Name: Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnej kwantyfikacji komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia analizę struktury biofilmów po zastosowaniu środków przeciwbakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego badania zostało zapewnione przez National Institutes of Health/NIDCR grant 1R15DE019566-01A1. Dr. Jim Henthorn (OUHSC Flow and Image Cytometry Laboratory) jest znany z udzielania pomocy technicznej w zakresie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Dr Fernando Esteban Florez (Departament Materiałów Dentystycznych) jest znany z udzielania pomocy technicznej podczas kręcenia tego filmu.

1. Przygotowanie pożywek i odczynników
<ol>
	<li>Przygotować 300 ml pożywki do hodowli nocnej (THY; 3% bulion Todd Hewitt przygotowany zgodnie z instrukcją producenta, uzupełniony o 0,3% ekstraktu drożdżowego w wodzie ultrapurej) i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 1 L agaru THY (3% bulion Todd Hewitt, 0,3% ekstraktu drożdżowego oraz 1,5% agaru w wodzie ultrapurej), wysterylizować w autoklawie i schłodzić do 60 °C przed rozlaniem do szalek Petriego. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 150 ml pożywki do wzrostu biofilmu (0,5X TY uzupełnione o 10 mM sacharozy; 1,5% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego i 10 mM sacharozy w wodzie ultrapurej) i wysterylizować za pomocą filtracji. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 miesiąca.</li>
	<li>Przygotować 1 L soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 oraz 0,24 g KH2PO4 w wodzie ultrapurej) i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 600 ml 10 mM buforu Tris HCl uzupełnionego o 10 mM CaCl2 w wodzie ultrapurej (bufor TC; pH 7,2) i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Wysterylizować w autoklawie 1 L wody ultrapurej. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Wykonaj dyskowate próbki kompozytów dentystycznych Point 4 (PF) oraz TPH3 (TP) w dedykowanej formie ze stali nierdzewnej, nakładając materiał w dwóch warstwach. Każdą warstwę utwardzaj światłem przez 40 sec za pomocą polimeryzatora LED. Oba produkty mają nieco inny skład i poziom napełnienia, co skutkuje powstaniem różnych topografii powierzchni, na których będą hodowane biofilmy.
	<ol>
		<li>Zamiast kroku 2.1 można wykonać próbki odpowiednich podłoży zgodnie z uznanymi protokołami z innych dyscyplin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykończ i wypoleruj próbki do uzyskania akceptowalnej końcowej gładkości powierzchni, np. używając półautomatycznej polerki szlifierskiej. Opłucz wypolerowane próbki wodą ultrapure i osusz sprężonym powietrzem.</li>
	<li>Zesterylizuj próbki za pomocą tlenku etylenu lub alternatywnej metody sterylizacji.</li>
</ol>
3. Wzrost biofilmu
<ol>
	<li>Zaszczep pojedynczą kolonię S. mutans do 4 ml podłoża hodowlanego do inkubacji nocnej (krok 1.1). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przez 16-18 hr. Gęstość optyczna (OD600) kultury powinna wynosić ≥0.9.
	<ol>
		<li>Zaleca się użycie kolonii z kultur na płytkach, które zostały przepaszowane 2x z oryginalnego banku, ponieważ zapewnia to bardziej spójny wzrost biofilmu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie 1:100, używając kultury z inkubacji nocnej (krok 1.1) w 10 ml podłoża do wzrostu biofilmu (krok 1.3).</li>
	<li>Przenieść sterylne próbki kompozytu żywicznego (np. PF, TP) do sterylnych płytek 12-dołkowych.</li>
	<li>Dodać 2.5 ml rozcieńczonego podłoża hodowlanego (krok 3.2) do dołków dla grup badawczych (płyn do płukania jamy ustnej) i kontrolnych. Do dołków kontroli sterylności dodać 2.5 ml sterylnego, niezaszczepionego podłoża do wzrostu biofilmu.</li>
	<li>Hodować biofilmy w warunkach mikroaerofilnych. Umieścić płytki na wytrząsarce przy 100 rpm w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 24 hr.</li>
	<li>Po 24 hr aseptycznie odessać podłoże ze wszystkich dołków i przemyć dwukrotnie sterylnym PBS (krok 1.4; 2.5 ml/dołek), odsysając PBS po każdym przemyciu. Dodać 2.5 ml świeżego podłoża do wzrostu biofilmu do każdego dołka i inkubować przez kolejne 24 hr w tych samych warunkach co w poprzednim kroku, aby całkowity czas wzrostu biofilmu wyniósł 48 hr.</li>
	<li>Zamiast powyższych kroków, biofilmy innych gatunków można hodować na podłożach zgodnie z uznanymi protokołami.</li>
</ol>
4. Zabiegi antybakteryjne/płukanki do ust
<ol>
	<li>Odessać pożywkę po zakończeniu wzrostu biofilmu.</li>
	<li>Do dołków grup traktowanych dodać 2,5 ml płynu do płukania jamy ustnej Biotène PBF (BIO) lub Listerine Total Care (LTO), bądź zastosować inną metodę terapii, a do dołka grupy kontrolnej dodać 2,5 ml sterylnej wody ultrapure. Zanurzyć próbki na 60 s, zgodnie z instrukcjami producenta, wytrząsając płytki na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 rpm. Natychmiast odessać zarówno płyn do płukania jamy ustnej, jak i wodę ultrapure z dołków.</li>
	<li>Przemyć próbki 5-krotnie przez 15 s podczas każdego płukania sterylną wodą ultrapure na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 rpm, odsysając wodę po każdym etapie mycia.</li>
	<li>Zamiast powyższych kroków można przetestować inne środki przeciwbakteryjne, korzystając z uznanych protokołów.</li>
</ol>
5. Barwienie
<ol>
	<li>Przygotuj rozcieńczenia barwników do analizy biofilmu.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór zapasowy Concanavalin A, koniugatu Alexa Fluor 647 (AF) o stężeniu 5 mg/ml w 0,1 M wodorowęglanie sodu pH 8,3. Przechowuj w temperaturze -20 °C w jednorazowych alikwotach przez kilka miesięcy, ponieważ odradza się zamrażanie i rozmrażanie. Z tego roztworu zapasowego AF przygotuj rozcieńczenie 250 μg/ml w buforze TC.</li>
		<li>Przygotuj rozcieńczenie 10 μM, wykorzystując dostarczony przez producenta roztwór zapasowy Syto 9 (SY) o stężeniu 5 mM, w buforze TC. Pozostały roztwór zapasowy SY przechowuj w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
		<li>Przygotuj rozcieńczenie 10x, wykorzystując dostarczony przez producenta roztwór zapasowy Sypro Red (SR) o stężeniu 5,000x, w sterylnej wodzie ultrapure. Pozostały roztwór zapasowy SR przechowuj w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyj wszystkie biofilmy 2x buforem TC (2,5 ml/dołek), delikatnie kołysząc płytką; drugą porcję buforu pozostaw w płytce na 30 min w temperaturze pokojowej. Odessij płyn.</li>
	<li>Nanieś kroplę 50 μl barwnika AF na każdy preparat biofilmu. Barw przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przemyj 2x buforem TC (2,5 ml/dołek), odsysając płyn po każdym płukaniu.</li>
	<li>Następnie nanieś kroplę 50 μl barwnika SY na każdy preparat biofilmu. Barw przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przemyj 2x sterylną wodą ultrapure (2,5 ml/dołek), odsysając płyn po każdym płukaniu.</li>
	<li>Na koniec nanieś kroplę 50 μl barwnika SR na każdy preparat biofilmu. Barw przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przemyj 3x sterylną wodą ultrapure (2,5 ml/dołek), odsysając płyn po każdym płukaniu.</li>
	<li>Przenieś preparaty do płytki 6-dołkowej, umieszczając jeden preparat na dołek w 6 ml sterylnej wody ultrapure w celu ułatwienia mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>
6. Obrazowanie z wykorzystaniem konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej
<ol>
	<li>Należy pozyskać obrazy każdego komponentu (barwienia) w obrębie biofilmów grup badawczej i kontrolnej, korzystając z ustawień konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego przedstawionych w Tabeli 1. W niniejszym badaniu wykorzystano obiektyw imersyjny 63X z aperturą numeryczną 0,9 i odległością roboczą 2,2 mm. 
	<img alt="Schemat barwienia biofilmu; długości fal lasera (nm) i pasma emisji (nm) dla EPS, kwasów nukleinowych, białek." fo:content-width="4.75in" src="/files/ftp_upload/50639/50639table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
	Tabela 1. Ustawienia konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.</li>
</ol>

<ol start="2">
	<li>Ustaw rozmiar skanowania na 250 μm x 250 μm oraz minimalną rozdzielczość pikseli na 512 x 512, aby pozyskać obrazy CLSM w rozdzielczości odpowiedniej do analizy ilościowej.</li>
	<li>Użyj barwnika SY do wyznaczenia górnego i dolnego punktu stosu obrazów biofilmu, a następnie ustaw krok z (z-step) odpowiedni do analizy ilościowej (0,6 μm w niniejszym badaniu). Przed rozpoczęciem skanowania zoptymalizuj parametry obrazu i barwienia (i.e. napięcie PMT i offset) za pomocą opcji QLUT. Użyto tablicy kolorów (look-up table), aby przypisać pseudokolory do każdego barwnika (zielony dla SY, czerwony dla SR i niebieski dla AF), w celu zwiększenia rozróżnialności poszczególnych komponentów biofilmu w rekonstrukcji 3D.</li>
	<li>Pozyskaj obrazy CLSM przy częstotliwości 400 Hz, stosując skanowanie sekwencyjne w trybie „between stacks”, aby zoptymalizować rejestrację obrazów wielu barwników w obrębie tego samego biofilmu.</li>
</ol>
7. Analiza strukturalna biofilmu
<ol>
	<li>Przeanalizuj obrazy CLSM za pomocą oprogramowania do analizy obrazów biofilmu. Poniższe kroki opisują zastosowanie oprogramowania ISA3D12 w celu obliczenia parametrów strukturalnych zebranych obrazów biofilmu.
	<ol>
		<li>Skopiuj pliki obrazów CLSM dla każdego biofilmu do folderu Images, zgodnie z instrukcją oprogramowania. Upewnij się, że stosowana jest konwencja nazewnictwa plików CLSM wymagana przez program. Oprogramowanie umożliwia analizę plików w podfolderach w trybie wsadowym, co ułatwia analizę biofilmów z grup badawczych i kontrolnych w jednym przebiegu.</li>
		<li>Wprowadź wymiary osi x, y i z obrazów CLSM w polach dxy oraz dz głównego okna dialogowego. Wybierz ustawienia progu (threshold) i mapowania odległości zgodnie z opisem w instrukcji oprogramowania (w niniejszym badaniu zastosowano odpowiednio metodę Otsu oraz Quasi-Euclidean). Wprowadź odpowiednią nazwę pliku wyników, a następnie uruchom program. W folderze ISA zostanie utworzony plik z wynikami.</li>
		<li>Przejrzyj plik wyników, aby uzyskać wartości dla dwudziestu parametrów strukturalnych 3D12, takich jak biovolume oraz średnia grubość biofilmu (zmierzona w niniejszym badaniu), które kwantyfikują rozkład 3D każdego składnika (barwnika) w obrębie biofilmu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Wizualizacja struktury biofilmu
<ol>
	<li>Utworzyć rekonstrukcję nałożonych na siebie komponentów (barwień) w obrębie każdego biofilmu przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Poniższe kroki opisują wykorzystanie oprogramowania Volocity do tworzenia rekonstrukcji 3D.
	<ol>
		<li>Utworzyć bibliotekę dla każdego biofilmu poprzez skopiowanie plików obrazów CLSM do oprogramowania, zgodnie z opisem w instrukcji.</li>
		<li>Użyć opcji menu 3D Renderer w celu wygenerowania zrekonstruowanego obrazu 3D z obrazów CLSM każdego biofilmu (w niniejszym badaniu zastosowano format HR Opacity).</li>
		<li>Obrócić obraz 3D tak, aby zorientować wszystkie biofilmy w podobny sposób względem osi współrzędnych x, y i z. Wykonać migawkę poprawnie zorientowanej rekonstrukcji biofilmu, a następnie wyeksportować migawkę w formacie TIFF, JPEG lub innym odpowiednim formacie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić analizę wizualną współwystępowania EPS, białek i komponentów kwasów nukleinowych w obrębie biofilmów na zrekonstruowanych obrazach.</li>
	<li>Użyć współczynnika korelacji Pearsona oraz współczynnika nakładania Mandersa do przeprowadzenia analizy kolokalizacji wielu komponentów biofilmu (w niniejszym badaniu kolokalizacja nie była mierzona).</li>
</ol>
9. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wykorzystaj oddzielne analizy statystyczne z zastosowaniem modeli mieszanych w celu porównania średnich wartości parametrów strukturalnych między grupą płukanki do ust a grupą kontrolną (α=0.05). W niniejszym badaniu do przeprowadzenia analizy statystycznej wykorzystano oprogramowanie SAS.</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Yang, Y., Sreenivasan, P. K., Subramanyam, R., Cummins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+assessments+to+determine+the+effects+of+sugars+and+antimicrobials+on+a+polymicrobial+oral+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter assessments to determine the effects of sugars and antimicrobials on a polymicrobial oral biofilm.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 6734-6742 (2006).</li>
<li>Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytical+tool-box+for+comprehensive+biochemical%2C+structural+and+transcriptome+evaluation+of+oral+biofilms+mediated+by+mutans+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of confocal microscopy.</a> Methods Cell Biol. 63, 89-106 (2001).</li>
<li>Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fluorochromes+for+two-photon+laser+scanning+microscopy+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 901-909 (2002).</li>
<li>Wood, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+intact+natural+human+plaque+biofilms+studied+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dental+Res%22%5BJournal%5D)">Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy.</a> J. Dental Res. 79, 21-27 (2000).</li>
<li>Chen, M. Y., Lee, D. J., Tay, J. H., Show, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+extracellular+polymeric+substances+and+cells+in+bioaggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Staining of extracellular polymeric substances and cells in bioaggregates.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 467-474 (2007).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40, 101-111 (2007).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, C723-C742 (2011).</li>
<li>Beyenal, H., Donovan, C., Lewandowski, Z., Harkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biofilm+structure+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biofilm structure quantification.</a> J. Microbiol. Methods. 59, 395-413 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Leica Microsystems.

Akwizycja obrazów CLSM musi być przeprowadzona w sposób i formacie niezbędnym do ilościowego oznaczania biofilmów i analizy kolokalizacji, tak aby rozkład intensywności sygnału w każdym obrazie był wiarygodnym odwzorowaniem rozkładu każdego fluorochromu w stosie biofilmu. Natężenie sygnału powinno być możliwe do odróżnienia od szumu i tła10,11, niewrażliwe na autofluorescencję z podłoża i charakteryzujące się minimalnym przebijaniem z powodu zakłóceń widmowych między zastosowanymi fluorochromami11. Szum jest nieuniknionym ograniczeniem mikroskopii fluorescencyjnej11, a jakość obrazu może być czasami ograniczona z przyczyn technicznych lub logistycznych. Identyfikacja fluorochromów z minimalnym nakładaniem się widma ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tej metody, ale może być skomplikowana. Ponadto kwantyfikacja wielu fluorochromów stanowi problem wieloczynnikowy. Dlatego nie jest zaskakujące, że bardzo niewiele badań z powodzeniem określiło ilościowo jednoczesny rozkład więcej niż dwóch składników w strukturach biofilmów.
Celem tego badania było przedstawienie metodologii składającej się z odrębnych, ale powiązanych ze sobą etapów kwantyfikacji i porównania jednoczesnych trójwymiarowych rozkładów trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Opisany test wzrostu biofilmu pozwala na wzrost biofilmu na odpowiednich podłożach i wytwarza struktury biofilmu, które są powtarzalne, jak wykazano w wynikach przedstawionych w tabeli 1. Połączenie nowatorskiego jednoczesnego barwienia EPS, białek i składników kwasów nukleinowych z pomiarem parametrów strukturalnych 3D biofilmu skutkuje ilościowym rozkładem składników w biofilmach. Jakościowa analiza wizualna jednoczesnego rozmieszczenia EPS, białek i kwasów nukleinowych w biofilmach jest możliwa dzięki rekonstrukcji nałożonych na siebie barwników w obrębie każdego biofilmu. Oprogramowanie ISA3D12 zawiera kilka unikalnych parametrów strukturalnych, takich jak wymiar fraktalny, jednorodność i współczynnik chropowatości biofilmu, a także tradycyjnie mierzone parametry, takie jak porowatość i grubość biofilmu, w celu zwiększenia ilościowej identyfikacji struktur 3D biofilmów. Analiza statystyczna parametrów strukturalnych biofilmu ułatwia odpowiednie porównania biofilmów w określonych warunkach doświadczalnych, takich jak skuteczność przeciwbakteryjna/przeciwporostowa (np. po leczeniu płynami do płukania jamy ustnej) lub w czasie (skutki czasowe).
Metodologia ta pozwoliła skutecznie i skutecznie określić ilościowo i porównać równoczesne rozkłady 3D trzech głównych składników w biofilmach S. mutans , które były hodowane na odpowiednich podłożach, pokonując w ten sposób dwa wyzwania związane z jednoczesną oceną składników biofilmu. Metoda ta może być również wykorzystana do określenia skuteczności zabiegów przeciwbakteryjnych lub przeciwporostowych przeciwko wielu składnikom biofilmu, jak wykazano przy użyciu płynów do płukania jamy ustnej w tym badaniu. Co więcej, większość opisanych powyżej protokołów można zastąpić protokołami wytwarzania odpowiednich substratów i testów wzrostu biofilmu odpowiednich mikroorganizmów. W związku z tym metoda ta ma szerokie zastosowanie, ponieważ ułatwia porównywanie struktur/architektury 3D biofilmów in vitro i in vivo w różnych dyscyplinach, w tym w naukach medycznych, dentystycznych, geologicznych i morskich.

Biofilmy to ustrukturyzowane społeczności mikroorganizmów, które są zamknięte w samodzielnie wyprodukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej i są przyczepione do powierzchni biologicznych lub obojętnych1. Biofilmy reprezentują powszechny styl życia wielu bakterii i tworzą się etapami od swobodnie pływających (planktonowych) komórek do złożonych społeczności wielogatunkowych. Wrodzona oporność biofilmów na środki przeciwdrobnoustrojowe jest przyczyną wielu uporczywych i przewlekłych zakażeń bakteryjnych1,2, czego dowodem są biofilmy jamy ustnej (płytka nazębna). Mikroorganizmy próchnicotwórcze, takie jak paciorkowce mutans, przetwarzają sacharozę i inne węglowodany w celu wytworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej i wytworzenia kwasów, które mogą demineralizować strukturę zębów i powodować próchnicę. Większość matryc biofilmu to biopolimery składające się ze składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych, takich jak egzopolisacharydy (EPS), białka i kwasy nukleinowe3,4.
Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM), najczęściej stosowana technika obrazowania fluorescencyjnego, radykalnie zmieniła obrazowanie optyczne w biologii, ponieważ ma możliwość zbierania obrazów 3D uwodnionych struktur biologicznych bez fiksacji5,6,7. Ta nieniszcząca technika polega na zbieraniu obrazów cienkich odcinków w obszarze zainteresowania próbki w taki sposób, aby usunąć wpływ nieostrego światła. Jakość i rozdzielczość obrazów rejestrowanych przez CLSM wykracza poza to, co można osiągnąć przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Jedną z głównych wad CLSM jest to, że skanowanie obrazów odbywa się wolniej niż w przypadku technik mikroskopii szerokokątnej, w których całe obrazy są zbierane jednocześnie5. Jednak wraz z coraz szerszym wyborem fluorochromów, laserów i filtrów, CLSM stał się jedną z dominujących technik obrazowania wielospektralnego5,7.
Poprzednie badania wykazały, że CLSM jest użytecznym narzędziem do badania struktury lub architektury biofilmów za pomocą jednego lub dwóch znaczników fluorescencyjnych lub barwników, aby zapewnić lepsze zrozumienie rozmieszczenia EPS i komórek w biofilmach, a zwłaszcza w macierzy zewnątrzkomórkowej7,8. Teoretycznie barwienie/znakowanie fluorescencyjne wielu składników jest pożądane w celu zbadania szczegółowej struktury i kolokalizacji składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Jednak jednoczesna analiza różnych składników w biofilmach może być trudna, ponieważ: 1) wybór barwników fluorescencyjnych o minimalnym nakładaniu się widmowym jest skomplikowany oraz 2) kwantyfikacja wielu fluorochromów stanowi problem wieloczynnikowy. Kolokalizacja przy użyciu wielu fluorochromów wymaga użycia wysoce specyficznych barwników z minimalną interferencją spektralną, aby uniknąć efektów przebijania, które występują, gdy dwa fluorochromy znacznie nakładają się na siebie w swoim piku widmowym, powodując, że jeden jest silniej wzbudzony niż drugi9. Idealnie, fluorochromy o widmach wzbudzenia, które nie nakładają się na siebie, zapewniłyby najlepsze wyniki, jednak bardzo trudno jest znaleźć plamy spełniające to kryterium. Zamiast tego wybór plam jest optymalizowany poprzez wybór fluorochromów, których widma emisyjne w minimalnym stopniu się pokrywają, co pozwala na oglądanie plam jeden po drugim w ograniczonym paśmie długości faliobserwacyjnej 9.
Nakładanie obrazów fluorescencyjnych jest prawdopodobnie najczęściej używaną metodą oceny jednoczesnego rozkładu fluorochromów. Kolokalizacja różnych składników objawia się nakładaniem się różnych kolorów przez wiele kanałów utworzonych przez badane fluorochromy10. Narzędzia do wyświetlania wielokanałowych obrazów fluorescencyjnych jako scalonych obrazów kolorowych są dostępne w większości programów CLSM i do analizy obrazów biologicznych. Chociaż nakładanie obrazów jest przydatne do przestrzennej oceny kolokalizacji, obrazy mogą być badane jakościowo tylko za pomocą analizy wizualnej. Dostarcza to ograniczonej ilości informacji, ponieważ te reprezentacje na ogół nie są pomocne w ilościowym określaniu kolokalizacji w różnych warunkach eksperymentalnych, ani nie określają, czy kolokalizacja wykracza poza przypadkową koincydencję11. W bardzo niewielu dotychczasowych badaniach wykorzystano metody ilościowe do analizy trójwymiarowej struktury biofilmów i składników biofilmu, a jeszcze mniej określiło ilościowo wpływ zabiegów przeciwbakteryjnych lub środków przeciwporostowych na składniki biofilmu.
Celem tego badania było przedstawienie metodologii kwantyfikacji i porównania jednoczesnych 3-wymiarowych rozkładów trzech komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów. Metoda składa się z odrębnych, ale powiązanych ze sobą etapów, obejmujących wzrost biofilmu, barwienie, obrazowanie CLSM biofilmów, analizę strukturalną i wizualizację biofilmu oraz analizę statystyczną parametrów strukturalnych. Test wzrostu biofilmu pozwala na wzrost biofilmu na odpowiednich podłożach i wytwarza struktury biofilmu, które są powtarzalne. Połączenie nowatorskiego jednoczesnego barwienia EPS, białek i składników kwasów nukleinowych z pomiarem parametrów strukturalnych 3D biofilmu skutkuje ilościowym rozkładem składników w biofilmach. Analiza statystyczna parametrów strukturalnych biofilmu ułatwia ocenę biofilmów w określonych warunkach doświadczalnych (np. po leczeniu płynami do płukania jamy ustnej), co zostanie opisane w następnym rozdziale.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Todd Hewitt Bulion</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>249240</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy, granulowany</td><td>EMD Millipore</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur Sacharoza</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu, odczynnik ACS, 99,0-100,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, jednozasadowy, &ge; 99.0%, Odczynnik ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu, Monozasadowy, Monohydrat</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan, 99.8+%, Odczynnik ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Sprzężony</td><td>Invitrogen</td><td>C21421</td><td></td></tr><tr><td>Syto 9</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Sypro Red</td><td>Invitrogen</td><td>S12012 lub S6653</td><td></td></tr><tr><td>Biot&egrave; z PBF Płukanie jamy ustnej</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>N/A Listerine</td><td></td></tr><tr><td>Total Care</td><td>McNeil-PPC, Inc.</td><td>N/a</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) jest potężnym narzędziem do badania biofilmów. Bardzo niewiele badań udało się określić ilościowo jednoczesny rozkład więcej niż dwóch składników w biofilmach, ponieważ: 1) wybór barwników fluorescencyjnych o minimalnym nakładaniu się widmowym jest skomplikowany, a 2) kwantyfikacja wielu fluorochromów stanowi problem wieloczynnikowy. Cele: Opracowanie metodyki ilościowego określania i porównywania jednoczesnych trójwymiarowych rozkładów trzech komórkowych/zewnątrzkomórkowych składników biofilmów hodowanych na odpowiednich podłożach. Metody: Metoda składa się z odrębnych, powiązanych ze sobą etapów obejmujących wzrost biofilmu, barwienie, obrazowanie CLSM, analizę i wizualizację strukturalną biofilmu oraz analizę statystyczną parametrów strukturalnych. Biofilmy Streptococcus mutans (szczep UA159) hodowano przez 48 godzin na sterylnych próbkach kompozytów żywicznych Point 4 i TPH3. Próbki zanurzono następnie na 60 sekund w płynach do płukania jamy ustnej Biotène PBF (BIO) lub Listerine Total Care (LTO) lub w wodzie (grupa kontrolna; n=5/grupa). Biofilmy barwiono fluorochromami dla zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych, białek i kwasów nukleinowych przed obrazowaniem za pomocą CLSM. Parametry strukturalne biofilmu obliczone za pomocą oprogramowania do analizy obrazu ISA3D obejmowały bioobjętość i średnią grubość biofilmu. W analizach statystycznych modeli mieszanych porównano parametry strukturalne między grupą płynu do płukania jamy ustnej a grupą kontrolną (oprogramowanie SAS; α=0,05). Oprogramowanie Volocity umożliwiło wizualizację rozkładu 3D nałożonych składników biofilmu (fluorochromów). Wyniki: Płyn do płukania jamy ustnej BIO wytwarzał struktury biofilmu, które znacznie różniły się od kontrolnego (p<0,05) na obu kompozytach żywicznych, podczas gdy LTO nie powodowało różnic (p>0,05) na żadnym z produktów. Wnioski: Metodologia ta pozwoliła na skuteczne i skuteczne określenie ilościowe i porównanie jednoczesnych rozkładów 3D trzech głównych składników w biofilmach S. mutans na odpowiednich podłożach, pokonując w ten sposób dwa wyzwania związane z jednoczesną oceną składników biofilmu. Metoda ta może być również stosowana do określenia skuteczności środków przeciwbakteryjnych/przeciwporostowych przeciwko wielu składnikom biofilmu, jak wykazano przy użyciu płynów do płukania jamy ustnej. Ponadto metoda ta ma szerokie zastosowanie, ponieważ ułatwia porównywanie struktur/architektury 3D biofilmów w różnych dyscyplinach.

Reprezentatywne wyniki dla grup traktowanych (płukanki do ust) oraz grupy kontrolnej nietraktowanej przedstawiono w Tabeli 2 oraz na Rysunkach 1 i 2. Tabela 2 prezentuje wartości średnie i odchylenia standardowe parametrów strukturalnych biofilmu: biovolume (μm3) oraz średniej grubości biofilmu (μm), które obliczono za pomocą oprogramowania ISA3D. Parametry strukturalne biofilmów traktowanych płukanką do ust, które różniły się istotnie od parametrów biofilmów w grupie kontrolnej (p&lt;0.05), mają wartości średnie i odchylenia standardowe wyróżnione kolorem czerwonym. Wyniki statystycznych analiz modeli mieszanych wykazały, że płukanka BIO spowodowała powstanie struktur biofilmu, które różniły się istotnie od kontroli (p&lt;0.05) na obu kompozytach żywicznych, podczas gdy płukanka LTO nie spowodowała istotnych różnic (p&gt;0.05) na żadnym z kompozytów żywicznych. Wyniki wyraźnie pokazują, że pozostałe po zastosowaniu dwóch rodzajów płukanek do ust komponenty komórkowe i zewnątrzkomórkowe biofilmu różniły się od siebie. Należy również zauważyć, że biofilmy S. mutans hodowane na dwóch podłożach (PF i TP) różniły się strukturą 3D, mimo że były hodowane w podobnych warunkach, a oba podłoża zostały wypolerowane podobnymi materiałami ściernymi.
Równoczesny rozkład EPS, białek i kwasów nukleinowych w obrębie biofilmów można zwizualizować za pomocą rekonstrukcji 3D wygenerowanych w oprogramowaniu Volocity. Ryciny 1 i 2 przedstawiają reprezentatywne rekonstrukcje biofilmów grupy kontrolnej hodowanych odpowiednio na kompozytach żywicznych PF i TP. Niebieskie barwienie reprezentuje EPS w biofilmach S. mutans, zielone barwienie wskazuje kwasy nukleinowe, a czerwone barwienie pokazuje białka. Przestrzeń pomiędzy nimi może być wypełniona wodą lub innymi nieoznakowanymi fluorescencyjnie komponentami biofilmów.
<img alt="Wykres rozrzutu 3D, dynamiczna wizualizacja danych, graf, interaktywne narzędzie badawcze, wyświetlacz analityczny." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentatywna rekonstrukcja 3D biofilmu S. mutans wyhodowanego na kompozycie żywicznym PF w grupie kontrolnej (nieleczonej płynem do płukania jamy ustnej). Jednoczesna nakładka trzech barwień w obrębie jednego biofilmu umożliwia równoległą wizualizację składników EPS (barwienie niebieskie), kwasów nukleinowych (barwienie zielone) i białek (barwienie czerwone) w biofilmach S. mutans. (1 jednostka = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.
<img alt="Wizualizacja trójwymiarowej struktury komórkowej, mikroskopia fluorescencyjna, analiza danych przestrzennych, wykres naukowy." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50639/50639fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywna rekonstrukcja 3D biofilmu S. mutans wyhodowanego na kompozycie żywicznym TP w grupie kontrolnej (nieleczonej płynem do płukania jamy ustnej). Jednoczesna nakładka trzech barwień w obrębie jednego biofilmu umożliwia symultaniczną wizualizację komponentów EPS (barwienie niebieskie), kwasów nukleinowych (barwienie zielone) i białek (barwienie czerwone) w biofilmach S. mutans. (1 jednostka = 24 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50639/50639fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Kompozyt żywiczny</td >
			<td ></td >
			<td colspan="2" >Punkt 4</td >
			<td colspan="2" >TPH3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Płukanka do ust</td >
			<td >Składnik</td >
			<td >BV (μm3)</td >
			<td >MT (μm)</td >
			<td >BV (μm3)</td >
			<td >MT (μm)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Biotène PBF</td >
			<td >Kwasy nukleinowe</td >
			<td >279,517±53,291</td >
			<td >9.32±2.80</td >
			<td >195,033±42,014</td >
			<td >7.45±3.70</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >EPS</td >
			<td >344,902±56,386</td >
			<td >35.22±17.19</td >
			<td >197,840±62,351</td >
			<td >9.83±7.26</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Białka</td >
			<td >298,796±62,868</td >
			<td >54.21±21.65</td >
			<td >216,033±66,654</td >
			<td >24.33±39.64</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Listerine Total Care</td >
			<td >Kwasy nukleinowe</td >
			<td >355,707±110,444</td >
			<td >26.45±14.21</td >
			<td >273,296±47,323</td >
			<td >13.43±2.89</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >EPS</td >
			<td >494,099±180,592</td >
			<td >64.90± 26.68</td >
			<td >329,150±47,145</td >
			<td >34.35±30.32</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Białka</td >
			<td >348,416±161,316</td >
			<td >58.68±47.28</td >
			<td >303,150±54,705</td >
			<td >34.18±41.46</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Kontrola (nieleczona)</td >
			<td >Kwasy nukleinowe</td >
			<td >388,375±42,152</td >
			<td >51.15±40.66</td >
			<td >327,809±39,400</td >
			<td >17.08±1.65</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >EPS</td >
			<td >660,448±173,197</td >
			<td >91.37±74.84</td >
			<td >363,850±67,612</td >
			<td >28.33± 15.07</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Białka</td >
			<td >517,274±119,475</td >
			<td >127.96±73.84</td >
			<td >353,161±56,518</td >
			<td >21.17±4.41</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2. Średnie wartości i odchylenia standardowe biovolume (BV) oraz średniej grubości biofilmu (MT) dla biofilmów traktowanych BIO lub LTO, bądź pozostawionych bez obróbki (grupa kontrolna). Parametry strukturalne biofilmów traktowanych płynami do płukania jamy ustnej, które różniły się istotnie od parametrów biofilmów w grupie kontrolnej (p&lt;0,05), mają wartości średnich i odchyleń standardowych wyróżnione na czerwono.

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie i porównanie jednoczesnych trójwymiarowych rozkładów trzech komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmu po leczeniu środkami przeciwbakteryjnymi. Osiąga się to poprzez najpierw wytwarzanie, a następnie polerowanie próbek kompozytów żywicznych. W drugim etapie interesujące biofilmy są hodowane na próbkach, a następnie poddawane działaniu środków przeciwbakteryjnych.Następnie biofilmy są barwione fluorochromami dla zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych, kwasów nukleinowych i białek, a następnie obrazowane za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. W końcowym etapie rekonstruowane są trójwymiarowe obrazy nałożonych fluorochromów, aby ułatwić jednoczesną wizualizację składników biofilmu, a na podstawie obrazów biofilmu obliczane są parametry strukturalne. Ostatecznie można przeprowadzić analizę statystyczną parametrów strukturalnych biofilmu, takich jak objętość biofilmu i średnia grubość biofilmu, aby porównać różnice między grupą badaną a grupą kontrolną.Główną zaletą tej procedury w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że wykorzystuje odrębne, ale wzajemnie powiązane techniki do scharakteryzowania rozmieszczenia wielu składników w strukturze biofilmów uprawianych w określonych warunkach, demonstrując procedurę dr Fernando Flores, doktor habilitowany, i pani Kristen Smart, asystentka naukowa z mojego laboratorium Aby stworzyć próbki, zacznij od umieszczenia jednego przyrostu 0,4 lub TPH trzech kompozytów z żywicy dentystycznej w niestandardowych wykonane formy ze stali nierdzewnej. Następnie polimeryzuj pierwszy przyrost za pomocą jednostki utwardzania światłem LED przez 40 sekund. Po powtórzeniu procedury dla drugiego przyrostu użyj półautomatycznej szlifierki polerskiej, aby wypolerować utwardzone próbki do akceptowalnego końcowego wykończenia powierzchni.Na koniec wysterylizuj próbki, aby wyhodować biofilm. Najpierw zaszczepij pojedynczą kolonię S mutans w czterech mililitrach pożywki hodowlanej na noc, a następnie inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin, aby osiągnąć gęstość optyczną co najmniej 0,9. Następnie rozcieńczyć kulturę w stosunku jeden do 100 w 10 mililitrach wzrostu biofilmu.Pożywkę aseptykować przenieść sterylne próbki kompozytu żywicy na sterylne płytki 12-dołkowe, a następnie dodać 2,5 mililitra rozcieńczonej kultury do każdej z studzienek. W przypadku grup zajmujących się płynem do płukania jamy ustnej i grup kontrolnych dodaj 2,5 mililitra sterylnego, niezaszczepionego wzrostu biofilmu, pożywki do studzienek kontrolnych sterylności, a następnie hoduj biofilmy w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach mikroparafilicznych na wytrząsarce z prędkością 100 obr./min. Po 24 godzinach aseptycznie zassać pożywkę ze wszystkich studzienek i przemyć każdą studzienkę dwukrotnie 2,5 mililitra sterylnego PBS, zasysając sól fizjologiczną po każdym przemyciu, a następnie uzupełnić każdą studzienkę 2,5 mililitrami świeżej pożywki do wzrostu biofilmu i inkubować płytkę przez dodatkowe 24 godziny, jak właśnie wykazano dla całkowitego wzrostu biofilmu Czas trwania 48 godzin po zakończeniu wzrostu biofilmu, Odessać pożywkę wzrostową, a następnie dozować 2,5 mililitra płynu do płukania jamy ustnej do każdej studzienki i 2,5 mililitra sterylnej ultraczystej wody do grupy kontrolnej.Dobrze wymieszaj płytki na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min, a następnie po 60 sekundach odessaj zarówno płyn do płukania jamy ustnej, jak i ultraczystą wodę ze studzienek, aby zabarwić egzopolisacharydowy składnik biofilmów. Inkubować każdy biofilm z 50 mikrolitrami koniugatu LOR przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Następnie umyj próbki dwa razy 2,5 mililitra buforu TC zasysającego po każdym myciu i zabarwij kwasy nukleinowe w każdym biofilmie kroplą cyto nine o wielkości 50 mikrolitrów przez 30 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem.Po dwukrotnym umyciu próbek, składniki białkowe w każdym biofilmie barwić 50 mikrolitrami czerwieni Cipro przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po trzykrotnym umyciu próbek, przenieś je do indywidualnych studzienek sześciodołkowej płytki zawierającej sześć mililitrów sterylnej ultraczystej wody na studzienkę, aby ułatwić ich wizualizację za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania obrazów każdego z barwników składowych w biofilmach grup poddanych działaniu środka i kontrolnych. Ustaw lasery konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego na następujące ustawienia w celu wykrywania polisacharydów egzo za pomocą barwienia sprzężonego Exor, użyj lasera 633 nanometra i pasma emisji od 659 do 749 nanometrów do wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą barwienia cyto dziewięciostopniowego.Użyj lasera 488 nm i pasma emisyjnego od 495 do 500 nanometrów, a do wykrywania białek za pomocą czerwonego barwnika Cipro użyj lasera 543 nm i pasma emisji od 615 do 651 n. Następnie za pomocą obiektywu do zmniejszania powiększania o powiększeniu 63 x z aperturą numeryczną 0,9 i odległością roboczą 2,2 milimetra. Zbieraj obrazy z konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej z częstotliwością 400 Hz, korzystając ze skanowania sekwencyjnego w trybie między stosami, aby zoptymalizować przechwytywanie obrazów wielu plam w tym samym biofilmie.Po przeanalizowaniu obrazów z konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej użyj opcji menu renderera 3D w oprogramowaniu do analizy obrazu prędkości, aby utworzyć zrekonstruowany obraz 3D nałożonych barwników składowych w każdym biofilmie. Następnie obróć obraz 3D, aby uzyskać optymalny widok biofilmu. Następnie uchwyć migawkę rekonstrukcji biofilmu i wyeksportuj ją do odpowiedniego formatu pliku obrazu.Na koniec przeprowadź analizę wizualną jednoczesnego rozmieszczenia egzopolisacharydowego kwasu nukleinowego i składników białkowych w biofilmach. Na zrekonstruowanych obrazach należy obliczyć parametry strukturalne biofilmu, takie jak objętość biofilmu i średnia grubość biofilmu, za pomocą oprogramowania ISA 3D w tej tabeli wyświetlane są wartości średniej i odchylenia standardowego parametrów strukturalnych biofilmu obliczone za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Wartości średniej i odchylenia standardowego dla parametrów strukturalnych biofilmów poddanych działaniu płynu do płukania jamy ustnej, które różniły się znacznie od parametrów biofilmów w grupie kontrolnej, są wyróżnione na czerwono w modelach mieszanych.Analizy statystyczne wykazały, że płyn do płukania jamy ustnej Biotene PBF wytwarzał struktury biofilmu, które różniły się znacznie od grupy kontrolnej na obu kompozytach żywicznych, podczas gdy płyn do płukania jamy ustnej Listerine total care nie powodował istotnych różnic na żadnym z kompozytów żywicznych, co wyraźnie wskazuje na różnice w komórkowych i zewnątrzkomórkowych składnikach biofilmu pozostałych po dwóch zabiegach płukania jamy ustnej. Jednoczesny rozkład polisacharydów egzo, kwasów nukleinowych i białek w biofilmach można zobrazować za pomocą rekonstrukcji 3D wygenerowanych za pomocą oprogramowania do pomiaru prędkości. Na tym rysunku pokazano reprezentatywną rekonstrukcję biofilmów grupy kontrolnej wyhodowanych na 0,4, kolor niebieski został przypisany do polisacharydu egzo.W biofilmach S mutans kolor zielony przypisano kwasom nukleinowym, a kolor czerwony białkom. Przestrzeń pośrednia może być zajęta przez wodę lub inne składniki biofilmu, które nie zostały znakowane fluorescencyjnie. Na rysunku przedstawiono reprezentatywną rekonstrukcję biofilmów grupy kontrolnej wyhodowanych na trzech kompozytach żywicznych TPH o kolorach reprezentujących te same składniki, co na poprzednim rysunku.Procedura ta znalazła zastosowanie w różnych dyscyplinach, takich jak medycyna, stomatologia, geologia i nauki o morzu. Ponieważ wiele podłoży i biofilmów można zastąpić tymi stosowanymi tutaj.

concurrent-quantification-cellular-extracellular-components

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Współbieżne ilościowe określenie komórkowych i pozakomórkowych składników biofilmów

Niniejszy artykuł opisuje procedurę tworzenia i wizualizacji biofilmu bakteryjnego hodowanego w szkiełku przedmiotowym z komorą...

In vitro tworzenie biofilmu w szkiełku przedmiotowym z 8-komorowym układem

Biofilmy mikrobiologiczne są zazwyczaj tworzone przez odrębne subpopulacje wyspecjalizowanych komórek. Analiza pojedynczych komórek w tych subpopulacjach wymaga zastosowania reporterów fluorescencyjnych. W niniejszym protokole opisujemy metodę wizualizacji i monitorowania kilku subpopulacji w biofilmach B. subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Analiza pojedynczych komórek biofilmu Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Cytometria przepływowa w połączeniu z wizualnym grupowaniem oferuje łatwą w użyciu i szybką metodę badania biofilmów wodnych. Może być stosowany do charakteryzowania biofilmu, wykrywania zmian w strukturze zbiorowiska biofilmu oraz wykrywania cząstek abiotycznych osadzonych w biofilmie.

Charakterystyka biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej

Opisujemy montaż, działanie i czyszczenie urządzenia przepływowego zaprojektowanego do obrazowania tworzenia się biofilmu grzybów w czasie rzeczywistym podczas przepływu. Dostarczamy również i omawiamy algorytmy ilościowe, które można zastosować na pozyskanych obrazach.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym i kwantyfikacja rozwoju biofilmu grzybów przy użyciu dwufazowego systemu przepływu recyrkulacyjnego

Protokół opisuje hodowlę międzykrólestwowych biofilmów składających się z Candida albicans i Streptococcus mutans oraz przedstawia metodę opartą na mikroskopii konfokalnej do monitorowania pH zewnątrzkomórkowego wewnątrz tych biofilmów.

Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzyludzkich za pomocą mikroskopii konfokalnej

Wywołane przez środki przeciwbakteryjne zmiany w architekturze biofilmu Pseudomonas aeruginosa różnią się między klinicznymi izolatami hodowanymi od pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłą infekcją płuc. Po mikroskopii konfokalnej oprogramowanie COMSTAT może być wykorzystane do ilościowego określenia zmian w architekturze biofilmu (np. powierzchni, grubości, biomasy) dla poszczególnych izolatów w celu oceny skuteczności środków przeciwinfekcyjnych.

Kwantyfikacja wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na architekturę biofilmu in vitro przy użyciu oprogramowania COMSTAT

Ten protokół opisuje przygotowanie inokulum, kwantyfikację biofilmu na płytkach mikromiareczkowych za pomocą barwnika fioletu krystalicznego, liczenie żywotnych w biofilmach oraz wizualizację biofilmów Acinetobacter.

Kwantyfikacja, ocena żywotności i strategie wizualizacji biofilmów Acinetobacter

Protokół ten zapewnia modułowy workflow BSL-2, łączący testy biomasy kryształowo-fioletowej, kinetykę kontrastu fazowego poklatkowego, konfokalne mapowanie 3D/matrycowe macierzy, ultrastrukturę SEM oraz moduł in vivo dla infekcji chomików, aby kultywować, ilościować, charakteryzować i badać funkcjonalną rolę biofilmu Leptospira , umożliwiając standaryzowaną ocenę mutantów i interwencji antybiofilmowych w różnych laboratoriach.

Modułowy workflow do analizy ilościowej, strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira

Poznaj metodę jednoczesnej kwantyfikacji komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia analizę struktury biofilmów po zastosowaniu środków przeciwbakteryjnych.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Przeglądaj więcej filmów