Name: Reakcja łańcuchowa polimerazy: podstawowy protokół oraz strategie rozwiązywania problemów i optymalizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj podstawowy protokół reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do amplifikacji DNA oraz strategie rozwiązywania problemów i optymalizacji warunków reakcji. Naucz się przygotowywać mieszanki i analizować wyniki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szczególne podziękowania kieruję do Krisa Reddiego z UCLA za przygotowanie odczynników i wylanie żeli oraz do Erin Sanders z UCLA za inspirację, wskazówki, wsparcie i korektę rękopisu. Chciałbym również podziękować Giancarlo Costagucie i Gregory'emu S. Payne'owi za dostarczenie genomowego DNA drożdży oraz starterów do amplifikacji genu GAL3. Dziękuję również Bhairavowi Shahowi za wykonanie zdjęć sprzętu laboratoryjnego i odczynników wykorzystanych do przygotowania rysunków 2–4. Finansowanie projektu zostało zapewnione przez HHMI (grant HHMI nr 52006944).

<ol><li>Albert, J., Fenyo, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+sensitive%2C+and+specific+detection+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+clinical+specimens+by+polymerase+chain+reaction+with+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple sensitive, and specific detection of human immunodeficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 1560-1564 (1990).</li>
<li>Baskaran, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+amplification+of+a+mixture+of+deoxyribonucleic+acids+with+varying+GC+content%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Uniform amplification of a mixture of deoxyribonucleic acids with varying GC content.</a> Genome Res. 6, 633-638 (1996).</li>
<li>Blanchard, M. M., Taillon-Miller, P., Nowotny, P., Nowotny, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+buffer+optimization+with+uniform+temperature+regimen+to+facilitate+automation%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">PCR buffer optimization with uniform temperature regimen to facilitate automation.</a> PCR Methods Appl. 2, 234-240 (1993).</li>
<li>Borer, P. N., Dengler, B., Tinoco, I. Jr, Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+ribonucleic+acid+double-stranded+helices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stability of ribonucleic acid double-stranded helices.</a> J. Mol. Biol. 86, 843-853 (1974).</li>
<li>Breslauer, K. J., Frank, R., Blocker, H., Marky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+DNA+duplex+stability+from+the+base+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Predicting DNA duplex stability from the base sequence.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 3746-3750 (1986).</li>
<li>Chou, Q., Russell, M., Birch, D. E., Raymond, J., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+pre-PCR+mis-priming+and+primer+dimerization+improves+low-copy-number+amplifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications.</a> Nucleic Acids Res. 20, 1717-1723 (1992).</li>
<li>Coleman, W. B., Tsongalis, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColeman%2C+WB+%22Diagnostics+for+the+clinical+laboration%22">Diagnostics for the clinical laboration</a>. , Humana Press. (2005).</li>
<li>D'Aquila, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+sensitivity+and+specificity+of+PCR+by+pre-amplification+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating.</a> Nucleic Acids Res. 19, 3749(1991).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3, S30-S37 (1993).</li>
<li>Don, R. H., Cox, P. T., Wainwright, B. J., Baker, K., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Touchdown%27+PCR+to+circumvent+spurious+priming+during+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4008(1991).</li>
<li>Erlich, H. A., Gelfand, D., Sninsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the polymerase chain reaction.</a> Science. 252, 1643-1651 (1991).</li>
<li>Frey, U. H., Bachmann, H. S., Peters, J., Siffert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-amplification+of+GC-rich+regions%3A+%27slowdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">PCR-amplification of GC-rich regions: 'slowdown PCR.</a> Nat. Protoc. 3, 1312-1317 (2008).</li>
<li>Haqqi, T. M., Sarkar, G., David, C. S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+amplification+with+PCR+of+a+refractory+segment+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specific amplification with PCR of a refractory segment of genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 16, 11844(1988).</li>
<li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li>
<li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInnis%2C+MA+%22PCR+Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR Protocols: A guide to methods and applications</a>. , Academic Press, Inc. San Diego. (1990).</li>
<li>King, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+N+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 630, Humana Press. (2010).</li>
<li>Kleppe, K., Ohtsuka, E., Kleppe, R., Molineux, I., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+polynucleotides.+XCVI.+Repair+replications+of+short+synthetic+DNA%27s+as+catalyzed+by+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases.</a> J. Mol. Biol. 56, 341-361 (1971).</li>
<li>Korbie, D. J., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touchdown+PCR+for+increased+specificity+and+sensitivity+in+PCR+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification.</a> Nat. Protoc. 3, 1452-1456 (2008).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Appendix 3, 1-14 (2001).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, Appendix 4J(2002).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Kwok, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+immunodeficiency+virus+sequences+by+using+in+vitro+enzymatic+amplification+and+oligomer+cleavage+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection.</a> J. Virol. 61, 1690-1694 (1987).</li>
<li>McConlogue, L., Brow, M. A., Innis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-independent+DNA+amplification+by+PCR+using+7-deaza-2%27-deoxyguanosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-independent DNA amplification by PCR using 7-deaza-2'-deoxyguanosine.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9869(1988).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unusual+origin+of+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Am%22%5BJournal%5D)">The unusual origin of the polymerase chain reaction.</a> Sci. Am. 262, 56-65 (1990).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+amplification+for+DNA+analysis+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biol.+Clin.+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction.</a> Ann. Biol. Clin. (Paris). 48, 579-582 (1990).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction+in+an+anemic+mode%3A+how+to+avoid+cold+oligodeoxyribonuclear+fusion%29%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion).</a> PCR Methods Appl. 1, 1-4 (1991).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Paabo, S., Gifford, J. A., Wilson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+sequences+from+a+7000-year+old+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain.</a> Nucleic Acids Res. 16, 9775-9787 (1988).</li>
<li>Rees, W. A., Yager, T. D., Korte, J., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+can+eliminate+the+base+pair+composition+dependence+of+DNA+melting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting.</a> Biochemistry. 32, 137-144 (1993).</li>
<li>Roux, K. H., Hecker, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+optimization+using+touchdown+and+stepdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">One-step optimization using touchdown and stepdown PCR.</a> Methods Mol. Biol. 67, 39-45 (1997).</li>
<li>Rychlik, W., Spencer, W. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+annealing+temperature+for+DNA+amplification+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239, 487-491 (1988).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
<li>Sambrook, J. A. R., David, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+JAR+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual</a>. 2, 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Sarkar, G., Kapelner, S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formamide+can+dramatically+improve+the+specificity+of+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formamide can dramatically improve the specificity of PCR.</a> Nucleic Acids Res. 18, 7465(1990).</li>
<li>Smit, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+codon+12+mutations+occur+very+frequently+in+pancreatic+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS codon 12 mutations occur very frequently in pancreatic adenocarcinomas.</a> Nucleic Acids Res. 16, 7773-7782 (1988).</li>
<li>Wilson, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+facilitation+of+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 3741-3751 (1997).</li>
<li>Wu, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+R+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 218, Academic Press, Inc. San Diego. (1993).</li>
</ol>

Nie mam nic do ujawnienia.

PCR stał się niezbędnym narzędziem w arsenale nauk biologicznych. PCR zmienił bieg nauki, umożliwiając biologom kontrolę nad genomami i tworzenie genów hybrydowych o nowych funkcjach, co pozwala na specyficzne i dokładne testy kliniczne, uzyskiwanie wiedzy na temat genomów i różnorodności, a także po prostu klonowanie genów do dalszych analiz biochemicznych. Zastosowanie PCR jest ograniczone jedynie wyobraźnią naukowca, który z niego korzysta. Istnieje wiele książek i publikacji opisujących nowe, wyspecjalizowane zastosowania PCR, a w następnym pokoleniu nauk biologicznych powstanie ich znacznie więcej. Jednak niezależnie od przewidywanych podejść, podstawowe założenia pozostają niezmienne. PCR, w całym swoim znaczeniu, jest aplikacją in vitro służącą do generowania dużych ilości specyficznego fragmentu DNA.
Projektowanie eksperymentu PCR wymaga przemyślenia i cierpliwości. Wyniki przedstawione na Rysunku 3 obrazują jedno z głównych wyzwań podczas opracowywania strategii optymalizacji PCR. Chodzi o to, że zmiana jednego parametru PCR może wpłynąć na inny. Na przykład, jeśli początkowa reakcja PCR została przeprowadzona w suboptymalnej temperaturze przyłączania (58°C) przy optymalnym stężeniu Mg2+ wynoszącym 2,0 mM, wynikiem będzie rozmazany pas (smear), jak pokazano na Rysunku 3c. Próba wyeliminowania rozmycia mogłaby polegać na ustaleniu warunków PCR z reakcjami zawierającymi 2,0 mM MgCl2 i skorygowaniu temperatury przyłączania do 61°C. Jednak, jak widać na Rysunku 3a, nie doprowadziłoby to do uzyskania produktu. W związku z tym, podczas rozwiązywania problemów z błędnymi wynikami, zaleca się miareczkowanie odczynników, zamiast dodawania jednego stężenia do pojedynczej reakcji. Ponadto najczęstszymi korektami wymaganymi do optymalizacji eksperymentu PCR są zmiana stężenia Mg2+ oraz korekta temperatur przyłączania. Jeśli jednak zmiany te nie zminimalizują lub nie usuną aberracyjnych wyników, miareczkowanie dodatków i/lub zmiana protokołów warunków cykliczności, opisanych w Tabelach 2-6, może pomóc w rozwiązaniu problemu. Jeśli wszystkie powyższe metody zawiodą, należy zaprojektować primery na nowo i próbować ponownie.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; polimeraza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545-25UN</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Qiagen</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>Probówki PCR o cienkich ściankach 0,2 ml</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9469</td><td></td></tr><tr><td>Zakrętki do probówek o cienkich ściankach 0,2 ml</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9472</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sól disodowa dwuwodniana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>Dedykowany starter fagowy</td><td>Invitrogen</td><td>25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG</td><td></td></tr><tr><td>Dedykowany starter fagowy</td><td>Invitrogen</td><td>26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT</td><td></td></tr><tr><td>Dedykowany starter drożdżowy</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>SacI-Gal3(-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG</td><td></td></tr><tr><td>Dedykowany starter drożdżowy</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Gal3(1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9703</td><td>My Cycler</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>ISC BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforeza żelowa</td><td>Hoeffer Scientific Instruments</td><td>Model HE33</td><td></td></tr><tr><td>Marker DNA 1 kb</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz Bio Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td>PowerPac Basic </td></tr><tr><td>System Gel Doc</td><td>Fotodyne Incorporated</td><td>FOTO/Analyst Investigator FX Workstation</td><td></td></tr></tbody></table>

reakcja łańcuchowa polimerazy: podstawowy protokół oraz strategie rozwiązywania problemów i optymalizacji

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

W naukach biologicznych nastąpiły postępy technologiczne, które wprowadziły tę dyscyplinę w złote ery odkryć. Na przykład dziedzina mikrobiologii została przekształcona dzięki wynalezieniu mikroskopu przez Antona van Leeuwenhoeka, co po raz pierwszy pozwoliło naukowcom na wizualizację prokariontów. Opracowanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) jest jedną z tych innowacji, które zmieniły bieg nauk molekularnych, a ich wpływ objął niezliczone poddyscypliny biologii. Proces teoretyczny został opisany przez Keppego i współpracowników w 1971 roku; jednak minęło kolejne 14 lat, zanim pełna procedura PCR została opisana i zastosowana eksperymentalnie przez Kary'ego Mullisa w 1985 roku podczas pracy w Cetus Corporation. Automatyzacja i udoskonalenie tej techniki postępowały wraz z wprowadzeniem termostabilnej polimerazy DNA z bakterii Thermus aquaticus, co zaowocowało nazwą polimeraza DNA Taq.
PCR jest potężną techniką amplifikacji, która pozwala na wygenerowanie znacznej ilości konkretnego fragmentu DNA (tj. amplikonu) z niewielkiej ilości materiału wyjściowego (tj. matrycy DNA lub sekwencji docelowej). Choć metoda ta jest prosta i zazwyczaj bezproblemowa, istnieją pułapki, które mogą skomplikować reakcję i doprowadzić do błędnych wyników. Niepowodzenie PCR może skutkować powstaniem wielu niespecyficznych produktów DNA o różnych rozmiarach, które na żelach agarozowych widoczne są jako drabinka lub rozmycie prążków. Czasami nie powstają żadne produkty. Inny potencjalny problem pojawia się, gdy w amplikonach nieumyślnie wprowadzone zostaną mutacje, co prowadzi do powstania heterogenicznej populacji produktów PCR. Niepowodzenia w PCR mogą być frustrujące, chyba że zastosuje się cierpliwość i staranną analizę błędów w celu zidentyfikowania i rozwiązania problemów. Niniejszy protokół przedstawia podstawowe zasady PCR, opisuje metodologię pozwalającą na amplifikację większości sekwencji docelowych oraz prezentuje strategie optymalizacji reakcji. Podążając za tym przewodnikiem po PCR, studenci powinni być w stanie: 
 
● Przygotować reakcje i warunki cykli termicznych dla konwencjonalnego eksperymentu PCR 
● Zrozumieć funkcję poszczególnych składników reakcji oraz ich ogólny wpływ na przebieg eksperymentu PCR 
● Zaprojektować i zoptymalizować eksperyment PCR dla dowolnej matrycy DNA 
● Rozwiązywać problemy w przypadku nieudanych eksperymentów PCR

PCR stał się powszechną techniką w wielu laboratoriach biologii molekularnej. Niniejszym przedstawiamy krótki przewodnik po kilku konwencjonalnych protokołach PCR. Ponieważ każda reakcja jest unikalnym eksperymentem, optymalne warunki niezbędne do otrzymania produktu są zmienne. Zrozumienie zmiennych w reakcji znacznie zwiększy efektywność rozwiązywania problemów, zwiększając tym samym szansę na uzyskanie pożądanego wyniku.

Reakcja łańcuchowa polimerazy: podstawowy protokół oraz strategie rozwiązywania problemów i optymalizacji

W naukach biologicznych nastąpiły postępy technologiczne, które wprowadziły tę dyscyplinę w złote ery odkryć. Na przykład w dziedzinie...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie etapów reakcji łańcuchowej polimerazy, czyli PCR, która służy do wytworzenia znacznej ilości konkretnego fragmentu DNA z niewielkiej ilości materiału wyjściowego. Najpierw należy przygotować odczynniki i materiały niezbędne do przeprowadzenia reakcji PCR, a następnie sporządzić mieszaninę reakcyjną, zawierającą cztery deinoksyrybonukleotydy, matrycę DNA, primery oraz polimerazę DNA. Następnie należy zaprogramować warunki cykli termicznych i przeprowadzić reakcję PCR.Następnie należy sprawdzić wyniki, aby ustalić, czy reakcja przebiegła pomyślnie. W rezultacie reakcja łańcuchowa polimerazy powinna przynieść specyficzny amplikon o pożądanej wielkości produktu.Zazwyczaj osoby po raz pierwszy stosujące ten protokół mogą mieć pewne trudności z obliczeniem ilości każdego z odczynników zmiennych, a czasem z samym pipetowaniem właściwych objętości, zwłaszcza w przypadku polimerazy zawierającej glicerol. Doświadczenie należy rozpocząć od przygotowania świeżo napełnionego wiaderka z lodem. Należy nosić rękawiczki, aby uniknąć zanieczyszczenia reakcji.Mieszanina i odczynniki. Przygotować komponenty PCR na lodzie do całkowitego rozmrożenia. Należą do nich primery do matrycy DNA, polimeraza DNA, 10x bufor reakcyjny z chlorkiem magnezu lub bez niego, deoksynukleotydy, sterylna woda oraz chlorek magnezu.Chlorek magnezu jest wymagany w przypadku stosowania buforu bez chlorku magnezu. Umieść płytkę 96-dołkową w wiaderku z lodem, aby służyła jako uchwyt dla probówek PCR o cienkich ściankach o pojemności 0,2 ml. Następnie przygotuj na stole roboczym probówki PCR i zakrętki.Statyw na probówki do PCR, marker odporny na etanol oraz zestaw mikropipet. Zawsze należy przygotować tabelę odczynników szczegółowo opisującą mieszaninę reakcyjną z odpowiednią ilością sterylnej wody destylowanej w celu uzyskania końcowej objętości 50 µL. Na przykład, stosując 5 µL buforu bez magnezu, 1 µL 10 mM dNTP oraz zoptymalizowane 4,0 mM magnezu.Jeden µL każdego z 20 µM starterów, 0,5 µL matrycy o stężeniu 2 ng/µL oraz 0,5 µL polimerazy wymagają dodania 33 µL samej sterylnej wody. Należy dodać chlorek magnezu, jeśli nie znajduje się on w buforze 10x lub jeśli jest on wymagany do optymalizacji PCR.Należy opisać probówki do PCR markerem odpornym na etanol, przypisując etykietę do każdej probówki z reakcją. Najpierw dodaj obliczone ilości sterylnej wody, a następnie dodaj bufor 10 x oraz DN NTPs 10 millimolar. W tej reakcji przeprowadzamy miareczkowanie chlorkiem magnezu.Ponieważ stężenie magnezu nie będzie stałe, do poszczególnych probówek PCR dodaje się osobno chlorek magnezu, a objętość uzupełnia się do 10 µl sterylną wodą, tak aby do każdej probówki PCR dodać 40 µl końcowego master mixu. Aby dopełnić 50 µl reakcji i chlorek magnezu, należy następnie dodać matrycę DNA oraz primery. Na koniec do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1,8 ml dodaje się od 0,5 do 2,5 jednostek polimerazy DNA na 50 µl reakcji.Przygotuj roztwór master mix w ilości wystarczającej dla próbek kontrolnych oraz z uwzględnieniem strat podczas przenoszenia pipetą. Ustaw mikropipetę na objętość wynoszącą około połowy całkowitej objętości roztworu i delikatnie wymieszaj poprzez pipetowanie. Do każdej próbki testowej odnieś odpowiednią ilość master mix do probówki PCR.W przypadku kontroli negatywnej bez matrycy DNA, należy dodać wszystkie odczynniki i użyć sterylnej wody w celu zrekompensowania brakującej objętości DNA. Następnie, dla kontroli pozytywnej, należy zastosować zestaw matrycy DNA i starterów, które amplifikują znany fragment w tych samych warunkach, co eksperymentalne próbki PCR. Termocyklery do PCR szybko nagrzewają i chłodzą mieszaninę reakcyjną, co umożliwia indukowaną ciepłem denaturację dupleksu, przyłączanie starterów do nici plus i minus matrycy DNA oraz elongację produktu PCR.Czasy cykli opierają się na wielkości matrycy oraz zawartości GC w DNA zgodnie z ogólną formułą. Rozpocznij od wstępnej denaturacji matrycy, a następnie przeprowadź od 25 do 35 rund trzystopniowego programu cykli temperaturowych. Pierwszym krokiem tych cykli jest denaturacja matrycy DNA.Następnie zaprogramuj optymalną temperaturę przyłączania starterów, wynoszącą około pięciu stopni Celsiusz poniżej pozornej temperatury topnienia starterów, po której następuje etap elongacji, aby doprowadzić polimerazę do matrycy DNA i zsyntetyzować produkt PCR. Teraz wprowadź liczbę cykli. Następnie zaprogramuj.Przedłużony etap elongacji w celu całkowitego przeprowadzenia syntezy amplikonów. Na koniec należy wprowadzić etap terminacji, schładzając mieszaninę do czterech stopni Celsiusjusza. Jeśli standardowe warunki PCR nie pozwalają na otrzymanie pożądanego amplikonu, konieczna jest optymalizacja PCR w celu uzyskania lepszych wyników.W przypadku, gdy reakcje nie powiodły się za pierwszym razem, należy podjąć próbę rozwiązania problemu. W pierwszej kolejności należy upewnić się, że przyczyną nie był błąd ludzki. Może to wystąpić w razie błędu podczas pipetowania lub jeśli pominięto dodanie odczynnika do jednej z probówek.Następnie można spróbować zmienić niektóre parametry rygorystyczności warunków, aby zmodyfikować ustawienia termocyklera, lub alternatywnie zmienić stężenie magnezu. W celu rozwiązania problemów można również spróbować dodać do odczynników odpowiednie dodatki. Innym rozwiązaniem jest rozważenie PCR z gorącym startem (hot start PCR) jako wszechstronnej modyfikacji, w której znacznie wydłużany jest czas począgłej denaturacji.Następnie zastosowano elektroforezę w żelu AROS w celu rozdzielenia produktów PCR genu GAL trzech z genomowego DNA S seia, aby określić optymalne stężenie jonów magnezu dla tego zestawu odczynników; zauważono, że produkt PCR o oczekiwanym rozmiarze 2098 par zasad pojawia się począwszy od stężenia magnezu 2,5 millimolar, przy czym stężenie optymalne wynosi cztery millimolar. W przypadku amplifikacji pożądanego produktu PCR z różnych matryc DNA jako wyraźnego prążka, wymagane jest stężenie magnezu 2 millimolar. Zmniejszenie rygorystyczności reakcji do warunków efektywnie suboptymalnych dla amplifikacji powoduje powstanie smug produktów nieswoistych.Ponadto, dzięki ogólnemu zmniejszeniu rygoryzmu reakcji, do utworzenia amplikonu wymagana jest mniejsza ilość jonów magnezu. W związku z tym optymalizacja PCR przy uwzględnieniu wszystkich zmiennych może pozwolić na uzyskanie konkretnego, pożądanego produktu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować i przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy.Celem jest zrozumienie zmiennych każdego procesu PCR oraz sposobów ich manipulowania w celu uzyskania pożądanego amplikonu.

polymerase-chain-reaction-basic-protocol-plus-troubleshooting

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy metodę ukierunkowanego odzyskiwania sekwencji starożytnego DNA, którą wykorzystaliśmy do rekonstrukcji kompletnych genomów mitochondrialnych pięciu osobników neandertalczyków. Porównanie tych sekwencji z genomami współczesnych ludzi sugeruje, że neandertalczycy przez długi czas charakteryzowali się niską efektywną wielkością populacji.

Wychwyt poprzez elongację starterów: celowane odzyskiwanie sekwencji z silnie zdegradowanych źródeł DNA

Ten film demonstruje gradientową reakcję łańcuchową polimerazy w celu optymalizacji temperatury wyżarzania podkładów, która ustawia gradientową temperaturę wyżarzania wzdłuż studni. Wpływ różnych temperatur wyżarzania zależy od wydajności amplifikowanych produktów, co pomaga zoptymalizować warunki reakcji.

Gradientowa reakcja łańcuchowa polimerazy w celu określenia optymalnej temperatury wyżarzania

Testy oporności na leki dla osób zakażonych wirusem HIV-1, u których nie powiodła się terapia antyretrowirusowa (ART), mogą ukierunkować przyszłe terapie i poprawić wyniki leczenia. Optymalizacja indywidualnych i populacyjnych wyników zdrowotnych w warunkach wysokiego rozpowszechnienia HIV, ale ograniczonych zasobów, będzie ostatecznie wymagała przystępnych cenowo i dostępnych metod genotypowania i interpretacji oporności na leki.

Przystępna cenowo metoda monitorowania oporności na leki HIV-1 w warunkach ograniczonych zasobów

Dwa różne protokoły szybkiej amplifikacji końców cDNA (3' RACE) opisane tutaj wykorzystują dwie różne polimerazy DNA do mapowania sekwencji, które zawierają segment otwartej ramki odczytu (ORF), kodon stop i cały 3' UTR transkryptu za pomocą RNA uzyskanego z różnych linii komórek nowotworowych.

Adaptacja 3'szybkiej amplifikacji końców CDNA do mapowania transkryptów w raku

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest użytecznym narzędziem do bardzo czułego wykrywania wariantów pojedynczych nukleotydów i wariantów liczby kopii DNA. W tym miejscu przedstawiamy kluczowe zagadnienia dotyczące pomiaru rzadkich wariantów w ludzkim genomie za pomocą cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube.

Cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy pod kątem zmienności genetycznej u pacjenta ze sporadyczną rodzinną polipowatością gruczolakowatą przy użyciu formatu chip-in-a-tube

Klonujemy i analizujemy geny reporterowe generujące koliste RNA. Te geny reporterowe są większe niż konstrukty do analizy splicingu liniowego i zawierają elementy Alu. Aby zbadać koliste RNA, konstrukty są transfekowane do komórek, a otrzymany RNA jest analizowany za pomocą RT-PCR po usunięciu liniowego RNA.

Wykorzystanie pierwiastka aluminiowego zawierającego minigeny do analizy kolistych RNA

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego i specyficznego usuwania interesującego białka w drożdżach Saccharomyces cerevisiae za pomocą systemu AID β-est.

Dostrajanie degradacji w celu osiągnięcia specyficznego i wydajnego zubożenia białek

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Dobrze scharakteryzowane części genetyczne są niezbędne do projektowania nowych obwodów genetycznych. W tym miejscu opisujemy ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę szybkiego charakteryzowania części genetycznych. Nasza metoda zmniejsza koszty i czas dzięki połączeniu lizatów bezkomórkowych, liniowego DNA w celu uniknięcia klonowania oraz akustycznej obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości i zmniejszenia objętości reakcji.

Szybka charakterystyka części genetycznych za pomocą systemów bezkomórkowych

Reakcja Ugiego okazała się wygodnym sposobem na szybkie tworzenie zróżnicowanych bibliotek związków. Polega ona na reakcji aminy, aldehydu, kwasu karboksylowego i izonitrilego, zazwyczaj w metanolu w temperaturze pokojowej. W tym filmie wykorzystujemy 48-miejscowy blok Mettler-Toledo MiniBlock wyposażony w rurki filtracyjne oraz zautomatyzowany dozownik cieczy Mettler-Toledo MiniMapper do dostarczania odczynników i rozpuszczalnika. Parametrami poddanymi analizie były stężenie, skład...

Optymalizacja reakcji Ugiego z wykorzystaniem syntezy równoległej i automatycznej obsługi cieczy

Poznaj podstawowy protokół reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do amplifikacji DNA oraz strategie rozwiązywania problemów i optymalizacji warunków reakcji. Naucz się przygotowywać mieszanki i analizować wyniki.

Reakcja łańcuchowa polimerazy: podstawowy protokół oraz strategie rozwiązywania problemów i optymalizacji

Przeglądaj więcej filmów