Test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek

Ogólnym celem tej procedury jest określenie zmian w tempie degradacji białek w sposób systematyczny poprzez sprzężenie ich z kinetyką wzrostu drożdży w płynnej kulturze. Osiąga się to poprzez hodowlę pierwszych komórek wykazujących ekspresję białka reporterowego składającego się z sygnału degradacji sprzężonego z markerem metabolicznym w ciągu nocy do fazy stacjonarnej w odpowiednim selektywnym pożywce. Następnie mierzy się gęstość optyczną komórek w celu określenia kinetyki wzrostu komórek, a następnie na podstawie kinetyki wzrostu oblicza się minimalny czas podwojenia komórek podczas fazy logarytmicznej za pomocą specjalnego oprogramowania.

Ostatecznie obliczony minimalny czas podwojenia można wykorzystać do zdefiniowania zmian w kinetyce degradacji białek. Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy degradacji cyklaminianu lub pościgu impulsowego, dodali, że nasza technika jest prosta do skonfigurowania. Pozyskiwanie i analiza danych są proste, a projekt eseju jest niezwykle modułowy.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie degradacji doniczki, takie jak to, które elementy są wymagane do rozpoznania nieprawidłowo złożonej doniczki przez system doniczki ubikwityny. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy chciałem przeprowadzić badanie przesiewowe, aby zidentyfikować białka, które wymagają usunięcia ubikwityny z ich podzbioru. Ustaliłem więc prosty sposób porównywania wielu próbek, aby przygotować komórki do analizy.

Zacznij od przekształcenia odpowiednich komórek drożdży zanikowych wołów, takich jak TRY 4, 67, z plazmidem zawierającym fuzję U 3 Deron i dodatkowym markerem metabolicznym do selekcji i utrzymania plazmidu. W celu selekcji i utrzymania plazmidu, hoduj komórki na płytkach agarowych pod odpowiednim syntetycznym zdefiniowanym podłożem, pozbawionym markerów selekcji aminokwasów, przenieś ocalałe kolonie do łat, przenieś komórki z plastrów do płynnej pożywki i inkubuj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej. Następnie, dla 15 próbek lub mniej, rozcieńczyć 50 mikrolitrów komórek z hodowli nocnej za pomocą 150 mikrolitrów syntetycznego zdefiniowanego podłoża na studzienkę.

Na przezroczystej 96-dołkowej płytce z dnem należy użyć czytnika mikropłytek, aby określić wartości OD 600 w próbkach. Następnie, po obliczeniu dokładnej objętości potrzebnej do uzyskania komórek drożdży w ilości odpowiadającej OD 600 0,25, wirować komórki przez jedną minutę w temperaturze 12 000 razy G i temperaturze pokojowej, ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze odpowiedniego selektywnego podłoża, aby uzyskać OD 600 0,25 i przenieść 200 mikrolitrów rozcieńczonego szczepu do jednego dołka nowej płytki 96-dołkowej, gdy jest większa niż 15 próbki należy poddać badaniom. Przenieść 10 mikrolitrów wyhodowanych przez noc komórek stacjonarnych do jednego dołka nowej 96-dołkowej płytki zawierającej 190 mikrolitrów odpowiedniej pożywki selektywnej w celu zmierzenia kinetyki wzrostu przekształconych komórek drożdży w warunkach selektywnych.

Następnie ustaw wielomodowy czytnik mikropłytek na temperaturę inkubacji 30 stopni Celsjusza OD, 600 interwały pomiarowe 15 minut oraz orbitalne i liniowe cykle wytrząsania wynoszące jedną minutę co siedem minut. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza w czytniku mikropłytek przez 12 do 24 godzin. Gdy komórki osiągną fazę stacjonarną, wyeksportuj surowe dane do pliku arkusza kalkulacyjnego, aby określić kinetykę wzrostu drożdży za pomocą MDT Calc.

Upewnij się, że plik arkusza kalkulacyjnego zawierający dane o wzroście został zapisany i zamknięty. Następnie otwórz aplikację MDT Calc w ścieżce pliku. Kliknij prostokąt, aby zlokalizować plik arkusza kalkulacyjnego pod nazwą arkusza.

Wprowadź nazwę arkusza kalkulacyjnego, w którym znajdują się nieprzetworzone dane, w polu Pozycja początkowa. Wprowadź współrzędną czasu w arkuszu kalkulacyjnym, zero pierwszej próbki w kolumnie czasu. Wprowadź literę określającą lokalizację kolumny punktu czasu w sekundach w polu pusta kolumna, wprowadź literę określającą lokalizację pustej kolumny.

Na przykład studzienka A z 96-dołkową płytką. Następny. W polu Wartość OD wybierz minimalną przekształconą wartość OD 600 wymaganą do zainicjowania obliczeń MDT. Zwykle od 0,15 do 0,25, aby zapewnić, że MDT jest obliczany tylko dla próbek, które osiągają zdefiniowaną wartość D 600 lub wyższą.

Po wprowadzeniu ostatniej wartości kliknij przycisk obliczania i potwierdź, że pasek postępu po prawej stronie stopniowo zmienia kolor na zielony. Na koniec wyeksportuj dwa zestawy danych, które pojawiają się automatycznie na ekranie po zakończeniu obliczeń MDT, do nowego arkusza kalkulacyjnego. Upewnij się, że dane obejmują wartość MDT dla każdego studzienki, która przeszła test minimalnej wartości OD oraz czas rozpoczęcia przedziału, od którego obliczono MDT w tym reprezentatywnym doświadczeniu.

Względne różnice w kinetyce degradacji białek między typem dzikim a różnymi zmutowanymi szczepami porównano początkowo dzikie komórki delta typu U BBC six, delta UBC seven delta lub DOA 10 delta eksprymujące D one VMAU three hodowano na syntetycznym zdefiniowanym kompletnym podłożu. Następnie, aby zmierzyć skrzela, komórki przemyto i inkubowano w syntetycznych pożywkach zdefiniowanych. Poniżej uracylu podobne krzywe wzrostu i obliczone MDT zaobserwowano dla wszystkich szczepów hodowanych w syntetycznym zdefiniowanym kompletnym pożywce, wykluczając możliwość, że delecja któregokolwiek z badanych genów wpływa na wzrost komórek.

W przeciwieństwie do tego, inkubacja w syntetycznych pożywkach o zdefiniowanej pożywce bez uracylu powodowała słaby wzrost komórek typu dzikiego, podczas gdy w zmutowanych szczepach zaobserwowano tylko niewielki defekt wzrostu. UBC siedem jest absolutnie wymagane dla degradacji DEG jeden VMAU 3, umożliwiając dokładną ocenę nawet częściowych skutków różnych mutantów E 2. W związku z tym kinetykę szybkiego wzrostu obserwuje się w komórkach eksprymujących UBC siedem z mutantami miejsca aktywnego, C 89 s i N 81 A.In ponadto stwierdzono, że dwa mutanty, które mają pośrednio utrudniać degradację DEG jeden VMA ETH trzy V 20 5G i H 90 4K, również zwiększają wzrost komórek w porównaniu z dzikim typem UBC seven, choć w mniejszym stopniu niż mutanty w miejscu aktywnym.

W ten sposób metoda skrzeli może być stosowana do dokładnego pomiaru względnego udziału różnych czynników degradacji w stabilności podłoża reporterowego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że protokół jest wrażliwy na niewielkie różnice w tempie degradacji białek. Jest to zaleta, ale oznacza to również, że należy zachować ostrożność przy projektowaniu i weryfikacji Deron, który ma być używany zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencyjna, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak skłonność do agregacji białek reporterowych. Z tego powodu dobrym pomysłem jest również dołączenie znacznika GFP do raportu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak w systematyczny sposób określać zmiany w szybkości degradacji białek za pomocą czytnika MICROPLATE i naszego dedykowanego oprogramowania.