Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie i porównanie jednoczesnych trójwymiarowych rozkładów trzech komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmu po leczeniu środkami przeciwbakteryjnymi. Osiąga się to poprzez najpierw wytwarzanie, a następnie polerowanie próbek kompozytów żywicznych. W drugim etapie interesujące biofilmy są hodowane na próbkach, a następnie poddawane działaniu środków przeciwbakteryjnych.

Następnie biofilmy są barwione fluorochromami dla zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych, kwasów nukleinowych i białek, a następnie obrazowane za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. W końcowym etapie rekonstruowane są trójwymiarowe obrazy nałożonych fluorochromów, aby ułatwić jednoczesną wizualizację składników biofilmu, a na podstawie obrazów biofilmu obliczane są parametry strukturalne. Ostatecznie można przeprowadzić analizę statystyczną parametrów strukturalnych biofilmu, takich jak objętość biofilmu i średnia grubość biofilmu, aby porównać różnice między grupą badaną a grupą kontrolną.

Główną zaletą tej procedury w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że wykorzystuje odrębne, ale wzajemnie powiązane techniki do scharakteryzowania rozmieszczenia wielu składników w strukturze biofilmów uprawianych w określonych warunkach, demonstrując procedurę dr Fernando Flores, doktor habilitowany, i pani Kristen Smart, asystentka naukowa z mojego laboratorium Aby stworzyć próbki, zacznij od umieszczenia jednego przyrostu 0,4 lub TPH trzech kompozytów z żywicy dentystycznej w niestandardowych wykonane formy ze stali nierdzewnej. Następnie polimeryzuj pierwszy przyrost za pomocą jednostki utwardzania światłem LED przez 40 sekund. Po powtórzeniu procedury dla drugiego przyrostu użyj półautomatycznej szlifierki polerskiej, aby wypolerować utwardzone próbki do akceptowalnego końcowego wykończenia powierzchni.

Na koniec wysterylizuj próbki, aby wyhodować biofilm. Najpierw zaszczepij pojedynczą kolonię S mutans w czterech mililitrach pożywki hodowlanej na noc, a następnie inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin, aby osiągnąć gęstość optyczną co najmniej 0,9. Następnie rozcieńczyć kulturę w stosunku jeden do 100 w 10 mililitrach wzrostu biofilmu.

Pożywkę aseptykować przenieść sterylne próbki kompozytu żywicy na sterylne płytki 12-dołkowe, a następnie dodać 2,5 mililitra rozcieńczonej kultury do każdej z studzienek. W przypadku grup zajmujących się płynem do płukania jamy ustnej i grup kontrolnych dodaj 2,5 mililitra sterylnego, niezaszczepionego wzrostu biofilmu, pożywki do studzienek kontrolnych sterylności, a następnie hoduj biofilmy w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach mikroparafilicznych na wytrząsarce z prędkością 100 obr./min. Po 24 godzinach aseptycznie zassać pożywkę ze wszystkich studzienek i przemyć każdą studzienkę dwukrotnie 2,5 mililitra sterylnego PBS, zasysając sól fizjologiczną po każdym przemyciu, a następnie uzupełnić każdą studzienkę 2,5 mililitrami świeżej pożywki do wzrostu biofilmu i inkubować płytkę przez dodatkowe 24 godziny, jak właśnie wykazano dla całkowitego wzrostu biofilmu Czas trwania 48 godzin po zakończeniu wzrostu biofilmu, Odessać pożywkę wzrostową, a następnie dozować 2,5 mililitra płynu do płukania jamy ustnej do każdej studzienki i 2,5 mililitra sterylnej ultraczystej wody do grupy kontrolnej.

Dobrze wymieszaj płytki na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min, a następnie po 60 sekundach odessaj zarówno płyn do płukania jamy ustnej, jak i ultraczystą wodę ze studzienek, aby zabarwić egzopolisacharydowy składnik biofilmów. Inkubować każdy biofilm z 50 mikrolitrami koniugatu LOR przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Następnie umyj próbki dwa razy 2,5 mililitra buforu TC zasysającego po każdym myciu i zabarwij kwasy nukleinowe w każdym biofilmie kroplą cyto nine o wielkości 50 mikrolitrów przez 30 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem.

Po dwukrotnym umyciu próbek, składniki białkowe w każdym biofilmie barwić 50 mikrolitrami czerwieni Cipro przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po trzykrotnym umyciu próbek, przenieś je do indywidualnych studzienek sześciodołkowej płytki zawierającej sześć mililitrów sterylnej ultraczystej wody na studzienkę, aby ułatwić ich wizualizację za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania obrazów każdego z barwników składowych w biofilmach grup poddanych działaniu środka i kontrolnych. Ustaw lasery konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego na następujące ustawienia w celu wykrywania polisacharydów egzo za pomocą barwienia sprzężonego Exor, użyj lasera 633 nanometra i pasma emisji od 659 do 749 nanometrów do wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą barwienia cyto dziewięciostopniowego.

Użyj lasera 488 nm i pasma emisyjnego od 495 do 500 nanometrów, a do wykrywania białek za pomocą czerwonego barwnika Cipro użyj lasera 543 nm i pasma emisji od 615 do 651 n. Następnie za pomocą obiektywu do zmniejszania powiększania o powiększeniu 63 x z aperturą numeryczną 0,9 i odległością roboczą 2,2 milimetra. Zbieraj obrazy z konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej z częstotliwością 400 Hz, korzystając ze skanowania sekwencyjnego w trybie między stosami, aby zoptymalizować przechwytywanie obrazów wielu plam w tym samym biofilmie.

Po przeanalizowaniu obrazów z konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej użyj opcji menu renderera 3D w oprogramowaniu do analizy obrazu prędkości, aby utworzyć zrekonstruowany obraz 3D nałożonych barwników składowych w każdym biofilmie. Następnie obróć obraz 3D, aby uzyskać optymalny widok biofilmu. Następnie uchwyć migawkę rekonstrukcji biofilmu i wyeksportuj ją do odpowiedniego formatu pliku obrazu.

Na koniec przeprowadź analizę wizualną jednoczesnego rozmieszczenia egzopolisacharydowego kwasu nukleinowego i składników białkowych w biofilmach. Na zrekonstruowanych obrazach należy obliczyć parametry strukturalne biofilmu, takie jak objętość biofilmu i średnia grubość biofilmu, za pomocą oprogramowania ISA 3D w tej tabeli wyświetlane są wartości średniej i odchylenia standardowego parametrów strukturalnych biofilmu obliczone za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Wartości średniej i odchylenia standardowego dla parametrów strukturalnych biofilmów poddanych działaniu płynu do płukania jamy ustnej, które różniły się znacznie od parametrów biofilmów w grupie kontrolnej, są wyróżnione na czerwono w modelach mieszanych.

Analizy statystyczne wykazały, że płyn do płukania jamy ustnej Biotene PBF wytwarzał struktury biofilmu, które różniły się znacznie od grupy kontrolnej na obu kompozytach żywicznych, podczas gdy płyn do płukania jamy ustnej Listerine total care nie powodował istotnych różnic na żadnym z kompozytów żywicznych, co wyraźnie wskazuje na różnice w komórkowych i zewnątrzkomórkowych składnikach biofilmu pozostałych po dwóch zabiegach płukania jamy ustnej. Jednoczesny rozkład polisacharydów egzo, kwasów nukleinowych i białek w biofilmach można zobrazować za pomocą rekonstrukcji 3D wygenerowanych za pomocą oprogramowania do pomiaru prędkości. Na tym rysunku pokazano reprezentatywną rekonstrukcję biofilmów grupy kontrolnej wyhodowanych na 0,4, kolor niebieski został przypisany do polisacharydu egzo.

W biofilmach S mutans kolor zielony przypisano kwasom nukleinowym, a kolor czerwony białkom. Przestrzeń pośrednia może być zajęta przez wodę lub inne składniki biofilmu, które nie zostały znakowane fluorescencyjnie. Na rysunku przedstawiono reprezentatywną rekonstrukcję biofilmów grupy kontrolnej wyhodowanych na trzech kompozytach żywicznych TPH o kolorach reprezentujących te same składniki, co na poprzednim rysunku.

Procedura ta znalazła zastosowanie w różnych dyscyplinach, takich jak medycyna, stomatologia, geologia i nauki o morzu. Ponieważ wiele podłoży i biofilmów można zastąpić tymi stosowanymi tutaj.