Konfokalne obrazowanie poklatkowe jako skuteczna metoda oceny cytozgodności kompozytów dentystycznych

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej 3D do obrazowania poklatkowego w celu jakościowej i ilościowej oceny biokompatybilności kompozytów dentystycznych in vitro. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw sferycznych próbek nieutwardzonego kompozytu dentystycznego w drugim etapie. Ludzkie fibroblasty dziąseł są hodowane w obecności lub bez tych ekstraktów kompozytowych, a następnie komórki są znakowane żywym martwym barwnikiem.

Następnie generowane są obrazy map kultur komórkowych i tworzone są obrazy nakładkowe dla obszarów zainteresowania. Ostatecznie różnice w zachowaniu komórek w czasie rzeczywistym, które występują w obecności lub braku badanych kompozytów, mogą być monitorowane zgodnie ze zmianami w zielonych lub czerwonych sygnałach fluorescencyjnych obserwowanych na obrazach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia monitorowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym bez wywoływania zmian w strukturze komórki.

Nie są wymagane żadne etapy utrwalania ani suszenia po barwieniu komórek lub przed obserwacją poklatkową. Aby przygotować ekstrakt kompozytowy, zacznij od użycia specjalnego uchwytu o promieniu dwóch milimetrów, aby utworzyć kuliste próbki nieutwardzonego kompozytu dentystycznego. Przenieś próbki do indywidualnych studzienek sześciodołkowej płytki zawierającej jeden mililitr pożywki hodowlanej, uważając, aby pozostawić kilka studzienek z samą pożywką do kontrolnych hodowli komórkowych, a następnie umieść lampę LED o natężeniu 1070 miliwatów centymetrów kwadratowych w odległości 0,5 milimetra od próbek.

Utwardzaj próbki przez 40 sekund, aby symulować tymczasowy kontakt między zębami a niepielęgnowanym kompozytem dentystycznym, a następnie inkubuj próbki kompozytowe przez 24 godziny w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zmieniaj pożywkę co trzy dni i pasażuj komórki co pięć dni. Następnie, gdy kultura osiągnie płynność, zbierz komórki i wiruj je przez pięć minut w temperaturze 90 razy G i 37 stopni Celsjusza.

Ponownie zawiesić osad w pożywce hodowlanej, a następnie po zliczeniu komórek wysiać zawiesinę komórkową o gęstości komórek 2,5 razy 10 do czwartej komórki na mililitr w systemie szkiełek komorowych przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Następnego ranka zastąp pożywkę w dwóch dołkach szkiełka komorowego jednym mililitrem badanych ekstraktów kompozytowych i umieść szkiełko z powrotem w inkubatorze, aby zobrazować komórki za pomocą konfokalu. Obrazowanie poklatkowe.

Najpierw oznaczyć kompozytowe komórki z kokulturą i komórkami kontrolnymi żywym martwym barwnikiem cytotoksyczności dla komórek eukariotycznych zgodnie z instrukcjami producenta. 15 minut po barwieniu umieść szkiełko komory w ciemności w zintegrowanej komorze konfokalnej w warunkach hodowli komórkowej i rozgrzej lasery 473 nanometrowe i 559 nanometrów. Następnie użyj detektora z nowo opracowanym widmem, aby automatycznie ustawić warunki obrazowania dla lasera o długości 473 nanometrów.

Użyj funkcji kadrowania i powiększania, aby wybrać obszar zainteresowania, a następnie wybierz tryb obserwacji. Wybierz do pięciu typów trybów obserwacji, w tym poklatkowy Zack i wieloobszarowy w zależności od potrzeb, a następnie szybko przechwyć pięć obrazów mapy za pomocą lasera 473 nm pod obiektywem 10x zarówno dla próbki testowej, jak i komórek kontrolnych, gdy żądane obrazy zostaną uzyskane. Przełącz się na laser o długości fali 559 nanometrów i uchwyć obrazy komórki przy drugiej fluorescencji, jak pokazano poniżej.

Alternatywnie, nałóż obrazy fluorescencyjne i kontrastowe światło, używając wybranego punktu na ekranie na żywo X 60, aby obserwować magazyn obrazów na żywo. Obrazy map w formacie obrazu Olympus do analizy sygnału i maksymalnych obrazów projekcyjnych to 24 bity na piksel. Pliki TIFF wykorzystują następnie różne narzędzia analityczne do pomiaru profilu intensywności sygnału i stosunku intensywności między dwoma kanałami fluorescencyjnymi.

Na koniec przeanalizuj różnice w sygnalizacji komórek fluorescencyjnych między dwiema grupami za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Na tych obrazach mapowych żywych komórek barwiących TED w samym pożywce lub wystawionych na działanie ekstraktu kompozytowego nie zaobserwowano żadnych różnic w żywotności komórek po 15 minutach okresu upływowego. W tym przypadku maksymalne obrazy projekcyjne komórek kontrolnych pokazują powiększony los komórek w ciągu pierwszych 15 minut, a pięć godzin później, pod koniec okresu upływowego, jak zaobserwowano, nie było znaczącej zmiany we fluorescencji w komórkach kontrolnych w okresie inkubacji.

Komórki ELS o bardzo niskim skurczu przyjmowały podobną morfologię wrzeciona do komórek kontrolnych, ale wykazywały niewielki spadek zielonego sygnału fluorescencyjnego i bardzo niewielki wzrost czerwonej fluorescencji pod koniec okresu poklatkowego. Profil intensywności barwionych komórek zilustrowano na tych wykresach, na których zmierzono intensywność emisji fluorescencji homodimeru śródbłonka wapnia na komórkach kontrolnych i złożonych w odstępach godzinnych przez okres do pięciu godzin. Nie zaobserwowano istotnych różnic w sygnalizacji między obiema kulturami.

Współczynniki żywotności dla kontrolnych i odsłoniętych komórek złożonych przedstawiono w tabeli. W obecności badanego kompozytu stwierdzono, że odsetek żywych komórek nieznacznie zmniejszył się ze 100 do 93,9% po godzinie kontaktu po pięciu godzinach. Zaobserwowano istotne różnice w żywotności komórek pomiędzy badanym kompozytowym ELS, bardzo niskim skurczem a ujemnymi kulturami komórkowymi pomimo niecytotoksyczności kompozytu.

Przedstawione dane wskazują na zastosowanie konfokalnego obrazowania poklatkowego jako dokładnej i czułej metody oceny zachowania fibroblastów genu w kontakcie z kompozytami zębowymi po jego rozwinięciu. Ta metoda jest prywatnym sposobem dla naukowców w dziedzinie toksykologii na badanie cytotoksyczności i oceny ryzyka materiałów dentystycznych, leków, substancji chemicznych i innych wyrobów medycznych.