Name: Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Poznaj technikę wieloelektrodowych zapisów z ludzkiej tkanki korowej pooperacyjnej u pacjentów z epilepsją lekooporną. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów inicjacji i propagacji napadów oraz wpływu leków przeciwpadaczkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty od ANR (Programme Blanc Neurosciences), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), City of Paris (Programme Emergence), INSERM i La Pitié Salpêtrière Hospital (kontrakt na badania translacyjne) dla N.R., od Neuropôle de Recherche Francilien (NeRF) dla E.D., z Université Pierre et Marie Curie UPMC (Konwergencja Programów) oraz z Institut du Cerveau et e la Moelle epiniere (Paryż) do G.H.

UWAGA: Opisany tutaj protokół jest zgodny z wytycznymi francuskiego "Comité Consultatif National d'Ethique" i jest deklarowany przez INSERM jako działalność windykacyjna.
1. Resekcja ludzkiej tkanki padaczkowej
<ol>
	<li>Pacjentów
	<ol>
		<li>Pozyskaj tkankę mózgową od pacjentów cierpiących na nieuleczalną padaczkę. Uzyskaj pisemną świadomą zgodę przed zabiegiem.</li>
		<li>U wszystkich operowanych pacjentów z padaczką należy przeprowadzić obszerne badanie przedoperacyjne, w tym badanie neurologiczne, ocenę neuropsychologiczną, EEG powierzchniowe i neuroobrazowanie (MRI, a czasem 18FDG-PET; Ryc. 1A), a następnie pooperacyjne badanie histologiczne wyciętej tkanki (ryc. 1B). UWAGA: Operacja jest wskazana, gdy różnorodne eksploracje lokalizują podobnie strefę początku napadu i gdy korzyści z jej usunięcia przewyższają ryzyko chirurgiczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>chirurgia
	<ol>
		<li>Utrzymuj leki przeciwpadaczkowe przed operacją. Wykonać zabieg chirurgiczny w znieczuleniu ogólnym: indukcję wziewnym sewofluranem (6% dostarczony stosunek i 100% wdychana frakcjaO2), dożylnie sufentanyl (0,3 μg/kg) i antrakurium (0,5 mg/kg), a następnie leczenie podtrzymujące sufentanylem dożylnym (0,5 μg/kg/godz.) i wziewnym sewofluranem (1 MAC).</li>
		<li>Użyj systemu neuronawigacji, aby umożliwić precyzyjną lokalizację uszkodzonej kory mózgowej (ryc. 1C). Po nacięciu skóry wykonaj otwór w kości, a następnie kraniotomię za pomocą wiertła o wysokim rozlaniu. Delikatnie podnieś płat kostny i otwórz oponę twardą nożyczkami (ryc. 1D).</li>
		<li>Użyj śródoperacyjnych ultradźwięków, aby ułatwić identyfikację nieprawidłowej kory oraz narzędzi mikrochirurgicznych i aspiratora ultradźwiękowego pod mikroskopem operacyjnym.</li>
		<li>Koagulować i ciąć płaszczyznę pajęczynówkowo-pajęczynówkową zgodnie z granicami bruzdy. Użyj rozwarstwienia podskórnego, aby uwolnić korę z pia wokół obszaru uszkodzonego.</li>
		<li>Przeciąć istotę białą pod nieprawidłową korą, aby wykonać jednoczęściową resekcję "en bloc", oszczędzając jak najwięcej naczyń krwionośnych. Unikaj traumatycznych manipulacji korą mózgową.</li>
		<li>Wytnij plasterek o grubości 1 cm z wyciętej tkanki wzdłuż kierunku prostopadłego do powierzchni pial, w tym dna bruzdy i kory przejściowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) do przygotowania plastrów, inkubacji i zapisu
<ol>
	<li>ACSF do przygotowania plastrów
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l ACSF7,8 na bazie sacharozy, zawierającego (w mM): 250 sacharozy, 3 KCl, 25 NaHCO3, 10 D-glukozy, 1 CaCl2, 10 MgCl2; rozpuścić te sole w wodzie dejonizowanej i natleniać roztwór karbogenem przez co najmniej 10 minut.</li>
		<li>Umieścić ~700 ml sacharozy ACSF w temperaturze -80 °C przez 50-60 min (lub -150 °C przez 15-20 min). Pozostałą część roztworu należy przechowywać pod natlenieniem w lodzie. UWAGA: ACSF do przygotowania plastrów można przechowywać w temperaturze 4 °C; w takim przypadku dodać CaCl2 i MgCl2 w dniu eksperymentu, przed schłodzeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ACSF do inkubacji i rejestracji plastrów
	<ol>
		<li>Przygotować co najmniej 3 litry zapisu ACSF7,8, zawierającego (w mM): 124 NaCl, 3 KCl, 26 NaHCO3, 10 D-glukozy, 1,6 CaCl2, 1,3 MgCl2; rozpuścić te sole w wodzie dejonizowanej i natlenić roztwór karbogenem. Przed dodaniem MgCl2 zachowaj trochę ACSF, aby wykonać nagrania w 0 Mg2+ ACSF. UWAGA: Inkubacyjny/rejestrujący ACSF może być przechowywany w temperaturze 4 °C; w takim przypadku dodać CaCl2 i MgCl2 w dniu eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sprzęt do inkubacji i nagrywania Slice
<ol>
	<li>Komora interfejsu do inkubacji plastrów
	<ol>
		<li>Użyj komory na plasterki mózgu, aby utrzymać żywe plastry ex vivo w trybie interfejsu. UWAGA: Komora składa się z dolnej części, w której znajdują się elementy grzewcze i czujnikowe oraz ceramiczny bełkotka i jest wypełniona wodą destylowaną, oraz górnej części, w której plastry spoczywają na arkuszu tkanki soczewki w płaskiej przestrzeni pośrodku komory (rysunek 2A-B).</li>
		<li>Użyj dwóch oddzielnych drobnych rurek PTFE, przez które wstępnie natleniony ACSF dostaje się do komory. UWAGA: Rurki zwijają się spiralnie w podgrzanej wodzie i docierają do górnej części komory; Następnie roztwór wydostaje się za pomocą działania kapilarnego z tkanką soczewki, która przenosi roztwór do studzienek wyjściowych.</li>
		<li>Podłączyć rurki PTFE komory interfejsu do pompy perystaltycznej, aby umożliwić ciągłą perfuzję plastrów ze wstępnie natlenionym medium.</li>
		<li>Utrzymuj wysokie napięcie tlenu poprzez natlenianie karbogenem (95%O2 i 5% CO2) przez ceramiczny bełkot. UWAGA: Ta podgrzana i zwilżona mieszanina gazów dociera do plastrów w górnej części komory przez odpowiednie otwory.</li>
		<li>Utrzymuj temperaturę w górnej części komory, podłączając komorę do regulatora temperatury, za pomocą specjalnego dwustronnego, posiadającego złącze dla elementu grzejnego komory i zewnętrzny czujnik temperatury na jednym końcu. Umieść czujnik w pobliżu plastrów, aby sprawdzić temperaturę podczas inkubacji (Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisy z matrycą wieloelektrodową
	<ol>
		<li>Należy stosować płaskie układy wieloelektrodowe ze 120 elektrodami z azotku tytanu (średnica 30 μm) izolowanymi azotkiem krzemu i wewnętrzną elektrodą odniesienia, ułożonymi w matrycy 12 x 12 z odstępami od środka do środka 200 μm. UWAGA: Możliwe są inne konfiguracje o różnej średnicy i rozstawie elektrod. W szczególności chip MEA można poszerzyć w celu pobierania próbek z większych warstw tkanek ludzkich.</li>
		<li>Odbieranie sygnałów elektrycznych przy częstotliwości 10 kHz za pomocą systemu MEA2100-120 (wzmacniacz wstępny i filtrujący ze zintegrowaną akwizycją danych i przetwornikiem analogowo-cyfrowym, 16-bitowa rozdzielczość danych, zakres napięcia wejściowego i szerokość pasma regulowane za pomocą oprogramowania) za pomocą dedykowanego oprogramowania (MC_Rack). UWAGA: Scena główna MEA2100 jest wyposażona w metalową płytkę do mocowania podgrzewanego elementu perfuzyjnego za pomocą uchwytów magnetycznych, aby w sposób ciągły perfekować plastry przez całą sesję nagraniową.</li>
		<li>Przytrzymaj tkankę na MEA za pomocą małej domowej roboty platynowej kotwicy, która zapewnia dobre sprzężenie elektryczne między plastrem a elektrodami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie komory interfejsu i narzędzi do rozcinania i krojenia
<ol>
	<li>Komora interfejsu
	<ol>
		<li>Napełnij dolną część komory interfejsu wodą destylowaną. Upewnij się, że poziom wody całkowicie zanurza element grzejny i znajduje się od 2 do 4 mm poniżej połączenia między dolną i górną częścią komory. Sprawdzaj ten poziom codziennie przed włączeniem ogrzewania, aby uniknąć uszkodzenia elementu grzejnego.</li>
		<li>Podłącz komorę do źródła karbogenu, wyposażonego w wtórny regulator przepływu do precyzyjnej regulacji ciśnienia gazu.</li>
		<li>Wytnij arkusz tkanki soczewki, aby dopasować się do płaskiej powierzchni komory plastra i umieść go blisko probówek z roztworem wejściowym, aby każdy pęcherzyk mógł uciec z linii wejściowej przed dotarciem do plasterków.</li>
		<li>Wytnij dwa kawałki nici bawełnianej o długości tak długiej, jak kawałek tkanki soczewki i umieść je wzdłuż głównych boków płaskiej powierzchni komory. UWAGA: Pomaga to nieznacznie podnieść poziom roztworu perfuzyjnego w komorze.</li>
		<li>Ustawić natężenie przepływu pompy perystaltycznej na 1 ml/min i aktywować pompę.</li>
		<li>Rozpocznij natlenianie wody w dolnej części komory.</li>
		<li>Ustaw temperaturę regulatora temperatury na 37 °C i włącz go. Przykryj górną część komory interfejsu kawałkiem parafilmu i odczekaj co najmniej 30 minut, aż temperatura wzrośnie i ustabilizuje się.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Narzędzia do rozwarstwiania i krojenia
	<ol>
		<li>Przygotuj zestaw preparacyjny składający się z dwóch cienkich kleszczy, szpatułki, małej łyżki i ostrza; dwóch szklanych szalek Petriego, dwóch szczotek oraz kleju cyjanoakrylowego.</li>
		<li>Ustaw parametry wibratomu: grubość, 400 μm; częstotliwość, 70 - 90 Hz; amplituda, 0,9 - 1 mm, prędkość: 0,1 mm/sek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie ludzkiego plastra kory mózgowej
<ol>
	<li>Wyjąć ACSF na bazie sacharozy z zamrażarki w temperaturze -80 °C i wymieszać w celu uzyskania pewnego rodzaju błota pośniegowego. Natlenić go karbogenem, umieścić ~250 ml w szklanej butelce i przechowywać w butelce Dewara wypełnionej lodem, udając się do sali operacyjnej szpitala po tkankę. W międzyczasie utrzymuj resztę w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Podczas operacji neurochirurg wycina niewielki blok tkanki korowej. Natychmiast umieścić próbkę w lodowatej sacharozie ACSF w celu przeniesienia do laboratorium.</li>
	<li>Czas potrzebny na transfer ze szpitala do laboratorium należy ograniczyć do maksymalnie 30 minut. W laboratorium wyjmij natleniony ACSF na bazie sacharozy z zamrażarki o temperaturze -20 °C, wymieszaj go do uzyskania błota pośniegowego, napełnij szalkę Petriego i tackę buforową wibratomu i rozpocznij natlenianie obu karbogenów. Ostrożnie wyjmij kawałek ludzkiej tkanki z butelki łyżką i włóż go na szalkę Petriego (ryc. 2D).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń skrzepy krwi, naczynia i opony mózgowe, aby uniknąć oporu podczas krojenia. Usuń opony mózgowe, składające się z pia-matter, zaczynając od boków bloku tkankowego, uważając, aby nie uszkodzić powierzchni korowej. Za pomocą ostrza odetnij bok tkanki, aby uzyskać płaską powierzchnię, która zostanie przyklejona do płytki próbki wibratomu. UWAGA: Opony mózgowe, składające się z materii pia, usuwa się zaczynając od boków bloku tkankowego, zwracając uwagę, aby nie uszkodzić powierzchni kory mózgowej.</li>
	<li>Jeśli blok tkanki jest większy niż komora MEA, przed przyklejeniem go do płytki próbki należy wyciąć kawałek o odpowiednich wymiarach (ryc. 2E).</li>
	<li>Przyklej tkankę, aby uzyskać poprzeczne plastry kory mózgowej, włóż ją do tacki buforowej i pokrój plastry o grubości 400 μm z niską prędkością (0,1 mm/s) (ryc. 2F).</li>
	<li>Wyciąć kawałki tkanki soczewki o wymiarach plasterka; za pomocą szpatułki i pędzla przenieść plastry na te tkanki soczewki i inkubować je w komorze fazowej w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem nagrań (Rysunek 2G-I). Ciągle przechowuj plastry w tych samych warunkach aż do użycia. UWAGA: Umieszczanie plasterków na papierze do soczewek jest ważnym krokiem ułatwiającym zarówno perfuzję dolnej strony plastrów, jak i wyjmowanie plasterków z komory interfejsu przed nagraniem.
	<ol>
		<li>Podczas przenoszenia plastrów na tkankę soczewki należy obchodzić się z nimi bardzo ostrożnie, unikając dotykania szczoteczką obszaru warstwy korowej.</li>
		<li>Przygotuj plastry pojedynczo i natychmiast przenieś każdy z nich do komory interfejsu, aby zapewnić odpowiedni dopływ tlenu i temperaturę; pokrój blok wyciętej tkanki tak szybko, jak to możliwe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przygotowanie konfiguracji MEA do nagrań
<ol>
	<li>Podłącz system perfuzyjny do pompy perystaltycznej, a system MEA do komputera. Natlenić ACSF nagrania. Umieść pusty chip MEA wewnątrz amplifier.</li>
	<li>Ustaw regulator temperatury elementu kaniuli tak, aby osiągnął 37 °C w komorze MEA i rozpocznij perfuzję z prędkością 5-6 ml/min. UWAGA: Zwykle konieczne jest ustawienie temperatury o 3-4 °C wyższej niż żądana, w zależności od temperatury w pomieszczeniu i natężenia przepływu.
	<ol>
		<li>Sprawdź temperaturę w komorze MEA za pomocą dokładnego termometru, umieszczając go jak najbliżej środka, nie dotykając obszaru elektrody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do nagrywania i sprawdź, czy wszystkie elektrody MEA są dobrze połączone i czy nie ma szumów spowodowanych perfuzją.</li>
	<li>Rozpocznij MEA_Monitor, aby sprawdzić działanie stołu kamery.</li>
</ol>
7. Transfer wycinka z komory interfejsu do chipa MEA w celu nagrania
<ol>
	<li>Wlej trochę podgrzanego ACSF do szklanej szalki Petriego; za pomocą kleszczy weź plasterek z komory interfejsu, chwytając go przez tkankę soczewki i włóż do szalki Petriego. Ostrożnie oderwij plasterek od tkanki. Jeśli poziom roztworu w komorze interfejsu zostanie starannie dostosowany w czasie inkubacji, plasterek oderwie się od tkanki soczewki tylko poprzez zanurzenie go w roztworze; W przeciwnym razie użyj małej szczotki, aby ułatwić oderwanie.</li>
	<li>Napełnij chips MEA odrobiną ACSF i za pomocą szpatułki przenieś do niego plasterek. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura delikatnie usuń roztwór, aby plasterek przylegał do obszaru elektrody i przytrzymaj go na miejscu za pomocą platynowej kotwicy. Dodać 1 ml ACSF do nagrywania, umieścić chip MEA w amplifier i rozpocząć perfuzję z prędkością 5-6 ml/min (rysunek 2J-L).</li>
	<li>Sprawdź pozycję wycinka w obszarze nagrywania MEA za pomocą MEA_Monitor, dostosuj ją w razie potrzeby, aby nagrywać z warstw korowych i zrobić zdjęcie. Rozpocznij nagrywanie.</li>
</ol>

<ol><li>Huberfeld, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+pre-ictal+discharges+emerge+at+the+transition+to+seizure+in+human+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy.</a> Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).</li>
<li>Kwan, P., Brodie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+identification+of+refractory+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early identification of refractory epilepsy.</a> New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).</li>
<li>Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longterm+stability+and+developmental+changes+in+spontaneous+network+burst+firing+patterns+in+dissociated+rat+cerebral+cortex+cell+cultures+on+multielectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Longterm stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multielectrode arrays.</a> Neuroscience Letters. 361 (1-3), 86-89 (2004).</li>
<li>Sun, J. -J., Luhmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+dynamics+of+oscillatory+network+activity+in+the+neonatal+mouse+cerebral+cortex%3A+Network+oscillations+in+neonatal+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal dynamics of oscillatory network activity in the neonatal mouse cerebral cortex: Network oscillations in neonatal cerebral cortex.</a> European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1995-2004 (2007).</li>
<li>Dossi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Regeneration+of+the+ex-vivo+Reconstructed+Mesocorticolimbic+Dopaminergic+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Functional Regeneration of the ex-vivo Reconstructed Mesocorticolimbic Dopaminergic System.</a> Cerebral cortex. 23 (12), New York, N.Y. 2905-2922 (1991).</li>
<li>Darbon, P., Scicluna, L., Tscherter, A., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+bursting+activity+induced+by+disinhibition+in+spinal+cord+networks%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling bursting activity induced by disinhibition in spinal cord networks.</a> The European journal of neuroscience. 15 (4), 671-683 (2002).</li>
<li>Cohen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Origin+of+Interictal+Activity+in+Human+Temporal+Lobe+Epilepsy+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the Origin of Interictal Activity in Human Temporal Lobe Epilepsy in Vitro.</a> Science. 298 (5597), 1418-1421 (1126).</li>
<li>Huberfeld, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbed+chloride+homeostasis+and+GABAergic+signaling+in+human+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Perturbed chloride homeostasis and GABAergic signaling in human temporal lobe epilepsy.</a> The Journal of neuroscience. 27 (37), 9866-9873 (2007).</li>
<li>Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Approach+for+Reliably+Investigating+Hippocampal+Sharp+Wave-Ripples+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An Approach for Reliably Investigating Hippocampal Sharp Wave-Ripples In Vitro.</a> PLoS ONE. 4 (9), (2009).</li>
<li>Hájos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices%3A+importance+of+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).</li>
<li>Wittner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epileptic+human+hippocampal+cornu+ammonis+2+region+generates+spontaneous+interictal-like+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The epileptic human hippocampal cornu ammonis 2 region generates spontaneous interictal-like activity in vitro.</a> Brain. 132 (11), 3032-3046 (2009).</li>
<li>Dzhala, V., Valeeva, G., Glykys, J., Khazipov, R., Staley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+alterations+in+GABA+signaling+disrupt+hippocampal+network+activity+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Traumatic alterations in GABA signaling disrupt hippocampal network activity in the developing brain.</a> The Journal of neuroscience. 32 (12), 4017-4031 (2012).</li>
<li>Menendezdela de la Prida, L., Huberfeld, G., Cohen, I., Miles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+Behavior+in+the+Initiation+of+Hippocampal+Population+Bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Threshold Behavior in the Initiation of Hippocampal Population Bursts.</a> Neuron. 49 (1), 131-142 (2006).</li>
<li>Avoli, M., Drapeau, C., Louvel, J., Pumain, R., Olivier, A., Villemure, J. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+induced+by+low+extracellular+magnesium+in+the+human+cortex+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity induced by low extracellular magnesium in the human cortex maintained in vitro.</a> Annals of neurology. 30 (4), 589-596 (1991).</li>
<li>Heinemann, U., Dreier, J., Leschinger, A., Stabel, J., Draguhn, A., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+anticonvulsant+drugs+on+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Effects of anticonvulsant drugs on hippocampal neurons.</a> Hippocampus. 4 (3), 291-296 (1994).</li>
<li>Li Zhang, C., Dreier, J. P., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paroxysmal+epileptiform+discharges+in+temporal+lobe+slices+after+prolonged+exposure+to+low+magnesium+are+resistant+to+clinically+used+anticonvulsants%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+research%22%5BJournal%5D)">Paroxysmal epileptiform discharges in temporal lobe slices after prolonged exposure to low magnesium are resistant to clinically used anticonvulsants.</a> Epilepsy research. 20 (2), 105-111 (1995).</li>
<li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents+-+EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents - EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
</ol>

Produkcja filmu i publikacja w otwartym dostępie zostały objęte patronatem Multichannel Systems.

Padaczka farmooporna jest rzadkim schorzeniem, które można badać w tkance ludzkiej in vitro. Pozwala to na badanie epileptycznej kory mózgowej człowieka, która wykazuje specyficzne defekty, które są tylko częściowo odtwarzane w modelach zwierzęcych. Opisana tu metoda pozwala na przygotowanie i rejestrację ex vivo ludzkich tkanek pooperacyjnych z zachowaną żywotnością komórkową i sieciami tak, aby spontanicznie wytwarzały aktywność padaczkową. Zachowanie aktywności podobnej do zarejestrowanej in vivo ma kluczowe znaczenie dla badania mechanizmów genezy działań patologicznych. Co więcej, takie metody pozwalają na badanie tkanek ludzkich i unikanie niedoskonałych zwierzęcych modeli choroby. Jednak badanie tkanki ludzkiej wymaga synchronizacji między neurochirurgami a laboratorium eksperymentalnym. Transport tkanek wymaga szczególnej ostrożności, aby nie był traumatyczny. Ponadto zarówno ilość próbki, jak i tkanki jest ograniczona. Wreszcie, głównym problemem jest dostęp do odpowiednich tkanek kontrolnych. Dzięki temu preparatowi tkanki pooperacyjne spontanicznie wytwarzają wydzieliny przypominające wydzieliny międzynapadowe w prawidłowym ACSF7,8. Zdarzenia podobne do napadów mogą być również wywoływane w zmodyfikowanym, prodrgawkowym ACSF, dzięki czemu można badać mechanizmy inicjacji napadu i przejścia ze stanu międzynapadowego do napadów.
Tkanka ludzka może być utrzymywana przy życiu do 10 godzin w warunkach interfejsu. Plastry uznano za żywotne, gdy spontanicznie obserwowano aktywność wielojednostkową lub potencjały pola i gdy takie działania były wywoływane przez zwiększenie pobudliwości poprzez zewnątrzkomórkowy wzrost potasu i / lub spadek magnezu. Chociaż występuje zmienność aktywności, prawdopodobnie odzwierciedlająca różnice w patologiach i obszarach korowych, zbadaliśmy cechy padaczkowe tkanki tylko w zdrowych wycinkach wykazujących spontaniczne wyładowania międzynapadowe i wywołane ictal. W celu zachowania witalności i aktywności tkanek, komora interfejsu jest używana do przechowywania plastrów w temperaturze 36-37 °C w celu odzyskania przed zapisem w systemie MEA. Rzeczywiście, kilka grup wyraźnie wykazało zalety systemu przechowywania opartego na interfejsie w porównaniu ze standardowym przechowywaniem zlewek oraz znaczenie temperatury dla zachowania aktywności sieci, takiej jak spontaniczne ostre tętnienia fal lub oscylacje wywołane cholinergią9,10. Przechowywanie interfejsów plasterków było wcześniej wykorzystywane do rejestrowania aktywności padaczkowej z ludzkich wycinków hipokampa i podbrzusza1,11. Przy obecnej technice MEA, po okresie rekonwalescencji po krojeniu w warunkach interfejsu, aktywność sieci jest rejestrowana w warunkach zanurzenia, w obecności wysokiego natężenia przepływu (5-6 ml/min) w temperaturze 37 °C, za pomocą systemu MEA. Zmniejszona średnica (1,8 cm) chipa MEA, która wyznacza komorę o małej objętości (<1,5 ml), wraz ze zwiększonym natężeniem przepływu, zwiększa dopływ tlenu do warstwy, co, jak wykazano, jest krytycznym czynnikiem dla spontanicznych i farmakologicznie wywołanych działań sieciowych9,10. Co więcej, zmniejszona ilość krążącego ACSF ułatwia przeprowadzanie testów farmakologicznych.
Procedura krojenia jest jednak traumą dla tkanek12. Zarówno architektura neuronów, jak i homeostaza chlorków wydają się być zaburzone na powierzchni tkanki (50 μm). Pochodzenie czynności rejestrowanych przez chipy MEA, które pobierają próbki tkanki głównie powierzchownie bez głębokiej penetracji, może wynikać z obszarów dotkniętych urazami. Jednak nasze dane pokazują, że potencjały pola zewnątrzkomórkowego wykrywane lokalnie są rejestrowane w większości elektrod MEA, a poprzednie prace pokazują, że są one zintegrowane w odległości od 100 do 200 μm od miejsca rejestracji13, co sugeruje, że napady zarejestrowane w naszym preparacie prawdopodobnie nie są wytwarzane przez obszary uurazowe. Ponadto w badaniach przeprowadzonych z użyciem elektrod wolframowych umożliwiających głęboką penetrację, aktywność padaczkowa rejestrowana w tkankach ludzkich jest podobna do obserwowanej u pacjentów z padaczką1,7,8.
Kolejnym ograniczeniem zapisu tkanek ex vivo jest przerwanie połączeń między różnymi obszarami mózgu, ograniczając w ten sposób dynamiczne neuromodulacje. Może to wyjaśniać, dlaczego w takiej tkance nie rejestruje się spontanicznie żadnego zdarzenia podobnego do ictal, ale musi być wywołane przez manipulację jonową lub stymulację farmakologiczną zwiększającą pobudliwość. W związku z tym w tym protokole zdarzenia podobne do napadów są indukowane przez połączenie zmiany zewnątrzkomórkowego K + z 3 do 6 mM i zmniejszenia zewnętrznego Mg2 + z 1,3 mM do Mg2 + wolnego ACSF, w celu zwiększenia pobudliwości tkanek i usunięcia bloku receptora NMDA zależnego od Mg2 +. Rzeczywiście, wcześniej wykazano, że aktywność padaczkowa indukowana w ludzkich wycinkach kory nowej i hipokampa przy użyciu ACSF wolnego od Mg2 + przypomina napady elektrograficzne zarejestrowane in vivo14. Poza tym wykazano, że wydzieliny padaczkowe uzyskane w wycinkach płata skroniowego stają się oporne na klinicznie stosowane leki przeciwdrgawkowe po długotrwałej ekspozycji na ACSF15,16 wolne od Mg2+, co stanowi model do badania farmoopornych zdarzeń podobnych do napadów in vitro.
MEA umożliwiają rejestrację zarówno potencjałów polowych, jak i aktywności wielojednostkowych składających się na neuronalne potencjały czynnościowe ex vivo. Tak więc MEA są potężnym narzędziem elektrofizjologicznym w porównaniu z EEG, które badają potencjały pola generowane przez synchroniczne działania zespołów neuronalnych in vivo, ale nie dają dostępu do zachowań pojedynczych neuronów17. Chociaż nowsze mikroelektrody mogą rejestrować in vivo wielojednostkowe czynności polegające na neuronalnych potencjałach czynnościowych, są one inwazyjne, więc ich zastosowanie ogranicza się głównie do celów badawczych podczas zapisów wewnątrzczaszkowych. W szczególności zapisy MEA stanowią technikę z wyboru do badania czasoprzestrzennych wzorców zdarzeń padaczkowych, mechanizmów kontrolujących początek i rozprzestrzenianie się napadów oraz działanie klasycznych i nowych leków przeciwpadaczkowych. Co ciekawe, aby rozwikłać typy komórek i podstawy sygnalizacji wyładowań padaczkowych, techniki sortowania kolców i testy farmakologiczne powinny być połączone z technikami MEA. Chociaż MEA mogą dawać dostęp do pojedynczych kolców, nie dostarczają informacji o właściwościach synaptycznych i biofizycznych. W przyszłości inne techniki powinny być sprzężone z zapisami MEA, aby lepiej próbkować zachowanie komórek, aktywność sieci i sygnalizację synaptyczną. Na przykład obrazowanie fluorescencyjne w celu rozwikłania śladów neuronów lub komórek glejowych, a także dynamiki jonów, można połączyć z zapisami MEA. Dalsza analiza histologiczna post hoc może również ujawnić specyficzne zmiany typów komórek, białek lub receptorów, tak aby lokalizacja aktywności padaczkowej mogła być skorelowana z określonymi rearanżacjami struktury nerwowej. System MEAs może być również osadzony w układzie patch-clamp w celu skorelowania pojedynczych komórek lub przewodnictwa z aktywnością populacji. W przyszłości można również zastosować narzędzia optogenetyczne, pod warunkiem, że ludzkie plastry będą mogły być hodowane w dłuższej perspektywie, tak jak ma to miejsce w przypadku plastrów organotypowych, tak aby można było przeprowadzić transfekcję lub zakażenie określonych typów komórek.

Padaczka to przewlekła choroba, w której napady padaczkowe, które są przerywanymi, wzorzec wyładowań trwającymi od kilku sekund do kilkudziesięciu sekund na zapisach elektroencefalograficznych (EEG) związanych z objawami klinicznymi, przerywają stan międzynapadowy, charakteryzujący się obecnością synchronicznych wyładowań neuronalnych trwających dziesiątki milisekund i zwanych zdarzeniami internapadowymi1. Dotyka około 1% światowej populacji i chociaż napady są kontrolowane u większości pacjentów, około jedna trzecia osób z padaczką nie wykazuje odpowiedniej odpowiedzi na leki przeciwpadaczkowe2. W tym stanie, zwanym padaczką farmooporną, którego mechanizmy nadal muszą być jasno określone, chirurgiczna resekcja określonej części mózgu zidentyfikowanej jako strefa początku napadu pozostaje jedynym alternatywnym leczeniem dającym pozytywny wynik dla pacjentów. W ten sposób wycięte próbki z operacji dają możliwość zbadania mechanizmów wyładowań międzynapadowych oraz powstawania i rozprzestrzeniania się napadów padaczkowych, a także farmakooporności na żywotną ludzką tkankę ośrodkowego układu nerwowego ex vivo.
Matryce wieloelektrodowe (MEA), składające się z układu przestrzennie rozmieszczonych mikroelektrod, pozwalają na jednoczesną stymulację i rejestrację aktywności elektrofizjologicznej z kilku miejsc tkanki, zapewniając tym samym doskonałe podejście do badania czasoprzestrzennych wzorców spontanicznej i wywołanej aktywności. Technika ta, po raz pierwszy zastosowana do monitorowania zmian rozwojowych w zakresie aktywności hodowli komórek nerwowych3, a następnie dostosowana do ostrych i organotypowych wycinków mózgu i rdzenia kręgowego 4-6, jest obecnie uważana za cenne narzędzie elektrofizjologiczne.
Obecny protokół opisuje, jak przygotować ludzkie wycinki korowe z chirurgicznie wyciętej tkanki i rejestrować za pomocą MEA wiarygodne zdarzenia międzynapadowe ex vivo i podobne do napadów z tych wycinków. Technika ta pozwala zatem na zajęcie się podstawowymi mechanizmami leżącymi u podstaw inicjacji, rozprzestrzeniania się i działania leków przeciwpadaczkowych zarówno na poziomie komórkowym, jak i sieciowym. Wszystkie procedury stosowane do pozyskiwania, przygotowywania, przechowywania i rejestrowania ludzkich plastrów są tutaj szczegółowo opisane.

<table><tbody><tr><td>Komora Brain Slice-2: Interfejs</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>S-BSC2</td><td>Wymaga oddzielnego regulatora temperatury</td></tr><tr><td>2-kanałowy regulator temperatury Systemy</td><td>wielokanałowe, Niemcy</td><td>TC02</td><td>Umożliwia podłączenie i korzystanie z 2 komór interfejsu.&nbsp;</td></tr><tr><td>Specjalny do podłączenia TC01 do S-BSC2 z zewnętrznym odniesieniem PT100</td><td>Multichannel Systems, Niemcy</td><td>CA3</td><td>Numer referencyjny PT100 znajduje się w pobliżu plastrów&nbsp;</td></tr><tr><td>6-pinowe złącze wtykowe z</td><td>systemami wielokanałowymi</td> PT100, Niemcy <td>TS-PT100</td><td>Zewnętrzne odniesienie do CA3</td></tr><tr><td>Stacja robocza MEA do nagrywania danych ze 120-elektrodowych MEA</td><td>Multichannel Systems, Niemcy</td><td>MEA2100-120</td><td>Zawiera stację czołową MEA2100-120 i płytę interfejsu MEA2100. www.multichannelsystems.com</td></tr><tr><td>Matryca mikroelektrod do</td><td>systemów wielokanałowych</td> MEA2100-120, Niemcy <td>120MEA200/30</td><td>Rozstaw elektrod: 200 i mikro; m; średnica elektrody: 30 i mikro; m; Szklany pierścień: wysokość 6 mm. Możliwe różne konfiguracje (rozstaw, średnica, pierścień).&nbsp;</td></tr><tr><td>Stół do mikroskopu wideo</td><td>Systemy wielokanałowe, Niemcy</td><td>MEA-VMT-1</td><td>Stół z mikroskopem wideo pod spodem do obrazowania pola elektrod MEA we wzmacniaczu umieszczonym na stole i przesyłania obrazu do komputera.</td></tr><tr><td>Kaniula perfuzyjna</td><td>Systemy wielokanałowe, Niemcy</td><td>PH01</td><td>Podgrzewana kaniula perfuzyjna z czujnikiem temperatury; temperaturę można zaprogramować za pomocą kontrolera TC02</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>Multichannel Systems, Niemcy</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji i rejestracji</td></tr><tr><td>danych Magnetyczny uchwyt perfuzyjny</td><td>Systemy wielokanałowe, Niemcy</td><td>MPH</td><td>Magnetyczny uchwyt perfuzyjny na element PH01 do mocowania kaniuli perfuzyjnej i połączenia systemu perfuzyjnego z masą wzmacniacza</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Neuroexplorer</td><td>Nex Technologies</td><td></td><td>do analizy danych; info@neuroexplorer.com</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna (jednostka napędowa)</td><td>Gilson</td><td>F155001</td><td>0,01 do 48 rp</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna (głowica pompy)</td><td>Gilson</td><td>F117800</td><td>R2 dwukanałowa</td></tr><tr><td>Aspirator ultradźwiękowy</td><td>Integra Life sciences, USA</td><td>Cusa Excel +</td><td>Umożliwia subpialne rozwarstwienie kory</td></tr><tr><td>Neuronawigacja</td><td>Isis Solutions, Francja</td><td>Surgiscope</td><td>Umożliwia identyfikację struktury mózgu w czasie rzeczywistym na przedoperacyjnym MRI</td></tr><tr><td>Vibratome HM 650 V</td><td>Microm</td><td></td><td>Block krojenie na 400 &mu; m grubych plastrów</td></tr></tbody></table>

wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Padaczka, dotykająca około 1% populacji, obejmuje grupę zaburzeń neurologicznych charakteryzujących się okresowym występowaniem napadów, które zakłócają normalne funkcjonowanie mózgu. Pomimo leczenia obecnie dostępnymi lekami przeciwpadaczkowymi ukierunkowanymi na funkcje neuronalne, jedna trzecia pacjentów z padaczką jest oporna na farmakoleksję. W tym stanie chirurgiczna resekcja obszaru mózgu powodującego drgawki pozostaje jedynym alternatywnym leczeniem. Badania ludzkich tkanek padaczkowych przyczyniły się do zrozumienia nowych mechanizmów padaczkowych w ciągu ostatnich 10 lat. Rzeczywiście, tkanki te generują spontaniczne międzynapadowe wyładowania padaczkowe, a także farmakologicznie wywołane zdarzenia ictal, które można zarejestrować za pomocą klasycznych technik elektrofizjologicznych. Co ciekawe, matryce wieloelektrodowe (MEA), które są mikrowytwarzanymi urządzeniami zawierającymi szereg przestrzennie rozmieszczonych mikroelektrod, dają wyjątkową możliwość jednoczesnej stymulacji i rejestrowania potencjałów pola, a także potencjałów czynnościowych wielu neuronów z różnych obszarów tkanki. W związku z tym nagrania MEA stanowią doskonałe podejście do badania przestrzenno-czasowych wzorców spontanicznych zdarzeń internapadowych i wywołanych napadów padaczkowych oraz mechanizmów leżących u podstaw wystąpienia i rozprzestrzeniania się napadów. Tutaj opisujemy, jak przygotować ludzkie wycinki korowe z chirurgicznie wyciętej tkanki i rejestrować za pomocą MEA zdarzenia międzynapadowe i podobne do ictal ex vivo.

Rejestracja aktywności ludzkich skrawków kory rozpoczyna się podczas perfuzji tkanki standardowym roztworem ACSF do rejestracji (jak opisano wcześniej)7,8. W tym stanie, gdy tkanka została dobrze zachowana podczas operacji, a następnie podczas transportu z szpitala i przygotowania skrawków, można zaobserwować aktywność spontaniczną w formie niewielkich zdarzeń przypominających wyładowania interiktalne, wykrywanych w małych skupiskach elektrod MEA. Wyładowania przypominające interiktalne składały się z potencjału polowego, zazwyczaj dwufazowego, obejmującego początkowe ostre ugięcie ujemne, osiągające dziesiątki mikrowoltów, po którym następowała dłuższa fala o przeciwnym zwrocie, trwająca kilkadziesiąt milisekund. Szybka aktywność wielojednostkowa jest zazwyczaj osadzona w potencjale polowym, głównie w jego początkowej części. Reprezentatywny przykład aktywności przypominającej interiktalną zilustrowano na Rysunku 3Aii, gdzie pokazano zapis zarejestrowany przez elektrodę MEA.
Aby zarejestrować napady padaczkowe z ludzkich skrawków kory in vitro, konieczne jest ich perfuzja „epileptogennym” ACSF, w którym brakuje Mg2+, a stężenie K+ jest podniesione do 6 mM w celu zwiększenia pobudliwości tkanki1 (sam wzrost stężenia K+ z 3 do 6 mM nie jest wystarczający do wywołania napadów; dane nie pokazano). Po rozpoczęciu perfuzji ACSF z 0 Mg2+ i 6 mM K+, aktywność skrawków kory stopniowo wzrasta, a pierwszy napad pojawia się w ciągu 15 do 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, od 5 pacjentów; Rycina 3 Ai). Wywołano aktywność o charakterze ictalnym, jak pokazano na Rycini 3, u 75% badanych pacjentów i w 66,7% wszystkich zarejestrowanych skrawków.
Aktywność epilepticzną rejestruje się z sąsiednich elektrod chipa MEA, a porównanie dynamiki rozpoczęcia zdarzeń potencjału polowego pozwala na badanie miejsca ich powstania i propagacji. Reprezentatywny napad zarejestrowany z wycinka ludzkiej kory mózgowej za pomocą systemu MEA przedstawiono na Rysunku 3B (reprezentatywny zapis napadu zarejestrowany przez pojedynczą elektrodę MEA pokazano z wyższą rozdzielczością czasową na Rysunku 3 Aiii). Należy zauważyć, że napad został zarejestrowany niemal przez wszystkie elektrody chipa MEA, co wskazuje na jego zdolność do propagacji na duży obszar kory. Ponadto, analizując pojedyncze zapisy z każdej elektrody, można zaobserwować progresywną propagację napadu w tkance: faktycznie rozpoczyna się on najpierw w obszarze kory obejmującym prawą połowę macierzy elektrod, a następnie stopniowo rozprzestrzenia się na obszar obejmujący lewą połowę (i. e., porównać zapisy z elektrody L6 i B6; Rysunek 3B).
<img alt="Sekwencja operacji mózgu; obraz MRI, mikrografia tkanki, przygotowanie chirurgiczne oraz procedura otwarcia czaszki." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig1highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Dysplazja kory i jej chirurgiczne usunięcie. Ogniskowa dysplazja kory typu Taylora (biała strzałka) zlokalizowana w bruździe lewego płata czołowego jest widoczna na przedoperacyjnym MRI (A), a następnie potwierdzona w badaniu histologicznym (B) (barwienie na kinazę MAP; pasek skali: 200 μm), wykazując dyslaminację kory, nieprawidłowe neurony oraz szlak neuronów z niepełną migracją w dolnej istocie białej. Podczas operacji dysplazja jest lokalizowana na podstawie danych MRI z wykorzystaniem systemu neuronawigacji (C). Wizualizacja zakrętu zawierającego dysplazję podczas operacji (D).
<img alt="Proces wykonania elektrody, obrazy przedstawiają układ eksperymentalny i prototypy elektrod." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig2highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Sprzęt i procedura przygotowania skrawków kory ludzkiej. Komora interfejsowa jest używana do utrzymania skrawków kory ludzkiej ex vivo (A); skrawki spoczywają na arkuszu tkanki soczewkowej na płaskim obszarze w górnej części komory (B), gdzie w celu utrzymania temperatury 37 °C przez cały czas inkubacji skrawków umieszczono czujnik temperatury (C, lewo), połączony z kontrolerem temperatury (C, prawo, góra) za pomocą kabla dwustronnego (C, prawo, dół). Po pobraniu umieść wycięty blok tkanki w szalce Petri wypełnionej lodowatym ACSF na bazie sacharozy (D) i usuń skrzepy krwi, naczynia oraz oponowe, aby ułatwić krojenie. Jeśli blok tkanki jest większy niż komory MEA, wyizoluj fragment o odpowiednich wymiarach za pomocą ostrza (E) i przyklej go do płytki okładzinowej wibratomu (F). Wytnij skrawki o grubości 400 µm i za pomocą szpatułki (G) przenieś je na kawałki tkanki soczewkowej (H), a następnie inkubuj w komorze interfejsowej (I). Przed rejestracją usuń tkankę soczewkową, zanurzając skrawek w szalce Petri wypełnionej ACSF, a następnie przenieś go szpatułką (J) na chip MEA wypełniony ACSF. Usuń roztwór, aby umożliwić przyleganie skrawka do MEA (K) i utrzymaj go w pozycji za pomocą platynowej kotwicy. Umieść MEA w wzmacniaczu (L), uruchom perfuzję i rejestrację.
<img alt="Dane elektrofizjologiczne; wykresy przebiegów fal; analiza aktywności neuronalnej w sieci powierzchni kory." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig3highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Rejestracje MEA napadów padaczkowych w ludzkich skrawkach kory mózgowej. (A) Reprezentatywny zapis aktywności ludzkiego skrawka kory zarejestrowany przez elektrodę MEA przedstawiono w panelu i. W obecności prawidłowego ACSF można zaobserwować spontaniczną aktywność typu interictalnego (mały szary prostokąt, powiększenie w panelu ii); następnie, po rozpoczęciu perfuzji ACSF z 0 Mg2+ i 6 mM K+, pierwszy napad pojawia się po około 15 min opóźnienia, a po nim następują kolejne zdarzenia w odstępach 2-3 min. Panel iii przedstawia napad z dużego szarego prostokąta w panelu i w powiększonej skali. Niebieski ślad ilustruje powiększenie aktywności, co wskazano niebieską linią i strzałką. Panel iv) przedstawia dane z panelu iii) po przefiltrowaniu górnoprzepustowym przy 250 Hz, co po powiększeniu ujawnia aktywność wielojednostkową (niebieski ślad). (B) Reprezentatywny zapis napadu w obecności ACSF z 0 Mg2+ i 6 mM K+ ze wszystkich elektrod MEA. Każdy kwadrat reprezentuje elektrodę matrycy MEA 12 x 12 i pokazuje okno czasowe 80 s; linia przerywana wskazuje położenie powierzchni kory względem matrycy MEA.

Tutaj opisujemy, jak wykonywać zapisy wieloelektrodowe tkanki ludzkiej kory padaczkowej. Szczegółowo zademonstrowano resekcję tkanki padaczkowej, przygotowanie plastrów i zapisy wieloelektrodowe zdarzeń międzynapadowych i ictalowych.

Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie wieloelektrodowych zapisów zdarzeń ex vivo, międzynapadowych i napadowych z ludzkiej tkanki kory padaczkowej, zapewniając w ten sposób sposób sposób zajęcie się podstawowymi mechanizmami leżącymi u podstaw aktywności padaczkowej, inicjacji, propagacji i skutków leków przeciwpadaczkowych zarówno na poziomie komórkowym, jak i sieciowym. Osiąga się to poprzez najpierw staranną resekcję ludzkiej tkanki korowej od pacjentów z padaczką farmooporną podczas operacji. Drugim krokiem jest usunięcie skrzepów krwi, naczyń krwionośnych i opon mózgowych oraz nadmiaru istoty białej przed pokrojeniem.Następnie pokrój blok tkanki na plastry o wielkości 400 mikronów. Ostatnim krokiem jest utrzymanie plastrów w warunkach interfejsu wysokiego natlenienia i kontrolowanej temperatury z powolną perfuzją. Ostatecznie, technika matrycy wieloelektrodowej jest wykorzystywana do rejestrowania spontanicznej aktywności podobnej do międzycząsteczkowej i wywoływanych zdarzeń podobnych do układów międzyelektrodowych.Nasze laboratorium bada rolę interakcji neuroglejowych w fizjopatologii mózgu, aby zbadać, w jaki sposób komórki nerwowe mogą generować patologiczną aktywność sieci u ludzi. Niedawno opracowaliśmy wieloelektrodowe zapisy ludzkiej tkanki korowej z padaczką padaczkową, pooperacyjną we współpracy ze szpitalami Petriego zajmującymi się pielęgnacją szyi i kolanami. Dzisiaj Thomas Blo, neurochirurg ze Szpitala Neck Care Hospital, wraz z epileptologiem i badaczem Feld w Lapis Hospital oraz Eleną DOI postdoc w moim laboratorium pokażą Ci, jak wykonywać i dobrze wykorzystywać takie techniki.Od pobrania ludzkiej tkanki padaczkowej do zapisów MEA ex vivo, zastosowanie elektrowstrząsów w ludzkiej tkance korowej do leczenia pacjentów z padaczką umożliwia bezpośrednią eksplorację funkcjonalnie utrzymywanych ludzkich neuronów padaczkowych i komórek glejowych, które są połączone w określone sieci. Badania in vitro tkanki ludzkiej dają dostęp do pojedynczych komórek i aktywności sieciowej, mechanizmów jonowych, których nie można w pełni rozwiązać in vivo. Zapis MEA ludzkiej tkanki korowej może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie padaczki, takie jak mechanizmy komórkowe leżące u podstaw egzogenezy i rozprzestrzeniania się napadów.Implikacje tej techniki rozciągają się na padaczkę lezyjną i jej terapię, ponieważ pozwala zrozumieć mechanizmy oporności farmakologicznej i wpływ leku przeciwpadaczkowego na zdarzenie podobne do napadu zarejestrowane w wycinkach kory mózgowej człowieka. In vitro. Główną przewagą matryc wieloelektrograficznych nad istniejącymi metodami, takimi jak e, e, g czy mikroelektrody in vivo, jest to, że pozwalają one na nieinwazyjną, jednoczesną stymulację i rejestrację potencjałów pola i aktywności wielojednostkowej z kilku stron tkanki.Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować komorę interfejsu, najpierw wypełniając dolną część wodą destylowaną. Następnie podłącz komorę do źródła karbogenu. Następnie wytnij kawałek chusteczki soczewki, aby pasował do płaskiej powierzchni komory plastrów.Umieść go obok rurki wejściowej, aby umożliwić wydostanie się bąbelków z linii wejściowej przed dotarciem do plasterków. Następnie odetnij dwa kawałki nici bawełnianej o tej samej długości co kawałek chusteczki do soczewek. Umieść je po bokach płaskiej powierzchni komory, ustaw natężenie przepływu pompy perystaltycznej na jeden mililitr na minutę.Następnie włącz natlenianie wody w dolnej części komory. Następnie ustaw regulator temperatury na 37 stopni Celsjusza. Przykryj górną część komory interfejsu kawałkiem paraformu i odczekaj co najmniej 30 minut, aż temperatura wzrośnie i ustabilizuje się.Teraz przygotuj narzędzia do preparowania, które obejmują dwa cienkie kleszcze, szpatułkę, małą łyżkę i ostrze, dwie szklane szalki Petriego, dwie szczotki i klej cyjanoakrylowy. Następnie przygotuj vibrato, ustawiając parametry krojenia. W tej procedurze usuń przygotowany płyn mózgowo-rdzeniowy A na bazie sacharozy z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i zmiażdż go na błoto pośniegowe.Natlenić go karbogenem. Następnie przenieś 250 mililitrów błota pośniegowego A CSF do szklanej butelki i przechowuj je w butelce wypełnionej lodem w celu pobrania tkanek na sali operacyjnej. W standardowym znieczuleniu ogólnym użyj systemu neuronawigacji, aby umożliwić precyzyjną lokalizację kory mózgowej.Następnie wykonaj nacięcie w skórze, a następnie utwórz otwór w kości, a następnie kraniotomię. Następnie delikatnie unieś płat kostny i otwórz oponę twardą nożyczkami. Następnie należy wykonać resekcję blokową kory padaczkowej i uniknąć rozległej krzepnięcia.Wytnij blok korowy o grubości jednego centymetra i umieść go w zamrożonym natlenionym sacharozie A CSF. Następnie przenieś tkankę w zamrożonym płynie mózgowo-rdzeniowym A na bazie sacharozy do laboratorium tak szybko, jak to możliwe, unikając wstrząsów mechanicznych. Teraz napełnij szalkę Petriego i tackę buforową vibrato natlenionym błotem pośniegowym A CSF na bazie sacharozy i kontynuuj natlenianie błota pośniegowego A CSF karbogenem.Następnie ostrożnie wyjmij chusteczkę z butelki łyżką i umieść ją na szalce Petriego. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń skrzepy krwi, naczynia i opony mózgowe, aby uniknąć oporu podczas krojenia. Odetnij stronę tkanki ostrzem, aby uzyskać płaską powierzchnię jak najbardziej równoległą do przeciwnej strony tkanki.Następnie przyklej tkankę do płytki próbki vibrato, aby przygotować poprzeczne plastry korowe. Następnie umieść go na tacy buforowej i pokrój plastry o grubości 400 mikronów z małą prędkością. Następnie wytnij kilka kawałków chusteczki soczewki za pomocą szpatułki i pędzla.Przenieś te wycinki tkanki soczewki do komory interfejsu. Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę przed nagraniem. W tej procedurze należy podłączyć system perfuzyjny do pompy perystaltycznej, a system MEA do komputera.Następnie umieść pusty chip MEA wewnątrz amplifier. Następnie należy ustawić regulator temperatury do podgrzewania elementu kaniuli w komorze MEA na 37 stopni Celsjusza. Rozpocznij perfuzję natlenionego płynu mózgowo-rdzeniowego A z prędkością od pięciu do sześciu mililitrów na minutę.Następnie otwórz oprogramowanie do nagrywania. Upewnij się, że wszystkie elektrody MEA są dobrze podłączone i że nie ma hałasu z powodu perfuzji. Teraz wlej trochę podgrzanego nagrania A CSF do szklanej szalki Petriego.Przenieś plasterek z komory interfejsu na szalkę Petriego, chwytając tkankę soczewki. Następnie ostrożnie oderwij plasterek od tkanki, zanurzając go w roztworze lub użyj małej szczoteczki, aby ułatwić oderwanie. Następnie napełnij chip MEA odrobiną A CSF.Przenieś plasterek na chip MEA za pomocą szpatułki z plastikową pipetą. Delikatnie usuń roztwór, aby plasterek przylegał do obszaru elektrody i przytrzymaj go na miejscu za pomocą platynowej kotwicy. Następnie dodaj jeden mililitr nagrania CSF do układu MEA i umieść go we wzmacniaczu.Następnie rozpocznij perfuzję z prędkością od pięciu do sześciu mililitrów na minutę. Następnie sprawdź pozycję wycinka w obszarze nagrywania MEA. Korzystając z oprogramowania monitora MEA, dostosuj je w razie potrzeby.Aby nagrywać z warstw kory mózgowej i zrobić zdjęcie, rozpocznij nagrywanie. Jest to reprezentatywny ślad aktywności warstwy kory mózgowej człowieka zarejestrowany przez elektrodę MEA. W normalnym płynie mózgowo-rdzeniowym A można zaobserwować spontaniczną aktywność podobną do międzynapadowej 15 minut po perfuzji z sześciomilimolowym potasem A CSF bez magnezu.Pojawia się pierwszy napad, po którym następują inne zdarzenia w odstępach dwu- lub trzyminutowych. Niebieski ślad ilustruje powiększoną aktywność. Ten panel pokazuje dane górnoprzepustowe przefiltrowane z częstotliwością 250 herców, co ujawnia aktywność wielu jednostek po powiększeniu, tutaj jest reprezentatywne nagranie napadu ze wszystkich elektrod MEA bez magnezu.Sześciomilimolowy potas A CSF. Każdy kwadrat reprezentuje elektrodę o wymiarach 12 na 12 MEA i pokazuje 82. okno czasowe. Linia przerywana wskazuje położenie powierzchni kory mózgowej względem macierzy MEA.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak bezpiecznie transportować ludzką tkankę korową, przygotowywać i przechowywać żywotną łuszczycę korową oraz wykonywać nagrania MEA spontanicznych i indukowanych czynności padaczkowych Podczas próby tej procedury ważne jest, aby ściśle współpracować między zespołem klinicznym w szpitalu a naukowcami w laboratorium. Nigdy nie zapominaj, że praca z tkanką ludzką może być niebezpieczna i zawsze należy podjąć ochronę, taką jak noszenie rękawiczek, aby uniknąć ewentualnej choroby zakaźnej Zgodnie z tą procedurą. Inne techniki, takie jak obrazowanie fluorescencyjne, lampa krosowa, rejestracja, sortowanie impulsów i analiza histologiczna mogą być sprzężone z zapisami EA w celu skorelowania właściwości synaptycznych, dynamiki jonów zachowania pojedynczej komórki oraz nieprawidłowości komórkowych i molekularnych z aktywnością populacji.Wykonywanie zapisów MEA ludzkich tkanek padaczkowych może utorować naukowcom drogę do zbadania padaczki chorobowej w celu wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw egzogenezy i oporności farmakologicznej, a także roli interakcji neuroglejowej w tym zjawisku. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.

multi-electrode-array-recordings-human-epileptic-postoperative

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisane zostaną zewnątrzkomórkowe rejestracje aktywności neuronalnej z wykorzystaniem sond krzemowych u znieczulonego szczura. Technika ta pozwala na pozyskiwanie informacji z wielu obszarów mózgu od ponad 100 neuronów jednocześnie. Dostarcza ona informacji z rozdzielczością pojedynczych komórek na temat dynamiki zespołów neuronalnych w wielu obwodach lokalnych.

Rejestracja wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura

Przedstawiamy przydatne informacje dla chirurgów uczących się procesu implantacji chronicznych elektrod do rejestracji sygnałów neuronalnych. Opisano techniki stosowane dla systemów elektrod penetrujących oraz powierzchniowych w modelu gryzoni.

Chirurgiczna implantacja chronicznych elektrod neuronowych do rejestracji aktywności pojedynczych jednostek i sygnałów elektrokortykograficznych

Przedstawiamy metodę pozyskiwania sygnałów elektrokortykograficznych do celów badawczych u ludzi poddawanych inwazyjnemu monitorowaniu epilepsji. Pokazujemy, jak wykorzystać platformę programową BCI2000 do zbierania danych, przetwarzania sygnałów oraz prezentacji bodźców. W szczególności prezentujemy SIGFRIED, narzędzie oparte na BCI2000 służące do funkcjonalnego mapowania mózgu w czasie rzeczywistym.

Rejestracja ludzkich sygnałów elektrokortykograficznych (ECoG) w badaniach neuronaukowych i funkcjonalnym mapowaniu kory mózgowej w czasie rzeczywistym

Zaprojektowaliśmy procedurę, w której utrwalone formaldehydem ludzkie zwłoki są używane do pomocy neurochirurgom w szkoleniu do wszczepiania układów mikroelektrod do kory nowej ludzkiego mózgu.

Szkolenie chirurgiczne w zakresie implantacji układów mikroelektrod kory nowej przy użyciu modelu zwłok ludzkich utrwalonych formaldehydem

To badanie wprowadza metodę jednoczesnego rejestrowania lokalnych potencjałów pola w mózgu, elektrokardiogramów, elektromiogramów i sygnałów oddechowych swobodnie poruszającego się szczura. Technika ta, która obniża koszty eksperymentów i upraszcza analizę danych, przyczyni się do zrozumienia interakcji między mózgiem a narządami obwodowymi.

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego, elektrokardiogram, elektromiogram i rytm oddychania swobodnie poruszającego się szczura

Opracowaliśmy całokorową matrycę elektrokortykograficzną dla marmozety pospolitej, która nieprzerwanie pokrywa prawie całą boczną powierzchnię kory, od bieguna potylicznego do bieguna skroniowego i czołowego. Protokół ten opisuje przewlekłą procedurę implantacji matrycy w przestrzeni zewnątrzoponowej mózgu marmozety.

Przewlekła implantacja całej korowej matrycy elektrokortykograficznej u marmozety zwyczajnej

Opisujemy metodę przeprowadzania nagrań pojedynczych neuronów z jednoczesnym śledzeniem ruchu gałek ocznych u ludzi. Pokazujemy użyteczność tej metody i ilustrujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy to podejście do uzyskania neuronów w ludzkim przyśrodkowym płacie skroniowym, które kodują cele wyszukiwania wzrokowego.

Jednoczesne śledzenie ruchu gałek ocznych i zapisy pojedynczych neuronów u pacjentów z padaczką u ludzi

Opisujemy tutaj metodę wytwarzania matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene i wykorzystywania ich do rejestracji neuronowej in vivo.

Produkcja matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene do rejestracji neuronowej in vivo

Tutaj prezentujemy metodę długoterminowej oceny wydajności i bezpieczeństwa miękkich matryc elektrod podtwardówkowych w modelu minipig, opisując metodę i narzędzia chirurgiczne, pooperacyjny rezonans magnetyczny, elektrofizjologię kory słuchowej, właściwości elektrochemiczne implantu oraz immunochemię pośmiertną.

Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych

Tutaj przedstawiamy protokół użycia komplementarnych systemów układów mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEAs) do rejestrowania aktywności podobnej do napadu z wycinków mózgu ex vivo.

Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj technikę wieloelektrodowych zapisów z ludzkiej tkanki korowej pooperacyjnej u pacjentów z epilepsją lekooporną. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów inicjacji i propagacji napadów oraz wpływu leków przeciwpadaczkowych.

Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Przeglądaj więcej filmów