Adaptacja 3'szybkiej amplifikacji końców CDNA do mapowania transkryptów w raku

Ogólnym celem tej procedury jest określenie sekwencji transkryptów mRNA od końca trójkrotnego do regionów w regionie kodującym białko przy użyciu zagnieżdżonych starterów specyficznych dla transkryptu w dwóch kolejnych PCR i sekwencjonowaniu oczyszczonych produktów PCR. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki, takie jak określenie sygnału poliadenylacji, kodonu stop i sekwencji nieulegającego translacji regionu trzech liczb pierwszych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować do dowolnego transkryptu, jeśli sekwencja małego obszaru otwartej ramki odczytu jest Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy raka, ponieważ może wykrywać specyficzne dla nowotworu geny fuzyjne i warianty splicingu.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zidentyfikowaliśmy nowe transkrypty z wcześniej niescharakteryzowanymi, trójelementowymi nieulegającymi translacji regionami. Aby rozpocząć protokół, rozmrozić mieszaninę komórek izotiocyjanianu fenolu i guanidyny na lodzie. Po rozmrożeniu dodaj 100 mikrolitrów chloroformu do probówki mikrowirówki w kapturze do PCR.

Wirować próbkę przez 10 do 15 sekund, aż mieszanina stanie się różowa i nieprzezroczysta. Następnie inkubować próbkę na lodzie przez 15 minut. Po inkubacji odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 20, 800 g i czterech stopniach Celsjusza.

Ostrożnie usuń górną bezbarwną fazę wodną i przenieś ją do nowej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. Następnie przejdź do wytrącania i dodaj równą objętość izopropanolu do próbki. Dodaj jeden mikrolitr współprecypitentu do próbki, aby działał jako nośnik dla RNA i pomagał w wizualizacji RNA w kolejnych krokach.

Próbki należy inkubować w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny. Po inkubacji przenieść próbkę do schłodzonej wirówki i wirować przez 35 minut w temperaturze 20, 800 g i czterech stopniach Celsjusza. Po wirowaniu RNA pojawi się jako niebieska specyfikacja na dnie probówki.

Ostrożnie usunąć izopropanol z próbki. Dodaj 500 mikrolitrów 80% etanolu i ponownie zawieś granulkę, krótko wirując przez trzy sekundy. Ponownie odwirować próbkę.

Usunąć cały etanol z próbki i pozostawić próbkę do wyschnięcia na powietrzu przez około 10 minut. Po wyschnięciu próbki należy ją ponownie zawiesić w 35 mikrolitrach wody wolnej od RNaz. Następnie umieść próbkę na bloku grzewczym.

Ustaw na 65 stopni Celsjusza na pięć minut, aby upewnić się, że RNA jest w pełni w roztworze. Po podgrzaniu natychmiast umieść rurkę na lodzie. Aby uzyskać końcową objętość reakcji 50 mikrolitrów, dodaj cztery mikrogramy całkowitego RNA z dodatkiem wody do całkowitej objętości 22 mikrolitrów do nowej probówki.

Dodać dwa mikrolitry startera Oligo dT 25 z 10-mikromolowego roztworu startera. Z zestawu do odwrotnej transkrypcji dodaj dwa mikrolitry inhibitora RNazy, osiem mikrolitrów 5-krotnego buforu reakcyjnego, cztery mikrolitry 10-milimolowych dNTP i dwa mikrolitry odwrotnej transkryptazy. Ustaw reakcję bez odwrotnej transkryptazy, aby działała jako kontrola ujemna.

Inkubuj probówkę w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji przenieś rurkę bezpośrednio do lodu przed przetransportowaniem jej do bloku grzewczego. Następnie podgrzej rurkę w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Po podgrzaniu do 75 stopni Celsjusza umieść rurkę na lodzie. Przenieś dwa mikrolitry cDNA do świeżej 0,5 mililitrowej probówki do PCR. Dodaj jeden mikrolitr startera do przodu i jeden mikrolitr startera wstecznego z 10-milimolowego roztworu startera.

Uzupełnić do 12,5 mikrolitra, dodając 8,5 mikrolitra wody bez nukleaz i dodać 12,5 mikrolitra 2x PCR do głównej mieszanki żelowej. Następnie wprowadź warunki cykli termicznych PCR wymienione na ekranie i uruchom PCR. Po PCR przygotuj 1% żel agarozowy barwiony bromkiem etydyny.

Rozpuścić jeden gram agarozy w 100 mililitrach trioctanu lub buforu TAE w kolbie o pojemności 250 mililitrów. Zagotuj zawartość w kuchence mikrofalowej. Pozostaw żel do ostygnięcia na minutę i dodaj 7,5 mikrolitra roztworu bromku etydyny do dygestorium.

Dobrze wymieszać, obracając kolbą. Wlać zawartość do poziomego aparatu żelowego i pozostawić żel do zestalenia się w temperaturze pokojowej w dygestorium przez co najmniej 30 minut. Przykryj żel 1x buforem TAE i załaduj 10 mikrolitrów produktu PCR na żel agarozowy wraz z trzema do pięciu mikrolitrami drabinki masy cząsteczkowej DNA.

Uruchom żel pod napięciem 175 V przez 10 minut. W przypadku pierwszego PCR przenieś jeden mikrolitr cDNA do probówki PCR i dodaj pięć mikrolitrów 10x buforu reakcyjnego Pfu. Dodaj jeden mikrolitr pierwszego zagnieżdżonego startera do przodu, jeden mikrolitr startera T7 Oligo dT 25 i jeden mikrolitr dNTP z 10-milimolowego roztworu.

Uzupełnić do 49 mikrolitrów całkowitej objętości, dodając 40 mikrolitrów wody. Dodaj jeden mikrolitr polimerazy DNA Pfu i dobrze wymieszaj. Następnie uruchom PCR.

Następnie przygotuj drugi PCR. Przenieś dwa mikrolitry produktów z pierwszego PCR do nowej probówki PCR i wymieszaj je z pięcioma mikrolitrami 10x buforu reakcyjnego Pfu ultra dwa. Dodaj jeden mikrolitr drugiego zagnieżdżonego startera PCR, jeden mikrolitr startera T7 i jeden mikrolitr dNTP.

Uzupełnić do 49 mikrolitrów całkowitej objętości reakcji, dodając 39 mikrolitrów wody i dodając jeden mikrolitr polimerazy DNA Pfu. Uruchom PCR przy użyciu tego samego profilu PCR, co pierwsza konfiguracja PCR. Alternatywnie, zamiast używać polimerazy DNA Pfu, chimeryczna polimeraza DNA może być użyta w dwóch różnych PCR.

Weź od pięciu do dziesięciu mikrolitrów drugiego produktu PCR i uruchom go na żelu agarozowym. Na koniec zwizualizuj wynik na imagerze. Ten żel agarozowy przedstawia dwa odrębne produkty PCR, które wykorzystują ten sam starter do przodu, ale różne startery odwrotne oraz odrębny produkt PCR, który ma wyraźny starter do przodu i do tyłu.

Idealnymi starterami do użycia w reakcji opartej na PCR są te, które dają jeden odrębny produkt PCR. Produkty z drugiej reakcji PCR z polimerazą DNA Pfu i chimeryczną polimerazą DNA dały produkty PCR tej samej wielkości, pomimo różnych warunków cyklu PCR dla trzech głównych RACE. Kontrole ujemne odwrotnej transkryptazy nie wykazały zanieczyszczenia genomowego RNA wykorzystywanego w syntezie cDNA, a także w późniejszych reakcjach.

Oczyszczone żelem produkty PCR zostały wysłane do sekwencjonowania. Reprezentatywna sekwencja Sangera z chromatogramu sekwencyjnego zidentyfikowała położenie kodonu stop, przypuszczalnego sygnału poliadenylacji oraz miejsca, a także ogona poli A w trójelementowym produkcie RACE. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby przez cały czas nosić odzież ochronną i rękawice.

Ponadto należy używać sterylnych DNaz i RNaz do probówek z odczynnikami i innych materiałów jednorazowego użytku. Nie zapominaj, że praca z fenolem i chloroformem może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie odczynników w okapie i wyrzucanie materiału do wyznaczonego pojemnika na odpady.