Nowa technika analizy ilościowej wypadania włosów u myszy z wykorzystaniem analizy w skali szarości
9 marca 2015
Łysienie jest powszechną formą wypadania włosów, która może wystąpić w wielu różnych stanach, w tym jako efekt uboczny chemioterapii. Opracowaliśmy metodę ilościowego określania wypadania włosów u myszy, wykorzystując standardowy obrazownik żelowy do przeprowadzenia analizy w skali szarości, aby ułatwić badanie obiecujących nowych terapii łysienia.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie gęstości włosów za pomocą absorpcji światła. Osiąga się to poprzez uprzednie sfotografowanie zwierząt za pomocą naświetlarki żelowej. Kolejnym krokiem jest zdefiniowanie obszaru zainteresowania na zdjęciu i określenie absorpcji światła w obszarze zainteresowania.
Następnie absorpcja światła jest porównywana ze standardem fotograficznym. Ostatecznie absorpcję światła można uśrednić między podobnie leczonymi zwierzętami, aby pokazać wpływ interwencji na wzrost włosów. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest bezstronna, policzalna i powtarzalna.
Jest to niezwykle ważne, ponieważ pozwala na wykorzystanie standardów, technik statystycznych, takich jak Inova, do określenia istotności statystycznej wyników. Do tego protokołu użyj imagera żelowego z wbudowanym źródłem światła do fotografii refleksyjnej. Zapewnia to dobrą jednorodność światła, podczas gdy oświetlenie trans tworzy sylwetki nienadające się do analizy.
Zacznij od przygotowania imagera żelowego, ustaw ostrość i pole view. Korzystając z wydrukowanego tekstu, mysz może być nieco nieostra, ponieważ to faktycznie działa. Aby zmniejszyć błędy kwantowe w małych obszarach zainteresowania, należy zweryfikować jednorodność źródła światła w fotografowanym obszarze w celu uzyskania doskonałego uśrednienia optycznego w obszarze zainteresowania.
Następnie przygotuj zwierzę. Wybierz środek znieczulający, który szybko się rozpocznie i będzie działał krótko, i podaj tylko tyle, aby zwierzęta pozostały nieruchomo podczas fotografowania. Teraz umieść zwierzęta na imagerze pionowo i jak najbliżej równoległości.
W przypadku zdjęć grzbietowych należy umieścić zwierzęta w pozycji leżącej z wyciągniętymi kończynami. W przypadku zdjęć brzusznych należy umieścić zwierzęta w pozycji leżącej. Upewnij się, że nie są obrócone na boki.
Wartości absorpcji można przeciągać między obrazami, ale nie do tego maszyna została zaprojektowana. Tak więc dodanie standardu skali szarości pozwala nam znormalizować wartości absorpcji podczas kompilacji danych. Teraz umieść standard skali szarości w fotografowanym regionie.
Następnie zamknij komorę i zmniejsz oświetlenie otoczenia, które mogłoby dostać się do komory w aparacie. Ustaw przysłonę na ekspozycję, która sprawi, że obszar zainteresowania nie będzie przesycony ani niedoświetlony. Następnie zrób zdjęcie.
Jeśli przysłona F zostanie wybrana w taki sposób, że obraz jest nasycony, wartość skali szarości zostanie ustalona na wartości i B nieprzydatnej. Następnie zmień przysłonę o jeden, zachowując obszar zainteresowania i standard w liniowym zakresie ekspozycji, a następnie zrób drugie zdjęcie z zakończoną fotografią. Połóż zwierzęta na rozgrzewającym stole i monitoruj je, aż wyzdrowieją.
Mostek leżący. Następnie wróć zwierzęta do klatek, a ostatecznie do wiwarium w celu pełnego wyzdrowienia. Aby określić ilościowo absorpcję światła za pomocą oprogramowania do obrazowania żelowego, zaznacz obszary zainteresowania na obrazach zwierząt w widoku grzbietowym całego zwierzęcia.
Użyj prostokątnego obrazu, owalnego obrazu lub narzędzia wolnej ręki, aby obrysować przestrzeń od kończyn górnych do kończyn dolnych, rozciągając się na boki tak bardzo, jak to możliwe. Trzymaj się w obrębie krawędzi grzbietu zwierzęcia, aby uzyskać widok brzuszny całego zwierzęcia. Użyj dwóch prostokątów.
Jeden do zakrycia okolicy miednicy, która jest zadbana, a drugi do zakrycia obszaru klatki piersiowej, który nie jest zadbany. Mniejsze obszary zainteresowania, takie jak miejsce, w którym podawano lek, mogą być również oznaczone jako wymagane. Po drugie, zaznacz obszar zainteresowania w standardzie absorpcji w skali szarości.
Następnie zapisz absorpcję z każdego zaznaczonego obszaru zainteresowania w celu porównania między zdjęciami. Znormalizuj poziomy absorpcji do standardu tła przy użyciu logarytmicznej relacji ekspozycji do absorpcji. Aby to zrobić, należy wykreślić krzywą logarytmu ekspozycji w stosunku do logarytmu absorpcji.
Korzystając z wartości uzyskanych ze standardu absorpcji skali szarości, dostosuj je do zmian w standardzie każdego zdjęcia w następujący sposób. Najpierw wybierz przysłonę do odczytu zwrotu z inwestycji i przysłonę z punktu odniesienia i oblicz średnią absorpcję normy na wszystkich zdjęciach przy odczycie przysłony. Średnia ta jest standardową wartością referencyjną lub RSV.
Następnie oblicz różnicę w absorpcji między odczytanymi i referencyjnymi ustawieniami przysłony na każdym zdjęciu i wykonaj te same obliczenia dla normy i dla każdego zdefiniowanego zwrotu z inwestycji. Teraz, korzystając z danych z jednej wartości przysłony, oblicz skorygowaną absorpcję dla każdego zwrotu z inwestycji, korzystając z pokazanego wzoru. Następnie zastosuj standardowe metody statystyczne do analizy danych myszy wszczepionych C3 HHEJ, które modelowe łysienie ADA analizowano przy użyciu opisanej metody przy różnych ekspozycjach.
Różnice w nienakładającym się ROI były ściśle skorelowane zgodnie z oczekiwaniami. Podobne porównania dały tę samą ścisłą korelację w okresie trzech tygodni. Myszy zostały zobrazowane w celu ilościowego określenia ich oczekiwanego wypadania włosów.
80% sfotografowanych myszy wykazało wypadanie włosów w tym przedziale czasowym. Dla porównania, normalne myszy C 57 black six nie wykazywały żadnej utraty włosów w tym samym czasie. W drugim badaniu łysienie wywołane chemioterapią określono ilościowo przy użyciu opisanej techniki.
Myszy były leczone cyklofosfamidem przez trzy tygodnie i po dwóch miesiącach wykazały znaczną utratę włosów w porównaniu z grupą kontrolną. Po opanowaniu każdy obraz może zostać przeanalizowany w mniej niż pięć minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo ilość wzrostu włosów u gryzoni za pomocą standardowego systemu obrazowania żelowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Łysienie jest powszechną formą utraty włosów, która może wystąpić w wyniku różnych stanów, w tym chemioterapii. Niniejsze badanie przedstawia metodę ilościowego określania utraty włosów u myszy z wykorzystaniem obrazownika żeli do analizy skali szarości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Badania nad utratą włosów
Wstęp
- Łysienie może być wynikiem wielu czynników, w tym leczenia medycznego.
- Kwantyfikacja utraty włosów jest niezbędna do oceny nowych terapii.
- Standardowe techniki obrazowania mogą zwiększyć dokładność badań.
- Celem tej metody jest zapewnienie powtarzalnego podejścia do pomiaru gęstości włosów.
Cel badania
- Opracowanie metody ilościowego pomiaru gęstości owłosienia u myszy.
- Ułatwienie badań nad nowymi terapiami łysienia.
- Wykorzystanie absorpcji światła do uzyskania dokładnych pomiarów.
Zastosowane metody
- Fotografowanie zwierząt przy użyciu obrazownika żeli.
- Wyznaczanie obszaru zainteresowania na fotografiach.
- Pomiar absorpcji światła w wyznaczonym obszarze.
- Porównanie absorpcji światła ze standardem fotograficznym.
Główne wyniki
- Metoda zapewnia obiektywne i mierzalne wyniki.
- Wartość absorpcji światła może być uśredniona dla zwierząt poddanych podobnym zabiegom.
- Technika jest powtarzalna, co pozwala na uzyskanie spójnych wyników.
- Skutecznie obrazuje ona wpływ interwencji na wzrost włosa.
Wnioski
- Opracowana metoda stanowi wartościowe narzędzie w badaniach nad łysieniem.
- Usprawnia ona możliwość oceny nowych terapii.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej technice ilościowej.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena utraty włosów w modelach przedklinicznych jest kluczowa dla ewaluacji interwencji terapeutycznych w badaniach nad łysieniem. Technika ta zapewnia obiektywną i powtarzalną metodę pomiaru gęstości włosów za pomocą analizy skali szarości, co umożliwia walidację celów w oparciu o dane oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego w potokach przedklinicznych. Poprzez standaryzację kwantyfikacji utraty włosów, metoda ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków i usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu programów ukierunkowanych na leczenie łysienia.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez dostarczenie mierzalnych parametrów utraty włosów w modelach łysienia genetycznego i indukowanego.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki obiektywnemu, zestandaryzowanemu pomiarowi efektów interwencji w zakresie wzrostu włosów.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez generowanie porównywalnych i statystycznie analizowalnych danych dla różnych związków leczniczych.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość testu: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszego przesiewu poprzez ustalenie bazowych oraz traktowanych wartości absorpcji włosa.
- Powtarzalność: Zapewnienie standaryzacji testu poprzez normalizację do wzorca skali szarości oraz spójne definiowanie obszaru zainteresowania.
- Skalowalność: Umożliwienie wiarygodnej oceny związków dzięki szybkiej analizie obrazu (<5 minut na obraz) przy użyciu powszechnie dostępnych systemów do obrazowania żeli.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje łysienie indukowane chemioterapią, łysienie plackowate oraz utratę włosów o podłożu mechanicznym, wspierając dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy kwantyfikację utraty włosów w fazie odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez spójne, podłużne śledzenie.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje dotyczące rozwoju badań poprzez korelację zmian gęstości włosów z skutecznością terapeutyczną w modelach łysienia.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – dostarczając ilościowych i statystycznie przetwarzalnych danych dotyczących utraty włosów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnalizacyjnych poprzez pomiar absorpcji światła jako wskaźnika gęstości włosów u zwierząt traktowanych w porównaniu z grupą kontrolną.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz oraz wyniki ilościowe w postaci znormalizowanych wartości absorpcji, co umożliwia porównania międzyosobnicze i międzygrupowe.
- Analityka: Generuje pomiary zgodne ze standardowymi technikami statystycznymi (ANOVA, test T) w celu oceny istotności efektów interwencji.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki możliwości podłużnego śledzenia utraty i odrastania włosów w modelach mysich istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako powtarzalna metoda w różnych modelach łysienia dzięki oparciu na standardowym sprzęcie do obrazowania żeli i minimalnym wymaganiom w zakresie specjalistycznego przeszkolenia.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w fenotypowaniu modeli łysienia.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki normalizacji skali szarości oraz zdefiniowanym protokołom wyznaczania obszarów zainteresowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne, oparte na danych decyzje go/no-go w rozwoju terapii łysienia.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając mierzalnych i porównywalnych wyników skuteczności dla różnych etiologii łysienia.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się ze zwierzętami, pozyskiwaniu obrazów oraz podstawowej analizie obrazu z wykorzystaniem oprogramowania do obrazowania żeli.
- Zależne od dostępu do urządzenia do obrazowania żeli z możliwością oświetlenia refleksyjnego i narzędziami do standaryzacji skali szarości.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji definicji obszaru zainteresowania (ROI) oraz ustawień ekspozycji w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy stosowaniu jej u różnych szczepów myszy, myszy o różnych kolorach sierści lub przy różnych metodach indukcji łysienia.
- Ograniczone do pomiarów względnej gęstości owłosienia; nie dostarcza szczegółowych danych histologicznych ani molekularnych dotyczących stanu mieszków włosowych.
