powinny skupiać się na doskonaleniu technik dla lepszych wyników.
