Name: Test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę testu wzrostu opartego na reporterze do analizy degradacji białek w drożdżach. Technika ta pozwala systematycznie mierzyć kinetykę proteolizy poprzez pomiar czasu podwojenia komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Yuvalowi Reissowi i dr Williamowi Breuerowi za krytyczną recenzję manuskryptu oraz Omri Alfassy za pomoc w rozwoju testu przesiewowego Ura3-GFP. Dziękujemy również dr M. Hochstrasser i dr R. Kulka za plazmidy i szczepy. Praca ta została sfinansowana przez Izraelską Akademię Nauk (grant 786/08) oraz przez Amerykańsko-Izraelską Dwunarodową Fundację Naukową (grant 2011253).

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przekształć odpowiednie auksotroficzne komórki drożdży, takie jak Try467 (Tabela 2), za pomocą plazmidu zawierającego (a) fuzję URA3-degron i (b) dodatkowy marker metaboliczny do selekcji i utrzymania plazmidu. 
	UWAGA: Przykładem odpowiedniego plazmidu jest YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1-UV). Jest to plazmid integracyjny drożdży zawierający białko fuzyjne składające się z Deg1 - degronu pochodzącego z czynnika transkrypcyjnego drożdży Mat217, epitopu FLAG - do wykrywania przez immunoblotting, Vma12 - stabilnego białka ER i Ura315,18 (Figura 3A). (Patrz Tabela 3 dla plazmidów użytych w tym badaniu oraz dla dodatkowych przykładów odpowiednich plazmidów.)</li>
	<li>W celu selekcji i utrzymania plazmidu należy przechowywać komórki na płytkach agarowych w odpowiednim pożywce zdefiniowanej syntetycznie (SD) bez markerów selekcji aminokwasów19 (na przykład Deg1-UV jest wybierany i utrzymywany w pożywkach selektywnych SD-LYS).</li>
	<li>Hodować komórki O/N w temperaturze 30 °C w odpowiednim selektywnym pożywce SD w celu utrzymania plazmidu aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej. Hodować komórki w probówkach lub na 96-dołkowej płytce, w zależności od liczby próbek do zbadania (sekcja 2).</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do analizy
<ol>
	<li>Jeżeli ma być oznaczona niewielka liczba próbek (N≤15), rozcieńczyć komórki i zastąpić pożywkę w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 50 μl komórek z hodowli O/N 150 μl pożywki SD na studzienkę na 96-dołkową płytkę (przezroczyste dno). Uwaga, pierwsza próbka jest oznaczona jako ślepa próba zawierająca tylko podłoże.</li>
		<li>Oznaczyć wartości OD600 próbek w płytce 96-dołkowej za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
		<li>Obliczyć rzeczywistą wartość OD600 w każdym studzience, mnożąc odczyt OD600 przez współczynnik rozcieńczenia (x4), od którego odejmuje się wartość odczytu ślepej próby. Znormalizuj otrzymane wartości, dzieląc przez 0,55, aby uzyskać obliczoną długość ścieżki 1 cm zgodnie z prawem Beera-Lamberta. Należy pamiętać, że wartość ta jest stała przy pomiarze OD600 z 200 μl komórek na standardowej płytce 96-dołkowej.</li>
		<li>Obliczyć dokładną objętość potrzebną do uzyskania komórek drożdży w ilości odpowiadającej OD600 0,25 i przenieść ją do probówki Eppendorfa.</li>
		<li>Wiruj komórki z dużą prędkością (12 000 x g) przez 1 minutę.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml odpowiedniej pożywki selektywnej (patrz sekcja 3.1) do uzyskania OD600 0,25.</li>
		<li>Przenieść 200 μl rozcieńczonych szczepów do nowego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeżeli ma być przebadana duża liczba próbek (N>15), należy rozcieńczyć komórki i zastąpić pożywkę bez uprzedniego pomiaru OD600, w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przenieść 10 μl nieruchomych komórek hodowanych O/N na 96-dołkowej płytce do nowej 96-dołkowej płytki zawierającej 190 μl (rozcieńczenie 1:20) odpowiedniej pożywki selektywnej (patrz sekcja 3.1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kinetyka wzrostu w kulturze płynnej w warunkach selektywnych (GiLS)
<ol>
	<li>Do pomiarów wzrostu za pomocą reportera Ura3-degron należy użyć następujących pożywek:
	<ol>
		<li>Do pozytywnej kontroli wzrostu drożdży w warunkach nierestrykcyjnych należy stosować plazmidowe selektywne pożywki SD (patrz punkt 1.2). Jeśli nie jest wymagana selekcja plazmidu, na przykład przy użyciu plazmidu integracyjnego, takiego jak Deg1-UV, można użyć pożywki SD zawierającej wszystkie niezbędne aminokwasy (SD complete).</li>
		<li>W przypadku próbek eksperymentalnych mierzących wzrost w restrykcyjnych warunkach należy użyć pożywki SD-URA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić wielomodowy czytnik mikropłytek na: temperaturę inkubacji 30 °C, odstępy pomiarowe OD600 wynoszące 15 minut oraz orbitalne i liniowe cykle wytrząsania wynoszące 1 minutę co siedem minut 
	UWAGA: To podwójne wytrząsanie zostało zoptymalizowane w celu uzyskania jednorodnego rozmieszczenia komórek; Jednak inne tryby potrząsania, a nawet brak potrząsania, mogą również działać.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 30 °C w czytniku mikropłytek O/N lub do momentu, gdy komórki osiągną fazę stacjonarną (12-24 godziny).</li>
	<li>Wyeksportuj nieprzetworzone dane do pliku arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Określ kinetykę wzrostu drożdży za pomocą MDTcalc, dostosowanego oprogramowania, które oblicza minimalny czas (w godzinach), w którym komórki podwajają swoją populację (minimalny czas podwojenia (MDT); szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 4).</li>
</ol>
4. Obliczanie minimalnego czasu podwojenia (MDT): zasady algorytmu MDTcalc

UWAGA: Zasady algorytmu MDTcalc, wykorzystującego reprezentatywną próbkę komórek drożdży Try467 (Tabela 2) hodowanych na kompletnej pożywce SD, są zilustrowane w Tabeli 1 i Rysunku 1, pokazując odpowiednio arkusz kalkulacyjny i wykresy wzrostu.

<ol>
	<li>Odjąć wartości ślepej próby OD600, uzyskane w odpowiednim studzince, od każdego z odczytów uzyskanych w studzience na próbkę. Podziel uzyskane różnice przez 0,55 (dla płytek 96-dołkowych), aby skorygować długość ścieżki światła. Wykreślić wartości końcowe (Tabela 1, Trans.) w czasie, aby uzyskać rzeczywistą krzywą wzrostu drożdży (OD600/h) (Rysunek 1A).</li>
	<li>Oblicz log2 (OD600) dla każdej z przekształconych wartości, aby przekształcić logarytmiczną fazę wzrostu w krzywą liniową (rysunek 1B).</li>
	<li>Oblicz nachylenie interwału 10 punktów czasowych (N=10) rozpoczynającego się w czasie 0 i poruszającego się po jednym punkcie czasowym na raz aż do N<10 (Tabela 1, Nachylenie; Rysunek 1C).</li>
	<li>Oblicz odwrotną wartość każdego nachylenia, aby uzyskać czas wymagany do podwojenia populacji komórek (Tabela 1, 1/Nachylenie; Rysunek 1C). Oblicz minimalną wartość 1/nachylenie, aby określić MDT (Tabela 1, prostokąt; Rysunek 1C). Wyodrębnij obliczony MDT dla komórek w próbce (Tabela 1, 1/Nachylenie, prostokąt) z wybranego przedziału czasu (Tabela 1, obrysowana czerwonym prostokątem, rysunki 1B, 1D). 
	UWAGA: Szybkość wzrostu komórek na pożywce SD-URA jest odwrotnie proporcjonalna do MDT.</li>
</ol>
5. Korzystanie z MDTcalc
<ol>
	<li>Skopiuj uzupełnione pliki programu do wyznaczonego folderu w komputerze.</li>
	<li>Upewnij się, że plik arkusza kalkulacyjnego zawierający dane o wzroście został zapisany i zamknięty. Otwórz aplikację MDTcalc, aby wyświetlić ekran startowy.
	<ol>
		<li>Wprowadź wymagane informacje, jak pokazano na rysunku 2:
		<ol>
			<li>W sekcji "Ścieżka pliku" kliknij prostokąt po prawej stronie, aby zlokalizować plik arkusza kalkulacyjnego.</li>
			<li>W sekcji "Nazwa arkusza" wpisz nazwę arkusza kalkulacyjnego, w którym znajdują się nieprzetworzone dane.</li>
			<li>W polu "Pozycja początkowa" wstaw współrzędną czasu 0 pierwszej próbki w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
			<li>W polu "Kolumna czasu" wstaw literę określającą położenie kolumny z punktem czasu (czas należy podać w sekundach).</li>
			<li>W polu "Pusta kolumna" należy wstawić literę określającą położenie pustej kolumny (zazwyczaj, ale niekoniecznie w studzienku A1 płytki 96-dołkowej).</li>
			<li>W polu "Wartość OD" wybierz minimalną przekształconą wartość OD600 wymaganą do rozpoczęcia obliczeń MDT (zwykle 0,15-0,25). Ustawienie tej wartości uniemożliwia obliczenia MDT dla kultur w fazie opóźnienia z powodu nadmiernego rozcieńczenia, tak aby MDT był obliczany tylko dla próbek, które osiągają zdefiniowaną wartość OD600 lub wyższą.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po wprowadzeniu ostatniej wartości naciśnij przycisk "oblicz" u dołu ekranu. Upewnij się, że pasek postępu po prawej stronie stopniowo zmienia kolor na zielony. Nie otwieraj pliku arkusza kalkulacyjnego podczas procesu obliczania.</li>
		<li>Wyeksportuj do arkusza kalkulacyjnego dwa zestawy danych, które pojawiają się automatycznie na ekranie po zakończeniu obliczeń MDT. Należy zapewnić, aby dane zawierały: a) wartość MDT dla każdej studzienki, która przeszła test minimalnej wartości OD (jak określono w sekcji 5.2.1.6) oraz b) początkowy punkt czasowy przedziału, od którego obliczono MDT (czas rozpoczęcia).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li>
<li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li>
<li>Tyers, M., Jorgensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+the+cell+cycle%3A+with+this+RING+I+do+thee+destroy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).</li>
<li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT%CE%B12+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li>
<li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li>
<li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica.%2C+%26+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li>
<li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li>
<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+construction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 185-202 (2006).</li>
<li>Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analyses+of+sumoylated+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Induction+of+protein+sumoylation+by+cellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li>
<li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms%3A+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li>
<li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope%2Fendoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li>
<li>Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+soluble+substrates+of+the+Doa10+ubiquitin+ligase+are+degraded+by+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways.</a> EMBO J. 25, 533-543 (2006).</li>
<li>Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li>
<li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator%3A+the+yeast+2+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li>
<li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li>
<li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuthrie%2C+C+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. 194, Academic Press. (1991).</li>
<li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li>
<li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li>
<li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li>
<li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li>
<li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li>
<li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy test oparty na wzroście komórek w celu określenia względnych szybkości degradacji białek, określany jako "Kinetyka wzrostu w hodowli płynnej w warunkach selektywnych" (GiLS). Test GiLS ma kilka zalet: jest prosty w konfiguracji, pozyskiwanie i analiza danych jest proste i jest niezwykle modułowy. W związku z tym GiLS może być stosowany jednocześnie do wielu próbek w przyjaznym dla użytkownika formacie płytki wielodołkowej, którą można dostosować do automatyzacji w zastosowaniach o wysokiej przepus...

System degradacji ubikwityny i proteasomu jest główną maszyną regulacyjną, która jest zaangażowana w utrzymanie homeostazy białek u wszystkich eukariontów. UPS początkowo sprzęga wiele cząsteczek ubikwityny z białkiem docelowym, po czym białko znakowane poli-ubikwityną jest degradowane przez proteasom 26S. W większości przypadków etapem ograniczającym szybkość degradacji za pośrednictwem ubikwityny jest ubikwitylacja substratu, w której pośredniczą enzymy sprzężone E2 i enzymy ligujące E3 (ligazy E3)1. W związku z tym stabilność wewnątrzkomórkowa określonych białek odzwierciedla ich podatność na sprzęganie ubikwityny i aktywność pokrewnych im enzymów ubikwitylacji.
E3 ligazy są głównymi komponentami UPS do rozpoznawania substratów. W związku z tym enzymy te rozpoznają degrony w swoich substratach, które są albo nieobecne, albo nie są odsłonięte w ich stabilnych odpowiednikach 2. Na przykład wiele regulatorów cyklu komórkowego musi być syntetyzowanych i degradowanych w określony czasowo sposób, aby utrzymać porządek w cyklu komórkowym. Degradacja tych białek jest często kontrolowana przez fosforylację, w której pośredniczą kinazy regulowane sygnalizacją komórkową 3,4. Z drugiej strony, nieprawidłowo pofałdowane białka są rozpoznawane przez tajemnicze degrony. Są to obszary, które zwykle są ukryte w strukturze natywnej i są odsłonięte podczas perturbacji struktury. Do takich degronów należą domeny hydrofobowe 5-7 i wewnętrznie nieuporządkowane segmenty8. 
Od czasu odkrycia przełomowego systemu ubikwityny do degradacji białek i scharakteryzowania jego podstaw w lizatach retikulocytów9, genetyka drożdży odegrała kluczową rolę w odkryciu wielu składników układu ubikwityny10. Sukces drożdży jako organizmu modelowego do systematycznej analizy degradacji białek przez UPS wynika głównie z faktu, że UPS jest wysoce konserwatywny u wszystkich eukariontów4, w połączeniu z ich podatnością jako systemu eksperymentalnego. Rzeczywiście, systemy oparte na drożdżach są powszechnie stosowane do rozszyfrowywania mechanizmów działania maszynerii ubikwitylacji.
Badanie degradacji białek za pomocą środków biochemicznych zazwyczaj wymaga przygotowania ekstraktów komórkowych. Podczas gdy białka komórek zwierzęcych mogą być ekstrahowane w stosunkowo łagodnych warunkach, które zachowują interakcje i funkcję białek, obecność solidnej ściany komórkowej u drożdży11 wymaga znacznie ostrzejszych warunków rozerwania, które mogą wpływać na regenerację białek. Rzeczywiście, różne procedury rozbijania komórek drożdży różnią się znacznie pod względem ich zdolności do odzyskiwania nienaruszonych białek w ilościach, które prawidłowo reprezentują ich względną obfitość komórkową. Dalsza nieścisłość jest nieodłącznie związana z różnymi metodami stosowanymi do określania szybkości degradacji określonych białek: eksperymenty oparte na znakowaniu metabolicznym polegające na "pogoni za impulsami", po których następuje immunoprecypitacja w celu wyizolowania określonych białek12, często nie są ściśle ilościowe. W związku z tym, gdy degradacja białek jest porównywana tą metodą, należy zachować szczególną ostrożność przy interpretacji wyników. Aby obejść tę wadę, można zastosować alternatywny test pościgowy cykloheksymidu (CHX)12. W tym teście inhibitor translacji jest dodawany do kultur komórkowych, a następnie monitorowane są czasowe zmiany poziomów białka w stanie stacjonarnym. Niemniej jednak stosowanie CHX jest ograniczone do białek o stosunkowo krótkim okresie półtrwania (< 90 min), ponieważ długotrwałe hamowanie syntezy białek jest cytotoksyczne. Warto zauważyć, że oba wyżej wymienione testy wymagają użycia przeciwciał specyficznych dla białka, które nie zawsze są dostępne.
Aby przezwyciężyć te techniczne ograniczenia, badacze opracowali kilka podejść, które nie wymagają ekstrakcji komórek i bezpośredniego obchodzenia się z białkami. Jedno z podejść opiera się na tworzeniu auksotroficznych szczepów drożdży, otrzymywanych przez delecję genów kodujących niezbędne enzymy metaboliczne. Do takich genów należą HIS3, LEU2, LYS2 i TRP1, kodujące enzymy niezbędne do biosyntezy aminokwasów, a także URA3, który koduje dekarboksylazę OMP (Ura3), niezbędny enzym biosyntezy rybonukleotydów pirymidynowych. Ura3 jest szeroko stosowany w badaniach degradacji białek. W tych testach konstytutywna ekspresja Ura3 ratuje wzrost komórek ura3 w pożywce z niedoborem uracylu 13. W związku z tym destabilizacja Ura3 poprzez fuzję degronu może zmniejszyć wzrost komórek na minimalnym podłożu pozbawionym uracylu. Metoda ta została wykorzystana w różnych badaniach degradacji białek, w tym w identyfikacji determinantów degradacji5, ligaz E314 i pomocniczych czynników ubikwitylacji15 oraz odkryciu nowych degronów UPS16. Wszystkie te metody wykorzystywały wzrost komórek na płytkach agarowych jako odczyt testu. Jednak kryterium wzrostu (wzrost dodatni/ujemny), choć solidne i skuteczne, ma głównie charakter jakościowy i nie dostarcza informacji ilościowych, które są ważne dla oceny siły działania degronu lub względnego udziału różnych pomocniczych czynników degradacji.
Dlatego opracowaliśmy i wykorzystaliśmy wektory drożdży oraz metody przesiewowe, które umożliwiają systematyczną i ilościową analizę degradacji białek przez system fuzji URA3-degron. Protokół opiera się na łatwym w obsłudze teście, który mierzy kinetykę wzrostu w kulturze płynnej w warunkach selektywnych (GiLS) oraz na generowaniu standardowych krzywych wzrostu. Kinetyka wzrostu drożdży charakteryzuje się trzema głównymi fazami - fazą opóźnienia, fazą wykładniczą (logarytmiczną) i fazą stacjonarną. Obliczanie kinetyki replikacji drożdży podczas fazy logarytmicznej w warunkach selektywnych, które jest określane na podstawie poziomów ekspresji Ura3-degronu, zapewnia bezstronny ilościowy pomiar degradacji białka. Metoda ta może być stosowana do pomiaru i porównywania szybkości degradacji wielu podłoży UPS jednocześnie, w wielu szczepach i w różnych warunkach.

<table><tbody><tr><td>Drożdżowa baza azotowa Difco bez aminokwasów i siarczanu amonu</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td>Do wzrostu drożdży na minimalnych pożywkach SD.&nbsp; Aminokwasy, które należy dostarczyć to: Arginina, Histydyna, Izoleucyna, Leucyna, Lizyna, Metionina, Fenyloalanina, Treonina, Tryptofan</td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy</td><td>Najwyższy Dostępna czystość&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Można użyć dowolnej innej kompatybilnej marki</td></tr><tr><td>Cykloheksamid&nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C7698</td><td>Stężenie robocze 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO series</td><td>Tecan</td><td></td><td>Do inkubacji drożdży i pomiarów OD600. Można użyć dowolnego innego kompatybilnego czytnika z kontrolą temperatury.</td></tr><tr><td>Eksperymentalne oprogramowanie</td> <td>MDTcalc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Degradacja białek przez system ubikwityna-proteasom (UPS) jest głównym mechanizmem regulującym homeostazę białek u wszystkich eukariontów. Standardowe podejście do określania wewnątrzkomórkowej degradacji białek opiera się na testach biochemicznych w celu śledzenia kinetyki zaniku białka. Takie metody są często pracochłonne i czasochłonne, a zatem nie nadają się do eksperymentów mających na celu ocenę wielu substratów i warunków degradacji. Alternatywnie opracowano testy oparte na wzroście komórek, które w swoim konwencjonalnym formacie są testami punktu końcowego, które nie mogą ilościowo określić względnych zmian w poziomach białka.
Tutaj opisujemy metodę, która wiernie określa zmiany w tempie degradacji białek, łącząc je z kinetyką wzrostu komórek drożdży. Metoda opiera się na ustalonym systemie selekcji, w którym auksotrofia uracylu komórek drożdży z delecją URA3 jest ratowana przez egzogennie wyrażane białko reporterowe, składające się z fuzji między niezbędnym genem URA3 a determinantem degradacji (degronem). Białko reporterowe jest zaprojektowane w taki sposób, że jego szybkość syntezy jest stała, podczas gdy szybkość jego degradacji jest określana przez degron. Ponieważ wzrost komórek w pożywce z niedoborem uracylu jest proporcjonalny do względnych poziomów Ura3, kinetyka wzrostu jest całkowicie zależna od degradacji białka reporterowego.
Ta metoda dokładnie mierzy zmiany w kinetyce degradacji białek wewnątrzkomórkowych. Zastosowano go do: (a) oceny względnego udziału znanych czynników sprzęgających ubikwitynę z proteolizą (b) analiz strukturalno-funkcyjnych enzymu sprzęgającego E2 (c) identyfikacji i charakterystyki nowych degronów. Zastosowanie systemu opartego na degron-URA3 wykracza poza pole degradacji białek, ponieważ można go również dostosować do monitorowania zmian poziomów białek związanych z funkcjami innych szlaków komórkowych.

Badanie roli enzymów szlaku Doa10 w degradacji substratu reporterowego
Aby przetestować poprawność metody GiLS, porównano ją z tradycyjnym testem degradacji. Niniejszy eksperyment ocenia względny wkład komponentów kompleksu ligazy E3 Doa10 zlokalizowanej w błonie ER20,21 w degradację substratu reporterowego kontroli jakości białek Deg1-VU (Rysunek 3A). Plazmid Deg1-VU zintegrowano z komórkami wild type lub komórkami pozbaw...

Tutaj opisujemy solidny test biologiczny do ilościowego określania względnego tempa proteolizy przez układ ubikwityna-proteasom. Odczyt testu to tempo wzrostu drożdży w płynnej kulturze, które zależy od poziomów komórkowych białka reporterowego składającego się z sygnału degradacji połączonego z niezbędnym markerem metabolicznym.

Test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie zmian w tempie degradacji białek w sposób systematyczny poprzez sprzężenie ich z kinetyką wzrostu drożdży w płynnej kulturze. Osiąga się to poprzez hodowlę pierwszych komórek wykazujących ekspresję białka reporterowego składającego się z sygnału degradacji sprzężonego z markerem metabolicznym w ciągu nocy do fazy stacjonarnej w odpowiednim selektywnym pożywce. Następnie mierzy się gęstość optyczną komórek w celu określenia kinetyki wzrostu komórek, a następnie na podstawie kinetyki wzrostu oblicza się minimalny czas podwojenia komórek podczas fazy logarytmicznej za pomocą specjalnego oprogramowania.Ostatecznie obliczony minimalny czas podwojenia można wykorzystać do zdefiniowania zmian w kinetyce degradacji białek. Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy degradacji cyklaminianu lub pościgu impulsowego, dodali, że nasza technika jest prosta do skonfigurowania. Pozyskiwanie i analiza danych są proste, a projekt eseju jest niezwykle modułowy.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie degradacji doniczki, takie jak to, które elementy są wymagane do rozpoznania nieprawidłowo zło

reporter-based-growth-assay-for-systematic-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę monitorowania aktywności ubikwityna-proteasomowej w żywych komórkach. Wygenerowano białka fuzyjne: destabilizowane degronem GFP- (GFP-dgn) oraz stabilne GFP-dgnFS, które następnie wprowadzono do komórek za pomocą lentiwirusem wektora ekspresyjnego. Technika ta pozwala na stworzenie stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję GFP-dgn/GFP-dgnFS, w której aktywność ubikwityna-proteasomową można łatwo ocenić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej.

Monitorowanie aktywności układu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego opartego na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) destabilizowanego przez degron (dgn)

W tym filmie demonstrujemy komórkowy test agregacji białek za pomocą inhibitorów proteasomów, które blokują aktywność proteasomu, zapobiegając nieprawidłowo sfałdowanym, zmutowanym białkom, połączonym z fluorescencyjnym znacznikiem, przed degradacją proteasomalną zależną od ubikwityny, prowadzącą do ich akumulacji w cytoplazmie komórki. Agregaty białkowe są następnie wizualizowane i oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test tworzenia agregatów białkowych: metoda wykrywania i ilościowego określania agregacji białek w hodowanych komórkach po indukcji przez inhibitor proteasomu

Ten film opisuje test degradacji dla nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą leczenia cykloheksymidem wraz z frakcjonowaniem detergentem. Metoda ta pomaga w badaniu dynamiki nieprawidłowo sfałdowanych białek i odkrywaniu dogłębnych mechanizmów obrotu białkami.

Test degradacji białek podatnych na nieprawidłowe fałdowanie: technika monitorowania nieprawidłowo sfałdowanej degradacji białek przy użyciu obróbki cykloheksymidem i frakcjonowania detergentem

Ukierunkowana degradacja białek stanowi główny mechanizm regulujący funkcjonowanie komórki. Zachodzi za pośrednictwem konserwatywnego szlaku ubikwityna-proteasom, który przyłącza łańcuchy poliubikwityny do białka docelowego, które następnie służą jako molekularne "znaczniki" dla proteasomu 26S. W tym miejscu opisujemy prosty i niezawodny bezkomórkowy test proteasomalnej degradacji białek.

Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

Genetyczny test reporterowy jest dobrze znanym i potężnym narzędziem do analizowania relacji między sekwencjami DNA a ich aktywnością regulacyjną genów. Sprzężenie potencjalnych elementów regulatorowych z genami reporterowymi, które przenoszą identyfikujące znaczniki sekwencji, umożliwia masową równoległość tych testów.

Masowo równoległe testy reporterowe w hodowanych komórkach ssaków

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Ten protokół opisuje metodę określania okresu półtrwania białek w pojedynczych żywych komórkach przylegających, przy użyciu znakowania impulsowego i fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego białek fuzyjnych znaczników SNAP.

Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

Ten protokół opisuje ilościowe wykrywanie kinetyki degradacji białek w żywych komórkach, które zostały zaprojektowane przy użyciu CRISPR/Cas9 do ekspresji znacznika wykrywania endogennego białka wolnego od przeciwciał połączonego z białkiem docelowym. Dołączone są szczegółowe instrukcje dotyczące obliczania i uzyskiwania ilościowych parametrów degradacji, szybkości, Dmax, DC50 i Dmax50.

Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje proces metabolicznego znakowania starzejących się i niedzielących się komórek za pomocą pulsacyjnego SILAC, nieukierunkowaną analizę spektrometrii mas i uproszczone obliczanie okresów półtrwania białek.

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Poznaj metodę testu wzrostu opartego na reporterze do analizy degradacji białek w drożdżach. Technika ta pozwala systematycznie mierzyć kinetykę proteolizy poprzez pomiar czasu podwojenia komórek.

Test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek

Przeglądaj więcej filmów