Name: Konfokalne obrazowanie poklatkowe jako skuteczna metoda oceny cytozgodności kompozytów dentystycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj metodę konfokalnego obrazowania poklatkowego do oceny cytozgodności kompozytów dentystycznych z wykorzystaniem ludzkich fibroblastów dziąsłowych. Technika umożliwia monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym bez konieczności ich utrwalania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Firmy Saremco Dental Switzerland i Olympus Microsystems France są wdzięczne za wsparcie finansowe. Firma Saremco Dental jest również znana z hojnego przekazywania kompozytów dentystycznych ELS o bardzo niskim skurczu. Autorzy pragną również wyrazić swoje uznanie dla dr Simona Banksa z Wydziału Chemii (University College London) za jego pomoc w powtórce języka angielskiego.

Protokół składa się z trzech głównych kroków: pierwszy krok obejmuje przygotowanie ekstraktu kompozytowego w pożywce hodowlanej; drugi dotyczy hodowli komórek pierwotnych ludzkich fibroblastów dziąsłowych (HGF), kontaktu komórek z ekstraktami kompozytowymi i barwienia komórek; trzeci krok składa się z obrazowania konfokalnego i analizy sygnału fluorescencyjnego. W przypadku pobierania tkanek dziąseł protokół został zatwierdzony zgodnie z francuskim ustawodawstwem, świadomą zgodą i lokalną komisją etyczną.
1. Przygotowanie ekstraktów kompozytowych
Użyj zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco jako medium elucyjnego. Upewnij się, że stosunek powierzchni próbek do objętości pożywki ekstrakcyjnej jest na najniższym poziomie wymagań normy ISO 10993/12. Procedura ta została niedawno opisana11 i pokrótce opisana poniżej:
<ol>
	<li>Uformuj kuliste próbki nieutwardzonego kompozytu dentystycznego za pomocą specjalnego uchwytu. Rozmiar uchwytu wynosi 2 mm promienia, co jest zgodne z ogólnie zalecaną głębokością utwardzania w doustnym leczeniu klinicznym.</li>
	<li>Przygotować studzienki na płytki, z których każda zawiera 1 ml pożywki hodowlanej (DMEM), z 5% mieszaniną penicyliny/streptomycyny i 1% amfoterycyny, ale bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
	<li>Utwardzać próbki w studzience zawierającej podłoże DMEM za pomocą lampy LED o intensywności 1,070 mW cm-2 (λ = 465-475 nm) przez 40 sekund. Upewnij się, że odległość między końcówką utwardzającą a próbkami mieści się w zakresie 0,5 mm. Użyj tego trybu utwardzania, aby zasymulować tymczasowy kontakt między zębem a nieutwardzonym kompozytem dentystycznym. W sytuacji klinicznej do kontaktu dochodzi w momencie umieszczenia kompozytu odtwórczego w jamie ustnej.</li>
	<li>Próbki inkubować (próbki złożone w pożywce DMEM) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 w powietrzu. Inkubować pożywkę DMEM (bez próbek złożonych) dla komórek kontrolnych w tych samych warunkach.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa HGF, testowanie ekstraktów kompozytowych i barwienie komórek
<ol>
	<li>Wzrost i utrzymanie kultur komórkowych 
	Wyizoluj ludzkie fibroblasty dziąseł z biopsji zdrowej tkanki dziąsła pobranej od pacjentów podczas rutynowych ekstrakcji ortodontycznych.
	<ol>
		<li>Hodować ludzkie fibroblasty dziąseł w DMEM w obecności 10% FBS, 5% penicyliny/streptomycyny i 1% amfoterycyny B. Utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w powietrzu.</li>
		<li>Zmieniano pożywkę co 3 dni, a komórki pasażowe co 5 dni. Po osiągnięciu konfluencji zbierz komórki przez trypsynizację.</li>
		<li>Odwirować komórki o sile 90 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić je w pożywce hodowlanej. Policz komórkę za pomocą ręcznego automatycznego licznika komórek z berłem.</li>
		<li>Zawiesina komórek nasiennych o gęstości komórek 2,5 x 104 komórki/ml w systemie szkiełek komorowych. Pozostawić komórki do inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze o stężeniu 5%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodawanie ekstraktów złożonych do komórek w hodowli
	<ol>
		<li>Zastąp pożywkę z dwóch dołków szkiełka komorowego 1 ml badanych ekstraktów kompozytowych (po 24 godzinach inkubacji).</li>
		<li>Utrzymuj dwie pozostałe studzienki (komórki kontrolne) w tych samych warunkach.</li>
		<li>Inkubować szkiełko komorowe zawierające cztery studzienki w temperaturze 37 °C w inkubatorze, w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 w powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie fluorescencyjne 
	Użyj barwienia cytotoksyczności Żywe/Martwe dla komórek eukariotycznych zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: zestaw zapewnia szybki dwukolorowy test fluorescencyjny w celu określenia żywotności komórek w populacji na podstawie integralności błony plazmatycznej i aktywności esterazy. Barwienie odróżnia żywe komórki od uszkodzonych poprzez jednoczesne znakowanie za pomocą zielonofluorescencyjnej Calceiny-AM w celu wskazania wewnątrzkomórkowej aktywności esterazy i homodimeru Ethidium-1 w kolorze czerwonej fluorescencji (EthD-1) w celu wskazania utraty integralności błony.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór roboczy z dwóch odczynników barwiących zawierających 2 μM kalceiny AM i 4 μM EthD-1 (końcowe stężenie uznane za odpowiednie do barwienia fibroblastów). Dodaj barwnik do hodowanych komórek przylegających w obecności lub bez wybranych ekstraktów kompozytowych.</li>
		<li>Obserwuj bezpośrednio i szybko wybarwione populacje komórek przez co najmniej 15 minut po barwieniu i poprzez obrazowanie poklatkowe. Nie wirować i nie utrwalać poplamionych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfokalne obrazowanie poklatkowe i analiza sygnału
Używany system jest wyposażony w cztery lasery diodowe i wielokrotnie barwiony obraz dla maksymalnie czterech barwników fluorescencyjnych dla każdej próbki. System może wykonać obraz mapowania (powiększenie 10x), który daje przegląd próbki testowej, po której można się poruszać, aby obserwować obszar zainteresowania (powiększenie 600x).
<ol>
	<li>Obrazowanie poklatkowe
	<ol>
		<li>Umieścić próbki (szkiełko komorowe zawierające barwione próbki) w ciemnym pomieszczeniu zintegrowanego inkubatora konfokalnego (37 °C, 5% CO2 i wilgotna atmosfera).</li>
		<li>Wybierz odpowiednie lasery. Użyj dwóch źródeł laserowych o długości fali 473 nm (15 mW) i 559 nm (18 mW) do wzbudzenia kalceiny i EthD-1.</li>
		<li>Użyj trybu dwóch sekwencji, aby uzyskać obrazy za pomocą sekwencji liniowych bez przesłuchów w obrazowaniu za pomocą dwóch użytych barwników fluorescencyjnych.</li>
		<li>Użyj detektora z nowo opracowanym widmem, aby automatycznie ustawić warunki zgodnie z barwnikiem fluorescencyjnym w jednostce skanującej.</li>
		<li>Zoptymalizuj maksymalne szerokości pasma wykrytej fluorescencji dla każdego kanału. Rejestruj wszystkie przejęcia sekwencyjnie, aby uniknąć potencjalnych przesłuchów.</li>
		<li>Wybierz najbardziej odpowiednie warunki obrazowania w oparciu o wybór barwnika fluorescencyjnego za pomocą oprogramowania do akwizycji.</li>
		<li>Uzyskaj obraz mapy, który jest automatycznie tworzony od środka w spiralny wzór, a obszar zainteresowania można łatwo wybrać do dokładniejszego zbadania.</li>
		<li>Wybierz tryb obserwacji. W razie potrzeby wybierz do pięciu typów trybów obserwacji, w tym poklatkowy, Z-stack i wieloobszarowy. Użyj kombinacji trybów Z-stack i time-lapse w niniejszym badaniu i szybko zakończ przechwytywanie obrazu,</li>
		<li>Zmień i zmień barwnik fluorescencyjny. Alternatywnie, nałóż na siebie obrazy fluorescencyjne i kontrastujące ze światłem. Obserwuj obraz na żywo za pomocą wybranego punktu po lewej stronie dolnego ekranu mapy.</li>
		<li>Określ obszar obrazowania za pomocą funkcji kadrowania i powiększania. Opcjonalnie przełączaj się między wyświetlaczami dla każdego rodzaju barwnika fluorescencyjnego. 
		UWAGA: Mikroskop używany w tym protokole ma taką samą funkcjonalność jak konwencjonalny mikroskop konfokalny o wysokiej wydajności, ale w kompaktowej obudowie. Mikroskop jest wyposażony w odwrócone obiektywy zanurzone w wodzie, które są optymalnie przystosowane do stabilnego obrazowania poklatkowego żywych komórek za pomocą uproszczonego wbudowanego inkubatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza i kwantyfikacja sygnałów
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić ilościowo sygnał fluorescencji. Uzyskaj pięć obrazów map z obiektywem 10X zarówno dla badanej próbki, jak i kontroli komórki.</li>
		<li>Uzyskano obrazy regularne o rozdzielczości od 1 024 × 1 024 pikseli do 0,231 μm × 0,231 μm. Przechowuj obrazy w formacie Olympus Image Format (OIF) w celu analizy sygnału. Ten format umożliwia przechowywanie różnych ustawień parametrów i obrazów razem. Korzystaj z różnych narzędzi analitycznych (pomiar profilu natężenia, stosunek intensywności między dwoma używanymi kanałami).</li>
		<li>Obrazy projekcji maksymalnej można przechowywać w plikach TIFF o wielkości 12 bitów/piksel.</li>
		<li>Wykonywanie analiz statystycznych za pomocą oprogramowania R commander. Analizuj różnice za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) z testem powtórzeń. Podaj wyniki jako średnie odchylenie standardowe (±SD) i istotność statystyczną na poziomie p<0,05.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych, nie mają nic do ujawnienia.

Zachowanie materiału biokompatybilności jest najbardziej wymaganym parametrem, który należy ocenić przed użyciem medycznym. Normy międzynarodowe obejmują wyroby medyczne ISO 1099333, a w szczególności materiały dentystyczne ISO 740534. Brak toksycznego wpływu na otaczające komórki jest kluczową normą w ocenie biokompatybilności takich materiałów. Dlatego tak duże znaczenie w ocenie biokompatybilności materiału stomatologicznegoma badanie cytotoksyczności 35-37. ISO zasugerowało, że metody testowania mogą opierać się na aktywności metabolicznej lub integralności błony. Wybrane punkty końcowe powinny spełniać określone warunki klasyfikacji działań niepożądanych wywołanych przez badany materiał w celu zminimalizowania czasu i kosztów testów oceniających. Obecna metoda badania (konfokalne obrazowanie poklatkowe 3D) opiera się na integralności membrany. Ocena cytotoksyczności za pomocą tego punktu końcowego wydaje się być cennym markerem biokompatybilności komórek z badanymi materiałami, a także jest to punkt końcowy zatwierdzony przez ISO. Testy in vitro mają na celu określenie, w jaki sposób próbka materiału wpływa na określony typ komórki. Kolorymetryczny test MTT został pierwotnie opisany przez Mossmana (1983) jako użyteczna metoda pomiaru cytotoksyczności in vitro i proliferacji komórek. Test MTT opiera się na przemianie soli tetrazolowej w kryształy formazanu przez aktywne komórki, co determinuje aktywność mitochondriów. Można to przełożyć na wskaźnik rentowności38. Gupta i współpracownicy poinformowali, że test MTT jest najczęściej stosowaną metodą pomiaru cytotoksyczności żywic kompozytowych. W tym samym celu zastosowano również dehydrogenazę bursztynową i fosfatazę alkaliczną39. Jednak komórki losu nie mogą być monitorowane, ponieważ test MTT wymaga zabicia komórek w każdym punkcie czasowym pomiaru. W celu dokładniejszego monitorowania zachowania barwionych komórek w obecnym badaniu, przeprowadzono bezpośrednią obserwację żywych komórek, dzięki poklatkowemu obrazowaniu CLSM połączonemu z barwieniem krótkim protokołem, automatyczną analizą obrazu i kwantyfikacją sygnału fluorescencyjnego.
Kompozyty dentystyczne mają bliski kontakt z tkankami jamy ustnej, zwłaszcza z komórkami dziąseł i miazgi miazgowej. Fibroblasty byłyby celem składników uwalnianych z tych kompozytów odtwórczych40-41. Co więcej, kilka badań wykazało, że unieśmiertelnione komórki i komórki pierwotne mogą mieć różne reakcje komórkowe w kontakcie z biomateriałami. Stwierdzono, że komórki pierwotne są bardziej odpowiednie do oceny wpływu biomateriałów42. Wyjaśnia to zastosowanie pierwotnych ludzkich komórek fibroblastów dziąseł jako modelu komórkowego do oceny cytotoksyczności badanego kompozytu dentystycznego w obecnym badaniu. Potencjał toksyczności substancji uwalnianych z kompozytu dentystycznego został szeroko przebadany43-44. W celu oceny potencjału cytotoksycznego materiałów można było przeprowadzić badania na dwóch modelowych komórkach kontaktowych. W systemie modelu bezpośredniego kontaktu materiał jest umieszczany bezpośrednio z komórkami docelowymi, podczas gdy w systemie kontaktu pośredniego komórki docelowe mają kontakt z elucjami z pożywek biologicznych. W zastosowaniach klinicznych i zabiegach odtwórczych kompozyty dentystyczne są umieszczane w pośrednim kontakcie z tkankami dziąseł. Z tego powodu obecny protokół eksperymentalny koncentrował się na systemie pośredniego kontaktu z ludzkimi fibroblastami dziąseł (komórkami w obecności badanych ekstraktów kompozytowych). Jak wcześniej informowali Dahl i współpracownicy, reakcje cytotoksyczne zostały sklasyfikowane jako ciężkie (<30%), umiarkowane (30-60%), lekkie (60-90%) lub niecytotoksyczne (>90%) w oparciu o aktywność w stosunku do wartości uzyskanych dla kontrolnych45. W związku z tym, zgodnie z tym rankingiem i w świetle uzyskanych wyników (tabela 1), kompozytowy ELS o bardzo niskim skurczu mógł być klasyfikowany jako bardzo nieznacznie cytotoksyczny i wykazywał porównywalne zachowanie do komórek kontrolnych przez cały okres upływu czasu. Stosując dokładnie tę samą metodę badawczą, wyniki tego badania można porównać z wynikami niedawno opublikowanego badania. Kompozyt ELS o bardzo niskim skurczu wykazał lepszą biokompatybilność w porównaniu z dwoma wcześniej testowanymi kompozytami stosowanymi do tego samego zastosowania klinicznego, czyli do odbudowy bezpośredniej11. Nadal potrzebne są dalsze badania, aby dokonać pełniejszego porównania.
Przy podejmowaniu decyzji, który test cytotoksyczności zatwierdzić do konkretnej oceny punktu końcowego, ważne jest, aby zrozumieć zalety i ograniczenia każdego testu. Głównym celem obrazowania konfokalnego jest uzyskanie trójwymiarowej architektury komórek i narządów. Technika jest w stanie odsłonić nie tylko powierzchnię okazu, ale także jego podpowierzchnię. Opisany w niniejszym dokumencie protokół podkreśla zastosowanie poklatkowego obrazowania konfokalnego 3D CLSM jako czułej metody oceny zachowania kompozytu dentystycznego w zakresie biokompatybilności in vitro. Jednakże, aby uniknąć ograniczeń napotkanych w tej pracy, można zastosować stacje robocze z powłoką antywibracyjną, aby umożliwić bardziej stabilne i dłuższe obrazowanie poklatkowe; Blat stołu może izolować zastosowany system konfokalny od szkodliwych skutków, jakie mogą powodować wibracje w laboratorium. Ponadto materiały przeznaczone do stosowania w jamie ustnej powinny być w idealnym przypadku nieszkodliwe dla tkanek dziąseł i nie powinny zawierać żadnych substancji, które mogłyby powodować toksyczność ogólnoustrojową. Zgodnie z zastosowaną metodyką i wynikami uzyskanymi z obecnego badania można stwierdzić, że badany kompozyt (ELS o bardzo niskim skurczu) nie jest cytotoksyczny w obecnych warunkach doświadczalnych. Z uwagi na to, że metoda CLSM może z dużą czułością określić początkową liczbę komórek zdolnych do życia, można przewidzieć inne możliwości oceny większej liczby punktów końcowych. W szczególności, ponieważ niedawno doniesiono, że monomery kompozytowe wpływają na komórki poprzez reaktywne formy tlenu (ROS)46-48, potrzebne są dalsze badania w celu oceny ewentualnych korelacji między sieciami sygnalizacji cytotoksyczności a produkcją ROS. Przyszły protokół może zostać zaprojektowany do jednoczesnej oceny produkcji ROS (barwienieH2O2i/lubO2-) oraz współczynnika cytotoksyczności (barwienie żywe/martwe) przy użyciu poklatkowego obrazowania CLSM.

Jednym z głównych standardów cytowanych w zaleceniach ISO określających biokompatybilność jest brak toksyczności materiału dla komórek. Kompozyty dentystyczne na bazie żywicy mogą uwalniać składniki z matrycy żywicznej, co początkowo może być spowodowane częściową polimeryzacją i/lub później procesami degradacji w czasie1-4. Te uwolnione składniki wchodzą w kontakt z tkankami jamy ustnej i mogą mieć różne wady, takie jak reakcje pokrzywkowe i błony śluzowej5, rozwój reakcji alergicznych i nadwrażliwości u pacjentów6, modyfikacje morfologii fibroblastów dziąseł i redukcja białka kolagenu typu I7, immunosupresja lub immunostymulacja proliferacji oczyszczonych limfocytów T i komórek śledziony pod wpływem mitogenów8 oraz uszkodzenia DNA w pierwotnych ludzkich fibroblastach dziąseł, co podkreśla ich potencjał genotoksyczny9. Na toksyczność kompozytu dentystycznego może wpływać wiele parametrów, takich jak odcień kompozytu, utwardzanie światłem, skład chemiczny monomeru żywicy, wypełniacz i stopień konwersji10-13. Ponieważ potencjał toksyczny materiałów in vitro może przewidywać sytuacje in vivo i może być porównywany z sytuacjami klinicznymi poprzez badanie niektórych istotnych punktów końcowych. Cytotoksyczność kompozytów dentystycznych i ich składników została szeroko oceniona przy użyciu systemów hodowli komórkowych14-16.
Te systemy in vitro zostały opracowane do oceny biokompatybilności kompozytów dentystycznych pod względem: wzrostu komórek i apoptozy komórek przy użyciu monocytów THP-1, takich jak komórki17, cytotoksyczności w ludzkich fibroblastach dziąseł18, potencjału zapalnego w keratynocytach HaCaT, takich jak komórki2, funkcjonalności komórek MDPC-23 podobnych do odontoblastów19, zmniejszenie całkowitego poziomu RNA i znaczny wzrost indukcji apoptozy na ludzkich keratynocytach dziąseł20 oraz uszkodzeń DNA na komórkach fibroblastów dziąseł i miazgi21.
Sugerowane są różne metodologie badania biokompatybilności kompozytów dentystycznych. Testy kolorymetryczne, które obejmują określone barwniki i pomiary adsorpcji światła, pozostają najczęściej stosowane, ze względu na ich względną prostotę i niski koszt22-26. Analiza mikroskopowa za pomocą kontrastu światła często pochłania więcej czasu i wiąże się z wyższymi kosztami. Jednak te techniki mikroskopowe mają kilka ważnych zalet. Obserwacja struktury komórki dostarcza rozszerzonych informacji o doświadczanych skutkach toksycznych, dostarczając w ten sposób bardziej istotnych i wrażliwych danych. W szczególności wprowadzenie mikroskopii konfokalnej27 pozwoliło na obserwację struktur biologicznych z lepszą rozdzielczością osiową w porównaniu z tradycyjnymi mikroskopami fluorescencyjnymi do obrazowania szerokokątnego. W związku z tym obrazowanie konfokalne stało się potężnym narzędziem śledczym w różnych dziedzinach badań medycznych i naukowych. W przeciwieństwie do technik mikroskopii elektronicznej, skaningowa mikroskopia konfokalna oferuje możliwość wizualizacji odrębnych składników komórek poprzez włączenie określonych markerów fluorescencyjnych. Większość z tych specyficznych znaczników jest stabilna w środowisku wodnym, rozsądnie mierzalna, niedroga i nietoksyczna28, co pozwala na ich zastosowanie zarówno w klinicznych, jak i laboratoryjnych badaniach naukowych. Co więcej, suszenie i utrwalanie próbki wymagane do konwencjonalnej analizy mikroskopii elektronicznej nie jest konieczne do poklatkowego obrazowania konfokalnego, dlatego możliwe jest również pobieranie próbek w zależności od czasu. W porównaniu z obrazowaniem dwuwymiarowym, zasada obrazowania konfokalnego umożliwia wizualizację próbki pod powierzchnią i trójwymiarową rekonstrukcję struktury na podstawie różnych uzyskanych obrazów głębi; co skutkuje bardziej precyzyjnymi i bardziej strukturalnymi szczegółami29, 30. Niniejsze badanie wideo jest przykładem zastosowania trójwymiarowej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej w trybie poklatkowym (3D-CLSM) w połączeniu z markerowaniem fluorescencyjnym żywym/martwym i kwantyfikacją sygnału jako innowacyjnej metody. Technika przedstawiona w tym artykule ma tę zaletę, że umożliwia czułą ocenę i obrazowanie poklatkowe żywych komórek bez zmiany ocenianej struktury komórki. Przed analizą konfokalną nie są wymagane żadne czynności przygotowawcze. Wcześniej to samo barwienie stosowano do oceny żywotności hodowanych rdzeni kości gąbczastej31, ale bez konfokalnego upływu czasu. Podobnie, tę samą poklatkową procedurę konfokalną zastosowano do oceny zabijania w czasie erytromycyny u bakterii osadu czynnego zgodnie z ich typem Grama32 przy użyciu specyficznego barwienia bakterii żywych/martwych. Metody te zostały niedawno zaadaptowane i wykorzystane do porównania toksyczności kompozytów dentystycznych na bazie monomerów metakrylanu11.

<table><tbody><tr><td>Olympus Fluoview FV10i&nbsp;</td><td>Mikroskop konfokalny</td> <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>O2/CO2 Inkubator</td><td>Pnasonic</td><td>MCO 5M</td><td>Zestaw do inkubacji żywych</td></tr><tr><td>/martwych</td><td>komórek Invitrogen&nbsp;</td><td>MP 03224</td><td>Bejca&nbsp;</td></tr><tr><td>ELS bardzo niski skurcz &nbsp;</td><td>Saremco&nbsp;</td><td></td><td>Kompozyt dentystyczny</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Sigma</td><td>D 6046</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>hodowlana Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td> system prowadnic <td>komory komórek zbierających</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>PAA</td><td>14220040X</td><td>Komora hodowlana</td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>Posiew komórkowy</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>PAA</td><td>P11-001</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>PAA</td><td>A11-101</td><td>Licznik komórek do hodowli</td></tr><tr><td>komórkowych</td><td>Merck Millipore</td><td>00110230TP1</td><td>Zliczanie komórek&nbsp;</td></tr></tbody></table>

konfokalne obrazowanie poklatkowe jako skuteczna metoda oceny cytozgodności kompozytów dentystycznych

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Ogólnie przyjmuje się, że interakcja materiału komórkowego in vitro jest użytecznym kryterium w ocenie biokompatybilności materiału dentystycznego. Celem pracy było wykorzystanie poklatkowego obrazowania konfokalnego 3D CLSM do oceny biokompatybilności in vitro kompozytów dentystycznych. Metoda ta zapewnia dokładne i czułe wskazanie dawki żywotnych komórek w kontakcie z kompozytowymi ekstraktami dentystycznymi. Jako przykład podano ELS o bardzo niskim skurczu, kompozyt dentystyczny stosowany do bezpośredniej odbudowy. Ocenę in vitro przeprowadzono na hodowanych pierwotnych ludzkich komórkach fibroblastów dziąseł przy użyciu barwienia żywych/martwych. Obrazy uzyskano za pomocą konfokalnego biologicznego odwróconego systemu FV10i i przeanalizowano za pomocą oprogramowania FV10-ASW 3.1. Analiza obrazu wykazała bardzo niewielką cytotoksyczność w obecności badanego kompozytu po upływie 5 godzin. Wykazano nieznaczny spadek żywotności komórek w kontakcie z badanymi ekstraktami kompozytowymi w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Wyniki podkreśliły zastosowanie obrazowania poklatkowego 3D CLSM jako czułej metody jakościowej i ilościowej oceny zachowania biokompatybilności kompozytów dentystycznych.

Rysunek 1 przedstawia przegląd komórek barwionych metodą Live/Dead na uzyskanych obrazach mapowania (obiektyw 10X) zarówno dla grupy kontrolnej, jak i komórek eksponowanych na badane ekstrakty kompozytowe (ELS extra low shrinkage). Trójwymiarową strukturę komórek można było zwizualizować przy powiększeniu 600X. Wizualizacja komórek zebranych w komorze kontrolnej oraz komórek zebranych w komorze w obecności badanych ekstraktów kompozytowych została przedstawiona na Rysunku 2. Maksymalna projekcja (obiektyw 60X) pokazuje losy wybranych populacji komórek na początku odstępu czasu (w 15 min) oraz na końcu okresu time-lapse (w 5 hr). W tym okresie uzyskano pięćdziesiąt siedem stosów obrazów (skan xyzt mod, 39 obrazów na stos, głębokość woksela 1.00 μm). W komórkach eksponowanych odnotowano niewielki spadek sygnału fluorescencji zielonej i bardzo niewielkie zmiany w fluorescencji czerwonej. W przypadku komórek kontrolnych nie zaobserwowano istotnych zmian. Komórki eksponowane na ekstrakty kompozytowe przyjęły podobną morfologię wrzecionowatą co komórki kontrolne; morfologia nie uległa zmianie w tych warunkach eksperymentalnych (pomimo spadku sygnału zielonego i wzrostu sygnału czerwonego w obecności badanego kompozytu). Analiza obrazu została przeprowadzona na pięciu wybranych, różnych stosach obrazów odpowiadających różnym populacjom komórek z uzyskanych obrazów dla badanego kompozytu w porównaniu z kontrolnymi komórkami negatywnymi, zarówno dla sygnału zielonego, jak i czerwonego. Profil intensywności zbarwionych komórek zilustrowano na Rysunku 3; ewolucja sygnału zielonego i czerwonego w komórkach w kontakcie z badanym kompozytem była porównywalna do komórek kontrolnych. Intensywności emisji fluorescencji kalceiny i EthD-1 mierzono w komórkach kontrolnych oraz komórkach eksponowanych na kompozyt. Pomiary wykonywano w odstępach godzinnych do 5 hr. Stosunek fluorescencji zielonej do czerwonej (na podstawie zintegrowanych intensywności sygnałów zielonego 495-515 nm i czerwonego 620-650 nm) obliczono w okresie time-lapse. Współczynniki żywotności dla komórek kontrolnych i komórek eksponowanych na ekstrakty ELS extra low shrinkage przedstawiono w Tabeli 1. W obecności badanego kompozytu stwierdzono, że odsetek żywych komórek nieznacznie spadł ze 100% do 93,9% po 1 hr kontaktu. Istotna różnica została zaobserwowana między badanym kompozytem a kontrolą negatywną (komórki bez żadnych ekstraktów kompozytowych) po 5 hr wskazanego okresu time-lapse.
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej kultur komórkowych, przedstawiające organizację cytoszkieletu, skala 100μm." src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd obrazu mapowania przedstawiający barwione komórki przy obiektywie 10X, (A) komórki kontrolne oraz (B) komórki w obecności ekstraktów kompozytowych (ELS o bardzo niskim skurczu) na początku okresu obserwacji (t = 15 min). Obszary zielone to żywe komórki, a obszary czerwone to komórki uszkodzone. W warunkach tego eksperymentu nie zaobserwowano różnic (zarówno w przypadku fluorescencji zielonej, jak i czerwonej) pomiędzy komórkami eksponowanymi na kompozyty a komórkami kontrolnymi negatywnymi.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, morfologia komórek, rusztowanie z macierzy kolagenowej, adhezja komórkowa, sieć komórkowa." src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obrazy CLSM wykonane przy użyciu obiektywu 60X dla populacji komórek z (A) komory kontrolnej oraz (B) komory z ekstraktami kompozytowymi na początku i na końcu okresu ekspozycji w trybie time-lapse (odpowiednio I: 15 min i II: 5 hr). Obszary zielone to komórki żywe, a obszary czerwone to komórki uszkodzone. Panel obrazów wykazał niewielką zmianę intensywności sygnału (lekką Decrease sygnału zielonego i bardzo niewielki wzrost sygnału czerwonego). W obecności ekstraktów kompozytowych nie zaobserwowano zmian w morfologii komórek; komórki eksponowane zachowały wrzecionowaty i fibroblastyczny kształt, analogicznie do komórek kontrolnych.
<img alt="Wykresy poziomu koloru w funkcji pozycji; poziomy czerwony i zielony; analiza spektralna; wykresy danych; wyniki eksperymentu." src="/files/ftp_upload/51949/51949fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Profil liniowy komórek obserwowanych w mikroskopii poklatkowej. (A) Komórki kontrolne (B) Komórki eksponowane na ekstrakty kompozytowe, (I) po 15 min i (II) po 5 hr. Nie zaobserwowano widocznych zmian w ewolucji sygnału zielonego w obecności badanego kompozytu, niezależnie od czasu kontaktu. Jednakże, po 5 hr kontaktu w obecności kompozytu odnotowano niewielki wzrost sygnału czerwonego.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Czas kontaktu (godzina)</td>
			<td colspan="5">Żywotność komórek (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komórki kontrolne</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELS o bardzo niskim skurczu®</td>
			<td>93.9 ±7</td>
			<td>91.3±5*</td>
			<td>89.5±3*</td>
			<td>87.6±2*</td>
			<td>87.7±3*</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Szybkość ewolucji żywych komórek HGF po 1, 2, 3, 4 i 5 h kontaktu z ekstraktami kompozytowymi. Żywotność komórek oznaczono metodą barwienia z użyciem zestawu do badania cytotoksyczności Live/Dead. Dane przedstawiają wartości średnie ± SD z analizy pięciu stosów obrazów. Wartości różnią się istotnie od komórek kontrolnych przy p &lt;0,05.

Najbardziej badanym aspektem biokompatybilności kompozytów dentystycznych jest ich cytotoksyczność, obrazowanie poklatkowe 3D CLSM w połączeniu z kwantyfikacją sygnału fluorescencyjnego pozwala na czułą ocenę losu komórki w czasie. Wykorzystanie tej metody może być skutecznym narzędziem do oceny cytokompatybilności kompozytów dentystycznych.

Konfokalne obrazowanie poklatkowe jako skuteczna metoda oceny cytozgodności kompozytów dentystycznych

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej 3D do obrazowania poklatkowego w celu jakościowej i ilościowej oceny biokompatybilności kompozytów dentystycznych in vitro. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw sferycznych próbek nieutwardzonego kompozytu dentystycznego w drugim etapie. Ludzkie fibroblasty dziąseł są hodowane w obecności lub bez tych ekstraktów kompozytowych, a następnie komórki są znakowane żywym martwym barwnikiem.Następnie generowane są obrazy map kultur komórkowych i tworzone są obrazy nakładkowe dla obszarów zainteresowania. Ostatecznie różnice w zachowaniu komórek w czasie rzeczywistym, które występują w obecności lub braku badanych kompozytów, mogą być monitorowane zgodnie ze zmianami w zielonych lub czerwonych sygnałach fluorescencyjnych obserwowanych na obrazach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia monitorowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym bez wywoływania zmian w strukturze komórki.Nie są wymagane żadne etapy utrwalania ani suszenia po barwieniu komórek lub przed obserwacją poklatkową. Aby przygotować ekstrakt kompozytowy, zacznij od użycia specjalnego uchwytu o promieniu dwóch milimetrów, aby utworzyć kuliste próbki nieutwardzonego kompozytu dentystycznego. Przenieś próbki do indywidualnych studzienek sześciodołkowej płytki zawierającej jeden mililitr pożywki hodowlanej, uważając, aby pozostawić kilka studzienek z samą pożywką do kontrolnych hodowli komórkowych, a następnie umieść lampę LED o natężeniu 1070 miliwatów centymetrów kwadratowych w odległości 0,5 milimetra od próbek.Utwardzaj próbki przez 40 sekund, aby symulować tymczasowy kontakt między zębami a niepielęgnowanym kompozytem dentystycznym, a następnie inkubuj próbki kompozytowe przez 24 godziny w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zmieniaj pożywkę co trzy dni i pasażuj komórki co pięć dni. Następnie, gdy kultura osiągnie płynność, zbierz komórki i wiruj je przez pięć minut w temperaturze 90 razy G i 37 stopni Celsjusza.Ponownie zawiesić osad w pożywce hodowlanej, a następnie po zliczeniu komórek wysiać zawiesinę komórkową o gęstości komórek 2,5 razy 10 do czwartej komórki na mililitr w systemie szkiełek komorowych przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Następnego ranka zastąp pożywkę w dwóch dołkach szkiełka komorowego jednym mililitrem badanych ekstraktów kompozytowych i umieść szkiełko z powrotem w inkubatorze, aby zobrazować komórki za pomocą konfokalu. Obrazowanie poklatkowe.Najpierw oznaczyć kompozytowe komórki z kokulturą i komórkami kontrolnymi żywym martwym barwnikiem cytotoksyczności dla komórek eukariotycznych zgodnie z instrukcjami producenta. 15 minut po barwieniu umieść szkiełko komory w ciemności w zintegrowanej komorze konfokalnej w warunkach hodowli komórkowej i rozgrzej lasery 473 nanometrowe i 559 nanometrów. Następnie użyj detektora z nowo opracowanym widmem, aby automatycznie ustawić warunki obrazowania dla lasera o długości 473 nanometrów.Użyj funkcji kadrowania i powiększania, aby wybrać obszar zainteresowania, a następnie wybierz tryb obserwacji. Wybierz do pięciu typów trybów obserwacji, w tym poklatkowy Zack i wieloobszarowy w zależności od potrzeb, a następnie szybko przechwyć pięć obrazów mapy za pomocą lasera 473 nm pod obiektywem 10x zarówno dla próbki testowej, jak i komórek kontrolnych, gdy żądane obrazy zostaną uzyskane. Przełącz się na laser o długości fali 559 nanometrów i uchwyć obrazy komórki przy drugiej fluorescencji, jak pokazano poniżej.Alternatywnie, nałóż obrazy fluorescencyjne i kontrastowe światło, używając wybranego punktu na ekranie na żywo X 60, aby obserwować magazyn obrazów na żywo. Obrazy map w formacie obrazu Olympus do analizy sygnału i maksymalnych obrazów projekcyjnych to 24 bity na piksel. Pliki TIFF wykorzystują następnie różne narzędzia analityczne do pomiaru profilu intensywności sygnału i stosunku intensywności między dwoma kanałami fluorescencyjnymi.Na koniec przeanalizuj różnice w sygnalizacji komórek fluorescencyjnych między dwiema grupami za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Na tych obrazach mapowych żywych komórek barwiących TED w samym pożywce lub wystawionych na działanie ekstraktu kompozytowego nie zaobserwowano żadnych różnic w żywotności komórek po 15 minutach okresu upływowego. W tym przypadku maksymalne obrazy projekcyjne komórek kontrolnych pokazują powiększony los komórek w ciągu pierwszych 15 minut, a pięć godzin później, pod koniec okresu upływowego, jak zaobserwowano, nie było znaczącej zmiany we fluorescencji w komórkach kontrolnych w okresie inkubacji.Komórki ELS o bardzo niskim skurczu przyjmowały podobną morfologię wrzeciona do komórek kontrolnych, ale wykazywały niewielki spadek zielonego sygnału fluorescencyjnego i bardzo niewielki wzrost czerwonej fluorescencji pod koniec okresu poklatkowego. Profil intensywności barwionych komórek zilustrowano na tych wykresach, na których zmierzono intensywność emisji fluorescencji homodimeru śródbłonka wapnia na komórkach kontrolnych i złożonych w odstępach godzinnych przez okres do pięciu godzin. Nie zaobserwowano istotnych różnic w sygnalizacji między obiema kulturami.Współczynniki żywotności dla kontrolnych i odsłoniętych komórek złożonych przedstawiono w tabeli. W obecności badanego kompozytu stwierdzono, że odsetek żywych komórek nieznacznie zmniejszył się ze 100 do 93,9% po godzinie kontaktu po pięciu godzinach. Zaobserwowano istotne różnice w żywotności komórek pomiędzy badanym kompozytowym ELS, bardzo niskim skurczem a ujemnymi kulturami komórkowymi pomimo niecytotoksyczności kompozytu.Przedstawione dane wskazują na zastosowanie konfokalnego obrazowania poklatkowego jako dokładnej i czułej metody oceny zachowania fibroblastów genu w kontakcie z kompozytami zębowymi po jego rozwinięciu. Ta metoda jest prywatnym sposobem dla naukowców w dziedzinie toksykologii na badanie cytotoksyczności i oceny ryzyka materiałów dentystycznych, leków, substancji chemicznych i innych wyrobów medycznych.

confocal-time-lapse-imaging-as-an-efficient-method-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Parker, J. J., et al. Organtypowy model hodowli plastrów glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia obrazowanie wycinków tkanki glejaka wykazujących ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obrazy o wysokiej rozdzielczości są rejestrowane w stałych odstępach czasu w celu śledzenia ruchu i kierunku komórek nowotworowych.

Obrazowanie migracji komórek nowotworowych w tkance glejaka za pomocą poklatkowej skaningowej mikroskopii konfokalnej

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

W tym badaniu omówione zostanie użycie urządzenia do ładowania in situ w połączeniu z mikro-rentgenowską tomografią komputerową do biomechaniki stawów włóknistych. Odczyty doświadczalne identyfikujące się z ogólną zmianą biomechaniki stawów będą obejmowały: 1) siłę reakcyjną w funkcji przemieszczenia, tj. przemieszczenie zęba w obrębie zębodołu i jego reakcję reakcyjną na obciążenie, 2) trójwymiarową (3D) konfigurację przestrzenną i morfometrię, tj. zależność geometryczną zęba względem zębodołu...

In situ Obciążenie kompresyjne i korelacyjne nieinwazyjne obrazowanie stawu włóknistego kość-więzadło przyzębia-ząb

Aby zrozumieć przestrzenny rozwój naprężeń skurczowych polimeryzacji w uzupełnieniach z żywicy i kompozytu dentystycznego, użyto Cyfrowej Korelacji Obrazu, aby zapewnić pomiar przemieszczenia/odkształcenia pełnego pola odtworzonych modelowych wnęk szklanych poprzez korelację obrazów uzupełnienia wykonanych przed i po polimeryzacji.

Skurcz kompozytu dentystycznego w symulowanej ubytku mierzony za pomocą cyfrowej korelacji obrazu

Tutaj prezentujemy protokół oceny tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i cyrkonowych dla łączników protez dentystycznych, w tym analizę żywotności komórek bakteryjnych i cech morfologicznych. Do analizy biofilmu w jamie ustnej wykorzystuje się model in situ związany z potężnymi technikami mikroskopowymi.

Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Technika identyfikacji wspomagana fluorescencją jest praktycznym, szybkim i niezawodnym podejściem do odróżniania uzupełnień z żywicy kompozytowej od substancji zęba i ułatwia minimalnie inwazyjne i całkowite usunięcie uzupełnień z żywicy kompozytowej i kompozytowych szyn urazowych.

Wykrywanie i usuwanie żywicy kompozytowej w kolorze zęba za pomocą techniki identyfikacji wspomaganej fluorescencją

Ta metodologia pozwala na nałożenie aparatu dentystycznego na dowolną próbkę pod dowolnym kątem z ustandaryzowaną siłą i stabilnością. Podejście to może być szeroko stosowane w naukach o zdrowiu w celu standaryzacji wpływu sprzętu dentystycznego z elementami trzymającymi w ręku, takimi jak mikrosilniki, turbiny i skalery ultradźwiękowe, na różnych powierzchniach.

Wpływ chropowatości piezoelektrycznego skalera dentystycznego na dwa różne płynne kompozytowe materiały wypełniające

Przedstawiamy nowatorskie podejście do ilościowego określania lokalizacji nanocząsteczek w naczyniach krwionośnych ludzkich guzów ksenoprzeszczepionych z wykorzystaniem dynamicznego obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym w modelu zarodka ptaka.

Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Poznaj metodę konfokalnego obrazowania poklatkowego do oceny cytozgodności kompozytów dentystycznych z wykorzystaniem ludzkich fibroblastów dziąsłowych. Technika umożliwia monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym bez konieczności ich utrwalania.

Konfokalne obrazowanie poklatkowe jako skuteczna metoda oceny cytozgodności kompozytów dentystycznych

Przeglądaj więcej filmów