Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie wieloelektrodowych zapisów zdarzeń ex vivo, międzynapadowych i napadowych z ludzkiej tkanki kory padaczkowej, zapewniając w ten sposób sposób sposób zajęcie się podstawowymi mechanizmami leżącymi u podstaw aktywności padaczkowej, inicjacji, propagacji i skutków leków przeciwpadaczkowych zarówno na poziomie komórkowym, jak i sieciowym. Osiąga się to poprzez najpierw staranną resekcję ludzkiej tkanki korowej od pacjentów z padaczką farmooporną podczas operacji. Drugim krokiem jest usunięcie skrzepów krwi, naczyń krwionośnych i opon mózgowych oraz nadmiaru istoty białej przed pokrojeniem.

Następnie pokrój blok tkanki na plastry o wielkości 400 mikronów. Ostatnim krokiem jest utrzymanie plastrów w warunkach interfejsu wysokiego natlenienia i kontrolowanej temperatury z powolną perfuzją. Ostatecznie, technika matrycy wieloelektrodowej jest wykorzystywana do rejestrowania spontanicznej aktywności podobnej do międzycząsteczkowej i wywoływanych zdarzeń podobnych do układów międzyelektrodowych.

Nasze laboratorium bada rolę interakcji neuroglejowych w fizjopatologii mózgu, aby zbadać, w jaki sposób komórki nerwowe mogą generować patologiczną aktywność sieci u ludzi. Niedawno opracowaliśmy wieloelektrodowe zapisy ludzkiej tkanki korowej z padaczką padaczkową, pooperacyjną we współpracy ze szpitalami Petriego zajmującymi się pielęgnacją szyi i kolanami. Dzisiaj Thomas Blo, neurochirurg ze Szpitala Neck Care Hospital, wraz z epileptologiem i badaczem Feld w Lapis Hospital oraz Eleną DOI postdoc w moim laboratorium pokażą Ci, jak wykonywać i dobrze wykorzystywać takie techniki.

Od pobrania ludzkiej tkanki padaczkowej do zapisów MEA ex vivo, zastosowanie elektrowstrząsów w ludzkiej tkance korowej do leczenia pacjentów z padaczką umożliwia bezpośrednią eksplorację funkcjonalnie utrzymywanych ludzkich neuronów padaczkowych i komórek glejowych, które są połączone w określone sieci. Badania in vitro tkanki ludzkiej dają dostęp do pojedynczych komórek i aktywności sieciowej, mechanizmów jonowych, których nie można w pełni rozwiązać in vivo. Zapis MEA ludzkiej tkanki korowej może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie padaczki, takie jak mechanizmy komórkowe leżące u podstaw egzogenezy i rozprzestrzeniania się napadów.

Implikacje tej techniki rozciągają się na padaczkę lezyjną i jej terapię, ponieważ pozwala zrozumieć mechanizmy oporności farmakologicznej i wpływ leku przeciwpadaczkowego na zdarzenie podobne do napadu zarejestrowane w wycinkach kory mózgowej człowieka. In vitro. Główną przewagą matryc wieloelektrograficznych nad istniejącymi metodami, takimi jak e, e, g czy mikroelektrody in vivo, jest to, że pozwalają one na nieinwazyjną, jednoczesną stymulację i rejestrację potencjałów pola i aktywności wielojednostkowej z kilku stron tkanki.

Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować komorę interfejsu, najpierw wypełniając dolną część wodą destylowaną. Następnie podłącz komorę do źródła karbogenu. Następnie wytnij kawałek chusteczki soczewki, aby pasował do płaskiej powierzchni komory plastrów.

Umieść go obok rurki wejściowej, aby umożliwić wydostanie się bąbelków z linii wejściowej przed dotarciem do plasterków. Następnie odetnij dwa kawałki nici bawełnianej o tej samej długości co kawałek chusteczki do soczewek. Umieść je po bokach płaskiej powierzchni komory, ustaw natężenie przepływu pompy perystaltycznej na jeden mililitr na minutę.

Następnie włącz natlenianie wody w dolnej części komory. Następnie ustaw regulator temperatury na 37 stopni Celsjusza. Przykryj górną część komory interfejsu kawałkiem paraformu i odczekaj co najmniej 30 minut, aż temperatura wzrośnie i ustabilizuje się.

Teraz przygotuj narzędzia do preparowania, które obejmują dwa cienkie kleszcze, szpatułkę, małą łyżkę i ostrze, dwie szklane szalki Petriego, dwie szczotki i klej cyjanoakrylowy. Następnie przygotuj vibrato, ustawiając parametry krojenia. W tej procedurze usuń przygotowany płyn mózgowo-rdzeniowy A na bazie sacharozy z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i zmiażdż go na błoto pośniegowe.

Natlenić go karbogenem. Następnie przenieś 250 mililitrów błota pośniegowego A CSF do szklanej butelki i przechowuj je w butelce wypełnionej lodem w celu pobrania tkanek na sali operacyjnej. W standardowym znieczuleniu ogólnym użyj systemu neuronawigacji, aby umożliwić precyzyjną lokalizację kory mózgowej.

Następnie wykonaj nacięcie w skórze, a następnie utwórz otwór w kości, a następnie kraniotomię. Następnie delikatnie unieś płat kostny i otwórz oponę twardą nożyczkami. Następnie należy wykonać resekcję blokową kory padaczkowej i uniknąć rozległej krzepnięcia.

Wytnij blok korowy o grubości jednego centymetra i umieść go w zamrożonym natlenionym sacharozie A CSF. Następnie przenieś tkankę w zamrożonym płynie mózgowo-rdzeniowym A na bazie sacharozy do laboratorium tak szybko, jak to możliwe, unikając wstrząsów mechanicznych. Teraz napełnij szalkę Petriego i tackę buforową vibrato natlenionym błotem pośniegowym A CSF na bazie sacharozy i kontynuuj natlenianie błota pośniegowego A CSF karbogenem.

Następnie ostrożnie wyjmij chusteczkę z butelki łyżką i umieść ją na szalce Petriego. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń skrzepy krwi, naczynia i opony mózgowe, aby uniknąć oporu podczas krojenia. Odetnij stronę tkanki ostrzem, aby uzyskać płaską powierzchnię jak najbardziej równoległą do przeciwnej strony tkanki.

Następnie przyklej tkankę do płytki próbki vibrato, aby przygotować poprzeczne plastry korowe. Następnie umieść go na tacy buforowej i pokrój plastry o grubości 400 mikronów z małą prędkością. Następnie wytnij kilka kawałków chusteczki soczewki za pomocą szpatułki i pędzla.

Przenieś te wycinki tkanki soczewki do komory interfejsu. Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę przed nagraniem. W tej procedurze należy podłączyć system perfuzyjny do pompy perystaltycznej, a system MEA do komputera.

Następnie umieść pusty chip MEA wewnątrz amplifier. Następnie należy ustawić regulator temperatury do podgrzewania elementu kaniuli w komorze MEA na 37 stopni Celsjusza. Rozpocznij perfuzję natlenionego płynu mózgowo-rdzeniowego A z prędkością od pięciu do sześciu mililitrów na minutę.

Następnie otwórz oprogramowanie do nagrywania. Upewnij się, że wszystkie elektrody MEA są dobrze podłączone i że nie ma hałasu z powodu perfuzji. Teraz wlej trochę podgrzanego nagrania A CSF do szklanej szalki Petriego.

Przenieś plasterek z komory interfejsu na szalkę Petriego, chwytając tkankę soczewki. Następnie ostrożnie oderwij plasterek od tkanki, zanurzając go w roztworze lub użyj małej szczoteczki, aby ułatwić oderwanie. Następnie napełnij chip MEA odrobiną A CSF.

Przenieś plasterek na chip MEA za pomocą szpatułki z plastikową pipetą. Delikatnie usuń roztwór, aby plasterek przylegał do obszaru elektrody i przytrzymaj go na miejscu za pomocą platynowej kotwicy. Następnie dodaj jeden mililitr nagrania CSF do układu MEA i umieść go we wzmacniaczu.

Następnie rozpocznij perfuzję z prędkością od pięciu do sześciu mililitrów na minutę. Następnie sprawdź pozycję wycinka w obszarze nagrywania MEA. Korzystając z oprogramowania monitora MEA, dostosuj je w razie potrzeby.

Aby nagrywać z warstw kory mózgowej i zrobić zdjęcie, rozpocznij nagrywanie. Jest to reprezentatywny ślad aktywności warstwy kory mózgowej człowieka zarejestrowany przez elektrodę MEA. W normalnym płynie mózgowo-rdzeniowym A można zaobserwować spontaniczną aktywność podobną do międzynapadowej 15 minut po perfuzji z sześciomilimolowym potasem A CSF bez magnezu.

Pojawia się pierwszy napad, po którym następują inne zdarzenia w odstępach dwu- lub trzyminutowych. Niebieski ślad ilustruje powiększoną aktywność. Ten panel pokazuje dane górnoprzepustowe przefiltrowane z częstotliwością 250 herców, co ujawnia aktywność wielu jednostek po powiększeniu, tutaj jest reprezentatywne nagranie napadu ze wszystkich elektrod MEA bez magnezu.

Sześciomilimolowy potas A CSF. Każdy kwadrat reprezentuje elektrodę o wymiarach 12 na 12 MEA i pokazuje 82. okno czasowe. Linia przerywana wskazuje położenie powierzchni kory mózgowej względem macierzy MEA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak bezpiecznie transportować ludzką tkankę korową, przygotowywać i przechowywać żywotną łuszczycę korową oraz wykonywać nagrania MEA spontanicznych i indukowanych czynności padaczkowych Podczas próby tej procedury ważne jest, aby ściśle współpracować między zespołem klinicznym w szpitalu a naukowcami w laboratorium. Nigdy nie zapominaj, że praca z tkanką ludzką może być niebezpieczna i zawsze należy podjąć ochronę, taką jak noszenie rękawiczek, aby uniknąć ewentualnej choroby zakaźnej Zgodnie z tą procedurą. Inne techniki, takie jak obrazowanie fluorescencyjne, lampa krosowa, rejestracja, sortowanie impulsów i analiza histologiczna mogą być sprzężone z zapisami EA w celu skorelowania właściwości synaptycznych, dynamiki jonów zachowania pojedynczej komórki oraz nieprawidłowości komórkowych i molekularnych z aktywnością populacji.

Wykonywanie zapisów MEA ludzkich tkanek padaczkowych może utorować naukowcom drogę do zbadania padaczki chorobowej w celu wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw egzogenezy i oporności farmakologicznej, a także roli interakcji neuroglejowej w tym zjawisku. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.