Name: Adaptacja 3szybkiej amplifikacji końców CDNA do mapowania transkryptów w raku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę 3' RACE do mapowania transkryptów mRNA w liniach komórkowych raka. Technika ta umożliwia identyfikację ramy odczytu, kodonu stop i regionu 3' UTR, wspierając badania nad genetyką nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Bettine Gibbs za jej pomoc techniczną.

Noś fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne przez cały czas podczas wykonywania wszystkich procedur w tym protokole. Upewnij się, że pojemniki/probówki zawierające odczynnik izotiocyjanianu fenolu i guanidyny są otwierane wyłącznie w certyfikowanym kapturze, a odpady fenolowe należy wyrzucać do przeznaczonego do tego pojemnika. Używaj sterylnych probówek, końcówek i odczynników wolnych od DNAzy/RNAzy.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hoduj linię komórkową HeLa i dwie linie komórkowe chłoniaka z komórek płaszcza zawiesinowego, Granta-519 i Jeko-1, w DMEM zawierającym 10% FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:10 i policzyć za pomocą licznika cząstek14.</li>
	<li>W celu ekstrakcji RNA umieść 500 000 komórek/studzienkę na płytce 6-dołkowej (2 ml pożywki na dołek). Po inkubacji przez 24 godziny należy pobrać RNA z komórek.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Komórki do pobierania 
	UWAGA: Z wyjątkiem etapu wirowania, należy wykonać wszystkie wymienione kroki w okapie do hodowli tkankowych, aby zachować sterylność.
	<ol>
		<li>Dla komórek zawiesinowych (Jeko-1 i Granta-519):
		<ol>
			<li>Przenieść komórki (razem z 2 ml pożywki) do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1,725 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i pozostawić osad komórek na dnie probówki.</li>
			<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 500 μl jednofazowego odczynnika izotiocyjanianu fenolu i guanidyny do każdej próbki w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dobrze wymieszaj i pozostaw w temperaturze pokojowej (RT) na 5 minut, odwracając probówkę mikrowirówki co 1 minutę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dla komórek adherentnych (HeLa):
		<ol>
			<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z każdej studzienki. Dodaj 1 ml PBS do każdej studzienki, aby zmyć zanieczyszczenia.</li>
			<li>Usunąć PBS i dodać 500 μl jednofazowego odczynnika izotiocyjanianu fenolu i guanidyny do każdej studzienki.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, delikatnie kołysząc. Przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liza komórek
	<ol>
		<li>Zamrażać mieszaninę komórek fenolu i izotiocyjanianu guanidyny w temperaturze -20 °C przez 1 h. 
		UWAGA: Mieszankę można pozostawić w temperaturze -20 °C na noc lub do momentu, gdy będzie potrzebna.</li>
		<li>Rozmrozić mieszaninę komórek fenolu i izotiocyjanianu guanidyny na lodzie. Dodać 100 μl chloroformu do probówki mikrowirówkowej w kapturze do PCR. Wirować próbkę przez 10 - 15 s, aż mieszanina stanie się różowa i nieprzezroczysta. Inkubować próbkę na lodzie (w temperaturze 4 °C) przez 15 minut.</li>
		<li>Odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 20 800 x g i temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć górną bezbarwną fazę wodną (~ 200 μl) i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie RNA
	<ol>
		<li>Dodać równą objętość izopropanolu do każdej próbki. Dodaj 1 μl współprecypitentu (patrz tabela materiałów) do każdej próbki, aby działał jako nośnik RNA i pomagał w wizualizacji RNA w kolejnych krokach. Inkubować próbkę w temperaturze -80 °C przez co najmniej 4 godziny. Aby uzyskać najlepsze wyniki, inkubować przez noc w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przenieść próbkę do schłodzonej wirówki. Wirować przez 35 minut w temperaturze 20 800 x g / 4 °C; RNA pojawi się jako niebieska plamka na dnie probówki. Ostrożnie usunąć izopropanol z próbki. Dodaj 500 μl 80% etanolu i ponownie zawieś granulkę, krótko wirując przez 3 s.</li>
		<li>Odwirować próbkę o sile 20 800 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Usunąć cały etanol z próbki. Pozostawić próbkę do wyschnięcia na powietrzu przez około 10 minut. Zawiesić próbkę w 35 μl wody wolnej od RNAse. Umieścić na bloku grzewczym (65 °C) na 5 minut, aby upewnić się, że RNA jest całkowicie w roztworze, a następnie natychmiast umieścić probówkę na lodzie.</li>
		<li>Określić stężenie całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru, jak opisano wcześniej, z wyjątkiem użycia 1,5 μl próbki RNA zamiast 1 μL15. Opcjonalnie uruchom 1 μg całkowitego RNA na 1% żelu agarozowym, aby określić integralność RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Leczenie DNazy
<ol>
	<li>Po kwantyfikacji RNA należy przeprowadzić obróbkę DNAzy na całkowitym RNA, aby zdegradować dowolne genomowe DNA. Do każdej próbki dodać następujące odczynniki z zestawu DNAzy bez RNAzy, aby uzyskać 20 μl całkowitej mieszaniny reakcyjnej w oddzielnej probówce do mikrowirówki:
	<ol>
		<li>Wymieszać 2 μl buforu reakcyjnego DNazy 10X z 4,4 μg całkowitego RNA. Uzupełnić wodą do 14 μl.</li>
		<li>Dodać 2 μl DNA wolnego od RNaz. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w obecności 2 μl inhibitora RNazy (z zestawu do odwrotnej transkrypcji).</li>
		<li>Dodać 2 μl roztworu zatrzymującego i podgrzewać na bloku grzewczym przez 10 minut w temperaturze 70 °C, aby dezaktywować enzym DNAza. 
		UWAGA: Leczenie DNAzy jest opcjonalne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Synteza cDNA
Dla końcowej objętości reakcyjnej 50 μL:
<ol>
	<li>Dla końcowej objętości reakcyjnej 50 μl: Przenieść 22 μl RNA poddanego działaniu DNazy do nowej probówki lub przenieść 4 μg całkowitego RNA z dodatkiem wody do całkowitej objętości 22 μl do nowej probówki. Dodać 2 μl startera T7 oligo dT25 z 10 μM roztworu startera. Sekwencja startera T7 oligo dT25 to 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT</li>
	<li>Z zestawu do odwrotnej transkrypcji dodaj 2 μl inhibitora RNazy (20 U/μL), 8 μL 5x buforu reakcyjnego, 4 μL 10 mM dNTP i 2 μL odwrotnej transkryptazy (200 U/μL). 
	UWAGA: Ustaw reakcję bez odwrotnej transkryptazy, aby działała jako kontrola ujemna.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę. Przenieść bezpośrednio do lodu. Podgrzej probówkę w temperaturze 75 °C przez 5 minut i umieść probówkę na lodzie.</li>
</ol>
5. Podstawowe poszukiwanie transkryptu genu fuzyjnego
<ol>
	<li>Wzór podkładu
	<ol>
		<li>Pobierz sekwencję cDNA z przeglądarki genomu Ensemble (ENST00000360839.6/NM_017747) i zidentyfikuj region w ORF docelowego transkryptu (ANKHD1) przed kodonem stop. Skopiuj i wklej cały region (do 700 nukleotydów) zawierający sekwencje przed kodonem stop do obszaru wprowadzania sekwencji w oprogramowaniu do projektowania starterów (<https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>Wybierz opcję pokaż projekt niestandardowy i wybierz 10 dla liczby starterów, które system powinien wygenerować (wyniki do zwrócenia) i pozostaw wszystkie inne parametry ustawione na domyślne.</li>
		<li>Wybierz pięć starterów do przodu i dwa startery odwrotne, które nie zachodzą na siebie. Uporządkować startery i rozpuść w wodzie wolnej od RNAzy/DNAzy do końcowego stężenia 10 μM. Więcej szczegółów na temat ogólnego projektu startera do PCR znajduje się w innym miejscu16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR w celu identyfikacji potencjalnych starterów do użycia w kolejnych 3' RACE 
	UWAGA: Aby określić końcowe startery do przodu do użycia w reakcji, przetestuj zaprojektowane startery, ustawiając różne kombinacje starterów do przodu i do tyłu dla zwykłego PCR w kapturze PCR.
	<ol>
		<li>Przenieś cDNA (2 μl) do świeżej probówki PCR o pojemności 0,5 ml. Dodać 1 μl startera do przodu i 1 μl startera do tyłu (z 10 mM roztworu startera). Uzupełnić do 12,5 μl, dodając 8,5 μl wody wolnej od nukleaz. Dodać 12,5 μl 2x PCR-to-Gel Master Mix.</li>
		<li>Stosować następujące warunki cykli termicznych PCR: 95 °C przez 2 minuty, a następnie 29 cykli po 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 min. Ustaw ostatni cykl na 68 °C na 7 min.</li>
		<li>Po PCR uruchom produkty na 1% żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny. Szczegóły elektroforezy są opisane wcześniej, z kilkoma modyfikacjami17.
		<ol>
			<li>Rozpuścić 1 g agarozy w 100 ml buforu tris-acetatu (TAE) w kolbie o pojemności 250 ml. Gotować w kuchence mikrofalowej.</li>
			<li>Pozostaw do ostygnięcia na 1 minutę i dodaj 7,5 μl roztworu bromku etydyny (10 mg/ml bulionu) do dygestorium. Dobrze wymieszać, obracając kolbę i wlać do poziomego aparatu żelowego. Pozostawić w temperaturze pokojowej w dygestorium na co najmniej 30 minut, aby żel zastygł.</li>
			<li>Przykryj żel 1x buforem TAE i załaduj 10 μl produktu PCR na żel agarozowy wraz z 3 - 5 μl drabinki masy cząsteczkowej DNA. Praca pod napięciem 175 V przez 10 minut. Wizualizację produktów za pomocą imagera, a jeśli potrzebna jest dalsza separacja produktów, uruchom żel na dodatkowe 5 - 10 minut.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybór zagnieżdżonych podkładów do 3' RACE
	<ol>
		<li>Przeanalizuj wyniki żelu agarozowego PCR, aby wybrać startery, które mają wyraźne, mocne, pojedyncze pasmo PCR. Użyj najbardziej 5'-najbardziej spłonkowego (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') razem ze starterem T7 oligodT25 w pierwszym przebiegu PCR.</li>
		<li>Wybierz zagnieżdżony starter, który znajduje się za pierwszym starterem (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTAATCT-3') i użyj go ze starterem T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') w drugim zestawie reakcji PCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Optymalizacja 3' RACE do mapowania 3' UTR przy użyciu dwóch różnych enzymów
UWAGA: Nastąpił wzrost różnorodności polimeraz DNA używanych do PCR; dlatego chcieliśmy określić standardowe warunki, które mogą być stosowane nawet przy użyciu różnych enzymów w reakcjach 3' RACE PCR. Odwrotne startery dla dowolnego transkryptu są utrzymywane na stałym poziomie; Jedyne zmiany dotyczą zagnieżdżonych starterów do przodu, które są specyficzne dla docelowego transkryptu.
<ol>
	<li>Protokół 1: 3' RACE przy użyciu zmodyfikowanej polimerazy DNA z Pyrococcus furiosus (Pfu)
	<ol>
		<li>Pierwszy PCR
		<ol>
			<li>Przenieś 1 μl cDNA do probówki PCR i dodaj 5 μl 10x buforu reakcyjnego Pfu. Dodać 1 μl pierwszego zagnieżdżonego startera do przodu, 1 μl startera T7 oligodT25 i 1 μl dNTP (z 10 mM roztworu).</li>
			<li>Uzupełnić do 49 μl całkowitej objętości, dodając 40 μl wody. Dodać 1 μl polimerazy DNA Pfu i dobrze wymieszać. Uruchom PCR, używając profilu PCR w Tabeli 1.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Drugi PCR
		<ol>
			<li>Przenieść 2 μl produktów z pierwszego PCR do nowej probówki PCR i wymieszać z 5 μl 10x buforu reakcyjnego PfuUltra II. Dodać 1 μl drugiego zagnieżdżonego startera PCR, 1 μl startera T7 i 1 μl dNTP (10 mM roztworu).</li>
			<li>Uzupełnić do 49 μl całkowitej objętości reakcyjnej, dodając 39 μl wody. Dodać 1 μl polimerazy DNA Pfu. Uruchom PCR przy użyciu tego samego profilu PCR, co pierwsza konfiguracja PCR (Tabela 1).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół 2: 3' RACE przy użyciu chimerycznej polimerazy DNA składającej się z domeny wiążącej DNA połączonej z mieszanką wzorcową polimerazy PCR podobną do Pyrococcus
	<ol>
		<li>Pierwszy PCR
		<ol>
			<li>Przenieś 1 μl cDNA do probówki PCR. Dodać 1 μl pierwszego zagnieżdżonego startera do przodu i 1 μl startera T7 oligodT25. Uzupełnić do 25 μl, dodając 22 μl wody.</li>
			<li>Dodaj 25 μL 2x PCR Master Mix i dobrze wymieszaj. Należy stosować warunki cykliczne PCR opisane w tabeli 2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Drugi PCR
		<ol>
			<li>Przenieś 2 μl produktów z pierwszego PCR do nowej probówki PCR. Dodać 1 μl drugiego zagnieżdżonego startera PCR razem z 1 μl startera odwrotnego T7.</li>
			<li>Uzupełnić do 25 μl, dodając 22 μl wody. Dodaj 25 μL 2X PCR Master Mix. Uruchom PCR przy użyciu tego samego profilu PCR, co pierwsza konfiguracja PCR (Tabela 2).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Sprawdź drugi produkt PCR 3' RACE.
<ol>
	<li>Weź 5 - 10 μl drugiego produktu PCR (a także produkt z pierwszej rundy PCR, jeśli transkrypt jest obficie wyrażony) i uruchom na żelu agarozowym. Ustawić żel i uruchomić elektroforezę zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki od 5.2.3.1 do 5.2.3.3). Wizualizacja wyników na imagerze.</li>
</ol>
8. Oczyszczanie i sekwencjonowanie produktu
<ol>
	<li>Oczyść żelowe produkty PCR z drugiego PCR za pomocą systemu oczyszczania fragmentu DNA w żelu i PCR zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Wykonaj sekwencjonowanie Sangera (alternatywnie wyślij oczyszczone w żelu próbki produktu PCR i odpowiednie startery sekwencjonowania do laboratorium sekwencjonowania). Przeanalizuj dane sekwencjonowania po sekwencjonowaniu Sangera.</li>
	<li>Pobierz oprogramowanie do analizy sekwencji (patrz tabela materiałów) i zaimportuj pliki śledzenia do oprogramowania. Użyj indywidualnych podstawowych wartości QV (wartości jakości) PURE, aby uzyskać informacje o wywołaniu podstawowym18. Pobierz chromatogram z wysokiej jakości śladami do oglądania. 
	Opcjonalnie: Produkt oczyszczony żelem można sklonować za pomocą odpowiedniego zestawu do klonowania, a izolowane klony wysłać do sekwencjonowania metodą Sangera.</li>
</ol>

<ol><li>Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+factors+in+pre-mRNA+3%27-end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li>
<li>Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+end+mRNA+processing%3A+Molecular+mechanisms+and+implications+for+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease.</a> EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).</li>
<li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+atlas+of+polyadenylation+in+five+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals.</a> Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+amplification+of+3%E2%80%B2+cDNA+ends+%283%E2%80%B2-RACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Masamha, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFIm25+regulates+glutaminase+alternative+terminal+exon+definition+to+modulate+miR-23+function%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function.</a> RNA. 22 (6), 830-838 (2016).</li>
<li>Rodu, B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002962915361474">Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within.</a> Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).</li>
<li>Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-483-6:233">PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology</a>. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).</li>
<li>Freeman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+full-length+transcripts+and+transcript+variants+using+5%27+and+3%27+RACE%5BTitle%5D)+AND+%22Lipoproteins+and+Cardiovascular+Disease%3A+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22%5BJournal%5D)">Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE.</a> Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).</li>
<li>Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+CCND1%2FMRCK+gene+fusion+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma.</a> J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).</li>
<li>Parker, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumorigenic+FGFR3-TACC3+gene+fusion+escapes+miR-99a+regulation+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Investig%22%5BJournal%5D)">The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma.</a> J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).</li>
<li>Prakash, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+conjoined+genes%3A+Another+mechanism+for+gene+regulation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes.</a> PLOS ONE. 5 (10), e13284(2010).</li>
<li>Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+complexity+of+gene+fusions+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The emerging complexity of gene fusions in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).</li>
<li>International Committee For Standardization In, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+evaluation+of+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">Protocol for evaluation of automated blood cell counters.</a> Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+primer+specific+filter+metrics+for+the+assessment+of+mitochondrial+DNA+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA%22%5BJournal%5D)">Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data.</a> Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).</li>
<li>Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+better+probes%3A+Effect+of+probe+size%2C+mismatch+position+and+number+on+hybridization+in+DNA+oligonucleotide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays.</a> J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).</li>
<li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li>
<li>Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/365f/f55d5d1ca2c64665cf11eaf1a856dc464a19.pdf">The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency.</a> Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).</li>
<li>Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27896140">Multi-template polymerase chain reaction.</a> Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).</li>
<li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nat Commun. 5, 4846(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomimo pojawienia się masowych technologii sekwencjonowania równoległego, na podstawie genu po genie, 3' RACE nadal pozostaje najłatwiejszą i najbardziej ekonomiczną metodą identyfikacji PAS i nukleotydów sąsiadujących z ogonem poli(A). Opisana tutaj adaptacja rozszerza się przy użyciu 3' RACE zarówno do amplifikacji, jak i mapowania sekwencji, które zawierają część ORF, kodon stop i cały 3' UTR transkryptu mRNA ANKHD1. Główną zaletą 3' RACE jest to, że po kilku drobnych adaptacjach, produkty z 3' RACE mogą być ...

Tworzenie końca 3' jest krytycznym etapem dojrzewania mRNA, który obejmuje rozszczepienie pre-mRNA poniżej PAS, a następnie dodanie ~250 nieszablonowych adenin, które tworzą ogon poli(A)1,2. Białko wiążące poli(A) (PABP) wiąże się z ogonem poli(A), co chroni transkrypt mRNA przed degradacją i ułatwia translację1.
Obecne szacunki sugerują, że 70% ludzkich genów ma wiele PAS, a zatem ulega alternatywnej poliadenylacji, co skutkuje wielokrotnymi końcami 3'3. Dlatego ważne jest, aby określić, gdzie ogon poli(A) przyczepia się do reszty 3' UTR, a także zidentyfikować PAS używany przez dany transkrypt. Pojawienie się sekwencjonowania nowej generacji spowodowało jednoczesną identyfikację 3' UTR i PA tysięcy genów. Ten wzrost możliwości sekwencjonowania wymagał opracowania algorytmów bioinformatycznych do analizy danych obejmujących alternatywną poliadenylację końca 3'. Do wykrywania de novo lub walidacji PAS, a tym samym mapowania końca 3' poszczególnych genów na podstawie danych sekwencjonowania na dużą skalę, metodą z wyboru pozostaje 3' RACE4,5. Sekwencje zawarte w produktach cDNA 3' RACE zwykle obejmują tylko część 3' UTR, która zawiera ogon poli(A), miejsce rozszczepienia, PAS i sekwencje przed PAS. W przeciwieństwie do PCR, który wymaga zaprojektowania i użycia specyficznych dla genu starterów do przodu i do tyłu, 3' RACE wymaga tylko dwóch specyficznych dla genu zagnieżdżonych starterów do przodu. W związku z tym PCR wymaga bardziej szczegółowej wiedzy na temat sekwencji nukleotydowej dużego regionu amplifikowanego genu4,6. Ponieważ 3' RACE wykorzystuje ten sam odwrotny starter, który celuje w ogon poli(A) dla wszystkich poliadenylowanych transkryptów RNA, tylko startery do przodu muszą być specyficzne dla genu, co wymaga jedynie wiedzy o znacznie mniejszym regionie mRNA. Umożliwia to amplifikację regionów, których sekwencje nie są w pełni scharakteryzowane4,7. Pozwoliło to na wykorzystanie 3' RACE nie tylko do określenia końca 3' genu, ale także do określenia i scharakteryzowania dużych regionów przed PAS, które stanowią znaczną część 3' UTR. Łącząc 5' RACE ze zmodyfikowanym 3' RACE, który zawiera większe części 3' UTR i regiony flankujące, możliwe jest pełne zsekwencjonowanie lub sklonowanie całego transkryptu mRNA od końca 5' do końca 3' 8.
Przykładem tego zastosowania zmodyfikowanego 3' RACE jest niedawna identyfikacja nowego transkryptu genu fuzji CCND1-MRCK z linii komórkowych chłoniaka z komórek płaszcza i pacjentów z rakiem. 3' UTR składał się z sekwencji zarówno z genów CCND1, jak i MRCK i był odporny na regulację miRNA9. Dwa zagnieżdżone startery skierowane do przodu specyficzne dla CCND1 były komplementarne z obszarem bezpośrednio przylegającym i poniżej kodonu stop CCND1. Chociaż sekwencjonowanie całego transkryptomu wraz ze specyficznymi narzędziami bioinformatycznymi może być wykorzystane do wykrywania fuzji genów w obrębie klasy 3' UTR<sup="xref">10, wielu laboratoriom może brakować środków finansowych lub wiedzy bioinformatycznej, aby skorzystać z tej technologii. W związku z tym 3' RACE stanowi alternatywę dla identyfikacji de novo i walidacji nowych genów fuzyjnych z udziałem 3' UTR. Biorąc pod uwagę drastyczny wzrost liczby zgłoszonych genów fuzyjnych, a także odczytanych transkryptów, 3' RACE stał się potężnym narzędziem do charakteryzowania sekwencji genów11,12. Ponadto ostatnie badania wykazały, że różne sekwencje w obrębie 3' UTR, jak również długość 3' UTR, mogą wpływać na stabilność transkryptu mRNA, lokalizację, translatywalność i funkcję13. Częściowo ze względu na zwiększone zainteresowanie mapowaniem transkryptomu, nastąpił wzrost liczby różnych polimeraz DNA opracowywanych do użytku w laboratorium. Ważne jest, aby określić, jakie rodzaje modyfikacji można wprowadzić do protokołu 3' RACE, aby wykorzystać dostępny repertuar polimeraz DNA.
Ta praca informuje o adaptacji 3' RACE do mapowania całego 3' UTR, PAS i miejsca cięcia końca 3' transkryptu ANKHD1 za pomocą zagnieżdżonych starterów w sekcji ANKHD1 transkryptu i dwóch różnych polimeraz DNA.

<table><tbody><tr><td>Komórki HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Linia komórkowa raka szyjki macicy.</td></tr><tr><td>Komórki Jeko-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Linia komórkowa chłoniaka z komórek płaszcza.</td></tr><tr><td>Granta-519 komórki</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>Linia komórkowa chłoniaka z komórek płaszcza.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Płodowa surowica bydlęca do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>Antybiotyk i środek przeciwgrzybiczy.</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>Coprecipitant.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>pożywka do hodowli komórkowych marki Gibco z GlutaMAX.</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion Woda wolna od DNazy i RNAzy (bez obróbki DEPC).</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Roztwór buforowany fosforanami</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma&nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Alkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td>Etanol</td></tr><tr><td>Etydyna Roztwór bromku</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Monofazowy odczynnik izotiocyjanianu fenolu i guanidyny.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&nbsp; zawierający barwnik obciążający stosowany w rutynowych szybkich testach PCR i poszukiwaniu starterów.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr>RQ1 <td>Zestaw do leczenia dnazy</td> <td>bez RNaz</td><td>Promega</td><td>M6101</td>.</tr><tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix zawierający chimeryczną polimerazę DNA składającą się z domeny wiążącej DNA połączonej z polimerazą korekcyjną podobną do Pyrococcus i innymi odczynnikami.</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA PfuUltra II Fusion HS</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>Zmodyfikowana polimeraza DNA z Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji RevertAid RT</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>Służy do&nbsp; odwrotnej transkrypcji mRNA na&nbsp; syntezę cDNA. Zestaw zawiera&nbsp; Inhibitor RNAzy rybolocku, odwrotna transkryptaza M-MuLV RevertAid i inne odczynniki wymienione w manuskrypcie.</td></tr><tr><td>Idealna drabinka o rozmiarze 1Kb</td><td>5 Prime</td><td>2500360</td><td>Drabinka DNA o masie cząsteczkowej.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Służy do wizualizacji żelu agarozowego barwionego bromkiem etydyny.</td></tr><tr><td>Drabina o niskiej masie cząsteczkowej</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>Drabinka DNA o masie cząsteczkowej.</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>Sucha kąpiel</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spektrofotometr.</td></tr><tr><td>Szeroki Mini-Sub&nbsp; System elektroforezy poziomej Cell GT</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>Sprzęt do elektroforezy - aparatura do konfiguracji żelu</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Zasilacz BioRad</td><td>1645050</td><td>do elektroforezy żelowej.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>termocykler PCR.</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Żel i system oczyszczania fragmentów DNA PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Klonowanie Kit, z One Shot&nbsp; TOP10 Chemicznie kompetentnych komórek E. coli</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>Stacja przygotowania MyPCR Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>Kaptur dedykowany do pracy PCR.</td></tr><tr><td>Dygestoria Hamilton SafeAire II</td><td>ThermoFisherNaukowy</td><td></td><td>dygestorium.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Z1&nbsp; Cząstka&nbsp; Licznik</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>Licznik cząstek. Do liczenia komórek przed poszyciem&nbsp; do ekstrakcji RNA.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Applied Biosystems Sequence Scanner v2.0</td><td>Applied Biosystems (przez ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych sekwencjonowania Sangera.</td></tr></tbody></table>

adaptacja 3'szybkiej amplifikacji końców cdna do mapowania transkryptów w raku

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Dojrzewanie eukariotycznych mRNA obejmuje tworzenie końca 3', co wiąże się z dodaniem ogona poli(A). W celu zmapowania końca 3' genu, tradycyjną metodą z wyboru jest szybka amplifikacja 3' końców cDNA (3' RACE). Protokoły dla 3' RACE wymagają starannego zaprojektowania i selekcji zagnieżdżonych starterów w nieulegającym translacji regionie 3' (3' UTR) docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak po kilku modyfikacjach protokół może być używany do uwzględnienia całego 3' UTR i sekwencji w otwartej ramce odczytu (ORF), zapewniając bardziej wszechstronny obraz relacji między ORF a 3' UTR. Jest to dodatek do identyfikacji sygnału poliadenylacji (PAS), a także miejsca rozszczepienia i poliadenylacji zapewnianego przez konwencjonalny 3' RACE. Rozszerzony 3' RACE może wykrywać nietypowe 3'UTR, w tym fuzje genów w obrębie 3' UTR, a informacje o sekwencji można wykorzystać do przewidywania potencjalnych miejsc wiązania miRNA, a także bogatych w AU elementów destabilizujących, które mogą wpływać na stabilność transkryptu.

Wyszukiwanie zagnieżdżonego prawego primera:
Żel agarozy z Rysunku 1 przedstawia dwa odrębne produkty PCR w żelu (ścieżki 1 i 2), w których zastosowano ten sam primer prawy, ale różne primery lewe. Ścieżka 3 zawiera odrębny produkt PCR i posiada specyficzne primery prawy i lewy. Idealnymi primerami do reakcji PCR są te, które dają jeden wyraźny produkt PCR (ścieżka 3). Primer prawy uży...

Dwa różne protokoły szybkiej amplifikacji końców cDNA (3' RACE) opisane tutaj wykorzystują dwie różne polimerazy DNA do mapowania sekwencji, które zawierają segment otwartej ramki odczytu (ORF), kodon stop i cały 3' UTR transkryptu za pomocą RNA uzyskanego z różnych linii komórek nowotworowych.

Adaptacja 3'szybkiej amplifikacji końców CDNA do mapowania transkryptów w raku

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie sekwencji transkryptów mRNA od końca trójkrotnego do regionów w regionie kodującym białko przy użyciu zagnieżdżonych starterów specyficznych dla transkryptu w dwóch kolejnych PCR i sekwencjonowaniu oczyszczonych produktów PCR. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki, takie jak określenie sygnału poliadenylacji, kodonu stop i sekwencji nieulegającego translacji regionu trzech liczb pierwszych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować do dowolnego transkryptu, jeśli sekwencja małego obszaru otwartej ramki odczytu jest Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy raka, ponieważ może wykrywać specyficzne dla nowotworu geny fuzyjne i warianty splicingu.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zidentyfikowaliśmy nowe transkrypty z wcześniej niescharakteryzowanymi, trójelementowymi nieulegającymi translacji regionami. Aby rozpocząć protokół, rozmrozić mieszaninę komórek izotiocyjanianu fenolu i guanidyny na lodzie. Po rozmrożeniu dodaj 100 mikrolitrów chloroformu do probówki mikrowirówki w kapturze do PCR.Wirować próbkę przez 10 do 15 sekund, aż mieszanina stanie się różowa i nieprzezroczysta. Następnie inkubować próbkę na lodzie przez 15 minut. Po inkubacji odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 20, 800 g i czterech stopniach Celsjusza.Ostrożnie usuń górną bezbarwną fazę wodną i przenieś ją do nowej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. Następnie przejdź do wytrącania i dodaj równą objętość izopropanolu do próbki. Dodaj jeden mikrolitr współprecypitentu do próbki, aby działał jako nośnik dla RNA i pomagał w wizualizacji RNA w kolejnych krokach.Próbki należy inkubować w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny. Po inkubacji przenieść próbkę do schłodzonej wirówki i wirować przez 35 minut w temperaturze 20, 800 g i czterech stopniach Celsjusza. Po wirowaniu RNA pojawi się jako niebieska specyfikacja na dnie probówki.Ostrożnie usunąć izopropanol z próbki. Dodaj 500 mikrolitrów 80% etanolu i ponownie zawieś granulkę, krótko wirując przez trzy sekundy. Ponownie odwirować próbkę.Usunąć cały etanol z próbki i pozostawić próbkę do wyschnięcia na powietrzu przez około 10 minut. Po wyschnięciu próbki należy ją ponownie zawiesić w 35 mikrolitrach wody wolnej od RNaz. Następnie umieść próbkę na bloku grzewczym.Ustaw na 65 stopni Celsjusza na pięć minut, aby upewnić się, że RNA jest w pełni w roztworze. Po podgrzaniu natychmiast umieść rurkę na lodzie. Aby uzyskać końcową objętość reakcji 50 mikrolitrów, dodaj cztery mikrogramy całkowitego RNA z dodatkiem wody do całkowitej objętości 22 mikrolitrów do nowej probówki.Dodać dwa mikrolitry startera Oligo dT 25 z 10-mikromolowego roztworu startera. Z zestawu do odwrotnej transkrypcji dodaj dwa mikrolitry inhibitora RNazy, osiem mikrolitrów 5-krotnego buforu reakcyjnego, cztery mikrolitry 10-milimolowych dNTP i dwa mikrolitry odwrotnej transkryptazy. Ustaw reakcję bez odwrotnej transkryptazy, aby działała jako kontrola ujemna.Inkubuj probówkę w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji przenieś rurkę bezpośrednio do lodu przed przetransportowaniem jej do bloku grzewczego. Następnie podgrzej rurkę w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez pięć minut.Po podgrzaniu do 75 stopni Celsjusza umieść rurkę na lodzie. Przenieś dwa mikrolitry cDNA do świeżej 0,5 mililitrowej probówki do PCR. Dodaj jeden mikrolitr startera do przodu i jeden mikrolitr startera wstecznego z 10-milimolowego roztworu startera.Uzupełnić do 12,5 mikrolitra, dodając 8,5 mikrolitra wody bez nukleaz i dodać 12,5 mikrolitra 2x PCR do głównej mieszanki żelowej. Następnie wprowadź warunki cykli termicznych PCR wymienione na ekranie i uruchom PCR. Po PCR przygotuj 1% żel agarozowy barwiony bromkiem etydyny.Rozpuścić jeden gram agarozy w 100 mililitrach trioctanu lub buforu TAE w kolbie o pojemności 250 mililitrów. Zagotuj zawartość w kuchence mikrofalowej. Pozostaw żel do ostygnięcia na minutę i dodaj 7,5 mikrolitra roztworu bromku etydyny do dygestorium.Dobrze wymieszać, obracając kolbą. Wlać zawartość do poziomego aparatu żelowego i pozostawić żel do zestalenia się w temperaturze pokojowej w dygestorium przez co najmniej 30 minut. Przykryj żel 1x buforem TAE i załaduj 10 mikrolitrów produktu PCR na żel agarozowy wraz z trzema do pięciu mikrolitrami drabinki masy cząsteczkowej DNA.Uruchom żel pod napięciem 175 V przez 10 minut. W przypadku pierwszego PCR przenieś jeden mikrolitr cDNA do probówki PCR i dodaj pięć mikrolitrów 10x buforu reakcyjnego Pfu. Dodaj jeden mikrolitr pierwszego zagnieżdżonego startera do przodu, jeden mikrolitr startera T7 Oligo dT 25 i jeden mikrolitr dNTP z 10-milimolowego roztworu.Uzupełnić do 49 mikrolitrów całkowitej objętości, dodając 40 mikrolitrów wody. Dodaj jeden mikrolitr polimerazy DNA Pfu i dobrze wymieszaj. Następnie uruchom PCR.Następnie przygotuj drugi PCR. Przenieś dwa mikrolitry produktów z pierwszego PCR do nowej probówki PCR i wymieszaj je z pięcioma mikrolitrami 10x buforu reakcyjnego Pfu ultra dwa. Dodaj jeden mikrolitr drugiego zagnieżdżonego startera PCR, jeden mikrolitr startera T7 i jeden mikrolitr dNTP.Uzupełnić do 49 mikrolitrów całkowitej objętości reakcji, dodając 39 mikrolitrów wody i dodając jeden mikrolitr polimerazy DNA Pfu. Uruchom PCR przy użyciu tego samego profilu PCR, co pierwsza konfiguracja PCR. Alternatywnie, zamiast używać polimerazy DNA Pfu, chimeryczna polimeraza DNA może być użyta w dwóch różnych PCR.Weź od pięciu do dziesięciu mikrolitrów drugiego produktu PCR i uruchom go na żelu agarozowym. Na koniec zwizualizuj wynik na imagerze. Ten żel agarozowy przedstawia dwa odrębne produkty PCR, które wykorzystują ten sam starter do przodu, ale różne startery odwrotne oraz odrębny produkt PCR, który ma wyraźny starter do przodu i do tyłu.Idealnymi starterami do użycia w reakcji opartej na PCR są te, które dają jeden odrębny produkt PCR. Produkty z drugiej reakcji PCR z polimerazą DNA Pfu i chimeryczną polimerazą DNA dały produkty PCR tej samej wielkości, pomimo różnych warunków cyklu PCR dla trzech głównych RACE. Kontrole ujemne odwrotnej transkryptazy nie wykazały zanieczyszczenia genomowego RNA wykorzystywanego w syntezie cDNA, a także w późniejszych reakcjach.Oczyszczone żelem produkty PCR zostały wysłane do sekwencjonowania. Reprezentatywna sekwencja Sangera z chromatogramu sekwencyjnego zidentyfikowała położenie kodonu stop, przypuszczalnego sygnału poliadenylacji oraz miejsca, a także ogona poli A w trójelementowym produkcie RACE. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby przez cały czas nosić odzież ochronną i rękawice.Ponadto należy używać sterylnych DNaz i RNaz do probówek z odczynnikami i innych materiałów jednorazowego użytku. Nie zapominaj, że praca z fenolem i chloroformem może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie odczynników w okapie i wyrzucanie materiału do wyznaczonego pojemnika na odpady.

adapting-3-rapid-amplification-cdna-ends-to-map-transcripts

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

ATAC-seq to metoda sekwencjonowania DNA, która wykorzystuje nadpobudliwą zmutowaną transpozazę, Tn5, do mapowania zmian w dostępności chromatyny, w których pośredniczą czynniki transkrypcyjne. ATAC-seq umożliwia odkrycie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zmian fenotypowych w komórkach nowotworowych. Protokół ten określa procedury optymalizacyjne dla sekwencji ATAC w typach komórek nabłonkowych, w tym komórkach nowotworowych.

Optymalizacja ATAC-Seq do badań epigenetycznych nowotworów

Tutaj prezentowany jest protokół, w którym wiele narzędzi bioinformatycznych jest połączonych w celu zbadania biologicznych funkcji TMEM200A w raku. Ponadto eksperymentalnie weryfikujemy również przewidywania bioinformatyczne.

Analiza multiomiczna TMEM200A jako biomarkera raka

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Poznaj metodę 3' RACE do mapowania transkryptów mRNA w liniach komórkowych raka. Technika ta umożliwia identyfikację ramy odczytu, kodonu stop i regionu 3' UTR, wspierając badania nad genetyką nowotworów.

Adaptacja 3'szybkiej amplifikacji końców CDNA do mapowania transkryptów w raku

Przeglądaj więcej filmów