Name: Nowa technika analizy ilościowej wypadania włosów u myszy z wykorzystaniem analizy w skali szarości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy wypadania włosów u myszy z wykorzystaniem analizy w skali szarości. Technika ta umożliwia obiektywną ocenę gęstości owłosienia i jest niezwykle przydatna w badaniach nad nowymi terapiami łysienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Szpitalowi Dziecięcemu w Montefiore, Oddziałowi Pediatrii, za wsparcie dla tych badań. Serdecznie dziękujemy Narodowej Fundacji Łysienie Plackowate za wsparcie finansowe w prowadzeniu badań na myszach z implantami C3H/HeJ.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie badania na zwierzętach muszą być zatwierdzone przez IACUC danej instytucji (dla następujących danych, protokoły zostały zatwierdzone przez IACUC Montefiore, protokół #11-6-240 i #13-7-100). Zwierzętom zapewnia się lekkie znieczulenie, jak wskazano, wyłącznie w celu utrzymania ich w bezruchu podczas fotografowania, w przypadku tego protokołu nie są wymagane żadne bolesne procedury.
1. Pozyskiwanie zdjęć
<ol>
	<li>Ustaw ostrość i pole widzenia dla imagera żelowego za pomocą papieru z wydrukowanym tekstem. Sprawdź jednorodność źródła światła w fotografowanym obszarze. Aby zapewnić jednolitość, do fotografii refleksyjnej należy używać imagera żelowego z wbudowanym źródłem światła. Nie należy używać źródła światła z transoświetleniem, ponieważ spowodowałoby to powstanie sylwetki zwierzęcia, która nie nadaje się do dalszej analizy w skali szarości. 
	UWAGA: Spowoduje to nieznaczne rozmycie myszy, co zapewni optyczne uśrednianie w całym obszarze zainteresowania (ROI) i pomoże zmniejszyć błędy ilościowe dla bardzo małych (tj. <10 pikseli) obszarów zainteresowania. Ta niewielka korekta ostrości nie będzie miała wpływu na większe obszary zainteresowania, ani różnice w wielkości zwierzęcia nie będą miały na nie wpływu.</li>
	<li>Znieczulanie zwierząt za pomocą ketaminy (100 mg/ml)/ksylazyny (20 mg/ml) (2:1), ponieważ zapewnia to szybki efekt znieczulenia i szybki powrót do zdrowia oraz jest optymalne do fotografowania wielu zwierząt. 
	UWAGA: Znieczulenie jest potwierdzone, gdy zwierzę jest na tyle nieruchome, że można je sfotografować. Ponieważ zwierzęta zazwyczaj wracają do zdrowia po lekkim znieczuleniu w ciągu 10-15 minut, weterynarz nie zalecił stosowania maści do oczu.</li>
	<li>Umieść znieczulone zwierzęta na obrazie żelowym w linii pionowej (jak najbliżej równoległej).
	<ol>
		<li>W przypadku zdjęć grzbietowych należy umieścić zwierzęta w pozycji leżącej z wyciągniętymi kończynami.</li>
		<li>W przypadku zdjęć brzusznych należy układać zwierzęta w pozycji leżącej, uważając, aby zwierzęta nie były obrócone na boki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść standard skali szarości w fotografowanym regionie.</li>
	<li>Zamknij drzwiczki dostępowe. Ważne: Światło otoczenia może powodować różnice w ekspozycji.</li>
	<li>Ustaw wartość przysłony na ekspozycję, która umieszcza obszar zainteresowania w liniowym zakresie akwizycji (odczyt przysłony). 
	UWAGA: Większość systemów wyświetla miejsca, w których obraz jest nasycony.</li>
	<li>Zrób zdjęcie.</li>
	<li>Zmień przysłonę na inne ustawienie ekspozycji, które umieszcza obszar zainteresowania w zakresie liniowym, zwiększając lub zmniejszając przysłonę o 1, tak aby zarówno norma, jak i obszar zainteresowania pozostały w liniowym zakresie akwizycji (wartość przysłony odniesienia).</li>
	<li>Zrób zdjęcie.</li>
	<li>Po zakończeniu fotografowania umieść zwierzęta na rozgrzewającym stole i monitoruj, aż będą w stanie utrzymać leżącą mostek. Wróć zwierzęta do ich klatek. Zwróć grupę zwierząt do wiwarium, gdy wszystkie zwierzęta w pełni wyzdrowieją.</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja absorpcji światła
<ol>
	<li>Zaznacz obszary zainteresowania na obrazach zwierząt za pomocą dostarczonego oprogramowania do obrazowania żelowego.
	<ol>
		<li>W przypadku widoku grzbietowego całego zwierzęcia należy użyć prostokątnego lub owalnego obrazu rozciągającego się od kończyn górnych do kończyn dolnych, rozciągającego się na boki tak bardzo, jak to możliwe, tak aby żadna część pudełka nie wystawała poza grzbiet zwierzęcia, jak pokazano na rysunku 1A. 
		UWAGA: Można również zaznaczyć obszar zainteresowania za pomocą narzędzia do rysowania odręcznego.</li>
		<li>Aby uzyskać widok brzuszny całego zwierzęcia, użyj 2 prostokątów: jednego zakrywającego obszar miednicy i jednego zakrywającego obszar klatki piersiowej, jak pokazano na rysunku 1B.</li>
		<li>W przypadku mniejszego obszaru zainteresowania, tj. miejsca podania leku, należy oznaczyć jako odpowiednie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaznacz obszar (obszary) zainteresowania na standardzie absorpcji w skali szarości.</li>
	<li>Zapisz absorpcję z każdego z zaznaczonych obszarów zainteresowania.</li>
</ol>
3. Analiza
Poziomy absorpcji uzyskane dla interesujących regionów mogą wymagać normalizacji do standardu tła dla porównania między zdjęciami. Zależność ekspozycji od absorpcji to logarytm (tj. zależność jest liniowa między logarytmem (ekspozycja) a logarytmem (absorpcja)). Korzystając z tej zależności, absorpcję obszaru zainteresowania można znormalizować do standardowej wartości tła, co pozwoli na bezpośrednie porównanie absorpcji między różnymi zdjęciami, w tym tymi wykonanymi w różnych punktach czasowych (tj. pomiary seryjne w ramach protokołu badania). Procedura wykonywania tych korekt jest szczegółowo opisana w opcjonalnych krokach 3.1 i 3.2.
<ol>
	<li>(Opcjonalnie) Wykreśl krzywą logarytmu (ekspozycji) w funkcji logarytmu (absorpcji) przy użyciu wartości uzyskanych ze wzorca absorpcji w skali szarości.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Dostosuj do różnic w standardzie każdego zdjęcia w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wybierz Przysłonę do odczytu (zgodnie z opisem w kroku 1.6) i wartość przysłony dla odniesienia (zgodnie z krokiem 1.8).</li>
		<li>Oblicz średnią absorpcję wzorca na wszystkich zdjęciach przy odczycie przysłony. Średnia ta jest wartością wzorca odniesienia (RSV).</li>
		<li>Obliczyć różnicę w absorpcji między ustawieniami przysłony odczytu i odniesienia na każdym zdjęciu dla normy (delta-S) i dla każdego zdefiniowanego ROI (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ..... delta-ROI-X)</li>
		<li>Oblicz skorygowaną absorpcję dla każdego zwrotu z inwestycji w następujący sposób: Skorygowana absorpcja (ROI-X) = Absorpcja (ROI-X) przy odczycie F-stop + (RSV - absorpcja wzorca przy odczycie F-stop) * (delta-ROI-X /delta-S)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kompilacja danych eksperymentalnych i przeprowadzanie analizy danych przy użyciu standardowych technik statystycznych dla zmiennych ciągłych (np. ANOVA, test T).</li>
</ol>

<ol><li>McAndrews, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+Hair+Loss+Association%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">American Hair Loss Association.</a> , 
 <a target="_blank" href="http://www.americanhairloss.org/men_hair_loss/introduction.asp">http://www.americanhairloss.org/men_hair_loss/introduction.asp</a> (2011).</li>
<li>Safavi, K. H., Muller, S. A., Suman, V. J., Moshell, A. N., Melton, L. J. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+alopecia+areata+in+Olmsted+County%2C+Minnesota%2C+1975+through+1989%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Incidence of alopecia areata in Olmsted County, Minnesota, 1975 through 1989.</a> Mayo Clin Proc. 70 (7), 628-633 (1995).</li>
<li>Hussein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+alopecia%3A+new+developments%5BTitle%5D)+AND+%22South+Med+J%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced alopecia: new developments.</a> South Med J. 86 (5), 489-496 (1993).</li>
<li>Trueb, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+hair+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Therapy+Lett%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced hair loss.</a> Skin Therapy Lett. 15 (7), 5-7 (2010).</li>
<li>Sato, N., Leopold, P. L., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+adenovirus-mediated+expression+of+Sonic+hedgehog+gene+on+hair+regrowth+in+mice+with+chemotherapy-induced+alopecia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Effect of adenovirus-mediated expression of Sonic hedgehog gene on hair regrowth in mice with chemotherapy-induced alopecia.</a> J Natl Cancer Inst. 93 (24), 1858-1864 (2001).</li>
<li>McGarvey, E. L., Baum, L. D., Pinkerton, R. C., Rogers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychological+sequelae+and+alopecia+among+women+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Pract%22%5BJournal%5D)">Psychological sequelae and alopecia among women with cancer.</a> Cancer Pract. 9 (6), 283-289 (2001).</li>
<li>Baxley, K. O., Erdman, L. K., Henry, E. B., Roof, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alopecia%3A+effect+on+cancer+patients%27+body+image%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Nurs%22%5BJournal%5D)">Alopecia: effect on cancer patients' body image.</a> Cancer Nurs. 7 (6), 499-503 (1984).</li>
<li>Stough, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychological+effect%2C+pathophysiology%2C+and+management+of+androgenetic+alopecia+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Psychological effect, pathophysiology, and management of androgenetic alopecia in men.</a> Mayo Clin Proc. 80 (10), 1316-1322 (2005).</li>
<li>Ogunmakin, K. O., Rashid, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alopecia%3A+the+case+for+medical+necessity%5BTitle%5D)+AND+%22Skinmed%22%5BJournal%5D)">Alopecia: the case for medical necessity.</a> Skinmed. 9 (2), 79-84 (2011).</li>
<li>Olsen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+clinical+trial+of+5%25+topical+minoxidil+versus+2%25+topical+minoxidil+and+placebo+in+the+treatment+of+androgenetic+alopecia+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A randomized clinical trial of 5% topical minoxidil versus 2% topical minoxidil and placebo in the treatment of androgenetic alopecia in men.</a> J Am Acad Dermatol. 47 (3), 377-385 (2002).</li>
<li>Rossi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1+mg+daily+administration+on+male+androgenetic+alopecia+in+different+age+groups%3A+10-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Ther%22%5BJournal%5D)">1 mg daily administration on male androgenetic alopecia in different age groups: 10-year follow-up.</a> Dermatol Ther. 24 (4), 455-461 (2011).</li>
<li>Gibbons, R. D., Fiedler-Weiss, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-aided+quantification+of+scalp+hair%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Clin%22%5BJournal%5D)">Computer-aided quantification of scalp hair.</a> Dermatol Clin. 4 (4), 627-640 (1986).</li>
<li>Fleming, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+a+structural+analysis+of+dermatoscopic+imagery%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Med+Imaging+Graph%22%5BJournal%5D)">Techniques for a structural analysis of dermatoscopic imagery.</a> Comput Med Imaging Graph. 22 (5), 375-389 (1998).</li>
<li>Chamberlain, A. J., Dawber, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+evaluating+hair+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Australas+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Methods of evaluating hair growth.</a> Australas J Dermatol. 44 (1), 10-18 (2003).</li>
<li>The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale*. , Imatest. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.imatest.com/docs/q13/">http://www.imatest.com/docs/q13/</a> Forthcoming.</li>
<li>Freyschmidt-Paul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+alopecia+areata+in+C3H%2FHeJ+mice+with+the+topical+immunosuppressant+FK506+%28Tacrolimus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Treatment of alopecia areata in C3H/HeJ mice with the topical immunosuppressant FK506 (Tacrolimus).</a> Eur J Dermatol. 11 (5), 405-409 (2001).</li>
<li>Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Matsushita, O., Sakon, J., Gensure, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prevention+of+chemotherapy-induced+alopecia+with+PTH-CBD%2C+a+collagen-targeted+parathyroid+hormone+analog%2C+in+a+non-depilated+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Treatment and prevention of chemotherapy-induced alopecia with PTH-CBD, a collagen-targeted parathyroid hormone analog, in a non-depilated mouse model.</a> Anticancer Drugs. 25 (1), 30-38 (2014).</li>
<li>Peters, E. M., Foitzik, K., Paus, R., Ray, S., Holick, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+modulating+chemotherapy-induced+alopecia%2C+using+PTH%2FPTHrP+receptor+agonist+and+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A new strategy for modulating chemotherapy-induced alopecia, using PTH/PTHrP receptor agonist and antagonist.</a> J Invest Dermatol. 117 (2), 173-178 (2001).</li>
<li>Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Seymour, A., Sakon, J., Gensure, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+hormone+linked+to+a+collagen+binding+domain+promotes+hair+growth+in+a+mouse+model+of+chemotherapy+induced+alopecia+in+a+dose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-cancer+drugs%22%5BJournal%5D)">Parathyroid hormone linked to a collagen binding domain promotes hair growth in a mouse model of chemotherapy induced alopecia in a dose-dependent manner.</a> Anti-cancer drugs. 25 (7), 819-825 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym raporcie przedstawiono szczegółowy opis nowej techniki ilościowego określania wypadania włosów u gryzoni. Technika ta wykorzystuje do akwizycji i analizy obrazu obrazowanie żelowe, sprzęt, który jest łatwo dostępny w większości laboratoriów. Wykazano, że pomiary są odporne na niewielkie zmiany w technice (ryc. 4-5) i są dobrze skorelowane ze stopniem wizualnego wypadania włosów w modelach leczenia (ryc. 6). Techniki te zostały z powodzeniem zastosowane w oce...

Łysienie (wypadanie włosów) może być psychicznie i emocjonalnie niepokojącym wydarzeniem o wielu przyczynach. Łysienie typu męskiego jest najczęstszą przyczyną łysienia, dotykającą około dwóch trzecich mężczyzn w wieku 35 lat1. Podobny wzorzec wypadania włosów można zaobserwować u kobiet z zespołem policystycznych jajników. W obu tych zaburzeniach wypadanie włosów jest zależne od androgenów. Łysienie może również występować jako choroba autoimmunologiczna, łysienie plackowate, które dotyka 1,7% populacji2. Łysienie może wystąpić jako efekt uboczny niektórych metod leczenia, takich jak chemioterapia3. Wysoki odsetek (65-85%) pacjentów po chemioterapii doświadcza pewnego stopnia łysienia4,5. Psychologiczne konsekwencje wypadania włosów zostały dobrze zbadane w warunkach chemioterapii. Łysienie wywołane chemioterapią może powodować stany lękowe, depresję, negatywny obraz ciała, obniżoną samoocenę i obniżone poczucie dobrego samopoczucia6,7. Wysoki odsetek (47-58%) kobiet chorych na raka uważa wypadanie włosów za najbardziej traumatyczny aspekt chemioterapii, a do 8% odmawia leczenia z obawy przed wypadaniem włosów4,6. Istnieją również dowody na łysienie androgenowe, które wspierają terapię w celu zmniejszenia psychologicznych, a nawet medycznych konsekwencji wypadania włosów8,9. Podobnie, doniesiono, że łysienie plackowate ma poważne konsekwencje psychologiczne2, a niejednolity charakter wypadania włosów może prowadzić do bardziej nieprzyjemnego efektu kosmetycznego niż większość innych przyczyn wypadania włosów.
Podczas gdy leki o łagodnym działaniu antyandrogennym (np. spironolakton) były stosowane z ograniczonym powodzeniem jako terapia łysienia, pierwszym skutecznym lekiem na łysienie był minoksydyl10. Ten lek przeciwnadciśnieniowy ma zaobserwowany efekt uboczny powodujący wzrost włosów i jest obecnie stosowany jako terapia miejscowa w wielu formach łysienia. Jednak odpowiedzi są często niepełne, a niektórzy badani wykazują jedynie spowolnienie wypadania włosów, a nie faktyczny odrost10. Finasteryd jest konkurencyjnym antagonistą 5α-reduktazy typu II, która blokuje konwersję testosteronu do dihydrotestosteronu, co skutkuje poprawą w łysieniu androgenowym kosztem częściowej ogólnoustrojowej blokady androgenów. Odsetek odpowiedzi na leczenie długoterminowe (10 lat) wynosi około 50%11. Ogólnie rzecz biorąc, pomimo wielu badań w tej dziedzinie, nadal nie ma odpowiedniej terapii wypadania włosów.
Przez dziesięciolecia naukowcy i klinicyści badali metody pomiaru wzrostu włosów na skórze głowy w badaniach klinicznych. Wraz z opracowaniem leków leczących łysienie pojawiło się większe zapotrzebowanie na niezawodne, ekonomiczne i minimalnie inwazyjne metody pomiaru wzrostu włosów, a w szczególności odpowiedzi na terapię. Technologia analizy obrazu w celu precyzyjnego ilościowego określenia gęstości włosów u pacjentów z zaburzeniami wypadania włosów przyniosła spójne i ważne wyniki w przeszłości przy użyciu różnych technik, w tym analizy zdigitalizowanych obrazów12, analizy obrazów poszczególnych włosów i zmian skórnych13 oraz skanowania mikroskopowego w celu ilościowego określenia masy włosów w określonym obszarze skóry głowy14 .
Niestety, podczas gdy powyższe metodologie zapewniły lepszą ocenę skuteczności interwencji wspomagających wzrost włosów w badaniach klinicznych, metody te nie zostały zastosowane w badaniach na gryzoniach w badaniach przedklinicznych. Naszym celem jest opracowanie spójnej i wiarygodnej metody ilościowego oznaczania wypadania włosów u myszy, która pozwoli badaczom na dokładniejszą ocenę i porównanie nowych podejść terapeutycznych dla różnych form łysienia. Opracowaliśmy metodologię wykorzystującą sprzęt łatwo dostępny w większości laboratoriów, który pozwoli na szybkie i wiarygodne ilościowe określenie gęstości włosów u myszy o brązowych lub czarnych włosach. Metodologia ta została przetestowana na mysich modelach łysienia wywołanego chemioterapią, łysienia plackowatego i łysienia spowodowanego woskowaniem. Przedstawiono szczegółowy protokół wykonywania tych pomiarów, w tym dane walidacyjne ze szczepów C57BL/6 i C3H/HeJ myszy. Ponieważ technika ta opiera się na wykrywaniu absorpcji światła z pigmentów w łodydze włosa, nie można jej używać do wykrywania wzrostu włosów u myszy białych lub albinosów.

<table><tbody><tr><td>KODAK Gel Logic 100 Imaging System</td><td>Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA</td><td></td><td>Obrazownik żeli do pozyskiwania i analizy fotografii, musi posiadać wbudowane źródło światła do fotografii refleksyjnej.</td></tr><tr><td>The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale</td><td><a href="http://www.imatest.com/docs/q13/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Imatest</a></td><td></td><td>Wzorzec skali szarości</td></tr><tr><td>C57BL/6J Mice</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td>Myszy do badania reprezentacyjnego</td></tr><tr><td>C3H/HeJ engrafted mouse</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td>Myszy do badania reprezentacyjnego</td></tr></tbody></table>

nowa technika analizy ilościowej wypadania włosów u myszy z wykorzystaniem analizy w skali szarości

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Łysienie to powszechna forma wypadania włosów, która może wystąpić w wielu różnych stanach, w tym łysienie typu męskiego, zespół policystycznych jajników i łysienie plackowate. Łysienie może również wystąpić jako efekt uboczny chemioterapii u pacjentów z rakiem. W tym badaniu naszym celem było opracowanie spójnej i wiarygodnej metody ilościowego określania wypadania włosów u myszy, która pozwoli badaczom dokładnie ocenić i porównać nowe podejścia terapeutyczne dla tych różnych form łysienia. Metoda wykorzystuje standardowy obrazownik żelowy do uzyskiwania i przetwarzania obrazów myszy, mierząc absorpcję światła, która występuje w przybliżeniu proporcjonalnie do ilości czarnych (lub siwych) włosów na myszy. Dane, które zostały określone ilościowo w ten sposób, mogą być następnie analizowane przy użyciu standardowych technik statystycznych (tj. ANOVA, test T). Metodologia ta została przetestowana na mysich modelach łysienia wywołanego chemioterapią, łysienia plackowatego i łysienia spowodowanego woskowaniem. W niniejszym raporcie przedstawiono szczegółowy protokół wykonywania tych pomiarów, w tym dane walidacyjne ze szczepów C57BL/6 i C3H/HeJ myszy. Ta nowa technika oferuje szereg korzyści, w tym względną prostotę aplikacji, poleganie na sprzęcie, który jest łatwo dostępny w większości laboratoriów badawczych, oraz zastosowanie obiektywnej, ilościowej oceny, która jest bardziej solidna niż oceny subiektywne. Poprawa w kwantyfikacji wzrostu włosów u myszy usprawni badanie modeli łysienia i ułatwi ocenę obiecujących nowych terapii w badaniach przedklinicznych.

Technikę tę zwalidowano z wykorzystaniem myszy z przeszczepem C3H/HeJ, będących modelem mysim łysienia plackowatego16. U tych zwierząt rozwija się całkowita utrata włosa, która postępuje stopniowo w czasie. Jednakże utrata włosa następuje w formie placków i może różnić się między poszczególnymi osobnikami, co wprowadza znaczną zmienność i utrudnia oceny jakościowe. Model ten umożliwił przetestowanie korelacji między pomiarami gęstości optycznej w różnych miejscach na ciele myszy w celu oceny poprawności metody...

Łysienie jest powszechną formą wypadania włosów, która może wystąpić w wielu różnych stanach, w tym jako efekt uboczny chemioterapii. Opracowaliśmy metodę ilościowego określania wypadania włosów u myszy, wykorzystując standardowy obrazownik żelowy do przeprowadzenia analizy w skali szarości, aby ułatwić badanie obiecujących nowych terapii łysienia.

Nowa technika analizy ilościowej wypadania włosów u myszy z wykorzystaniem analizy w skali szarości

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie gęstości włosów za pomocą absorpcji światła. Osiąga się to poprzez uprzednie sfotografowanie zwierząt za pomocą naświetlarki żelowej. Kolejnym krokiem jest zdefiniowanie obszaru zainteresowania na zdjęciu i określenie absorpcji światła w obszarze zainteresowania.Następnie absorpcja światła jest porównywana ze standardem fotograficznym. Ostatecznie absorpcję światła można uśrednić między podobnie leczonymi zwierzętami, aby pokazać wpływ interwencji na wzrost włosów. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest bezstronna, policzalna i powtarzalna.Jest to niezwykle ważne, ponieważ pozwala na wykorzystanie standardów, technik statystycznych, takich jak Inova, do określenia istotności statystycznej wyników. Do tego protokołu użyj imagera żelowego z wbudowanym źródłem światła do fotografii refleksyjnej. Zapewnia to dobrą jednorodność światła, podczas gdy oświetlenie trans tworzy sylwetki nienadające się do analizy.Zacznij od przygotowania imagera żelowego, ustaw ostrość i pole view. Korzystając z wydrukowanego tekstu, mysz może być nieco nieostra, ponieważ to faktycznie działa. Aby zmniejszyć błędy kwantowe w małych obszarach zainteresowania, należy zweryfikować jednorodność źródła światła w fotografowanym obszarze w celu uzyskania doskonałego uśrednienia optycznego w obszarze zainteresowania.Następnie przygotuj zwierzę. Wybierz środek znieczulający, który szybko się rozpocznie i będzie działał krótko, i podaj tylko tyle, aby zwierzęta pozostały nieruchomo podczas fotografowania. Teraz umieść zwierzęta na imagerze pionowo i jak najbliżej równoległości.W przypadku zdjęć grzbietowych należy umieścić zwierzęta w pozycji leżącej z wyciągniętymi kończynami. W przypadku zdjęć brzusznych należy umieścić zwierzęta w pozycji leżącej. Upewnij się, że nie są obrócone na boki.Wartości absorpcji można przeciągać między obrazami, ale nie do tego maszyna została zaprojektowana. Tak więc dodanie standardu skali szarości pozwala nam znormalizować wartości absorpcji podczas kompilacji danych. Teraz umieść standard skali szarości w fotografowanym regionie.Następnie zamknij komorę i zmniejsz oświetlenie otoczenia, które mogłoby dostać się do komory w aparacie. Ustaw przysłonę na ekspozycję, która sprawi, że obszar zainteresowania nie będzie przesycony ani niedoświetlony. Następnie zrób zdjęcie.Jeśli przysłona F zostanie wybrana w taki sposób, że obraz jest nasycony, wartość skali szarości zostanie ustalona na wartości i B nieprzydatnej. Następnie zmień przysłonę o jeden, zachowując obszar zainteresowania i standard w liniowym zakresie ekspozycji, a następnie zrób drugie zdjęcie z zakończoną fotografią. Połóż zwierzęta na rozgrzewającym stole i monitoruj je, aż wyzdrowieją.Mostek leżący. Następnie wróć zwierzęta do klatek, a ostatecznie do wiwarium w celu pełnego wyzdrowienia. Aby określić ilościowo absorpcję światła za pomocą oprogramowania do obrazowania żelowego, zaznacz obszary zainteresowania na obrazach zwierząt w widoku grzbietowym całego zwierzęcia.Użyj prostokątnego obrazu, owalnego obrazu lub narzędzia wolnej ręki, aby obrysować przestrzeń od kończyn górnych do kończyn dolnych, rozciągając się na boki tak bardzo, jak to możliwe. Trzymaj się w obrębie krawędzi grzbietu zwierzęcia, aby uzyskać widok brzuszny całego zwierzęcia. Użyj dwóch prostokątów.Jeden do zakrycia okolicy miednicy, która jest zadbana, a drugi do zakrycia obszaru klatki piersiowej, który nie jest zadbany. Mniejsze obszary zainteresowania, takie jak miejsce, w którym podawano lek, mogą być również oznaczone jako wymagane. Po drugie, zaznacz obszar zainteresowania w standardzie absorpcji w skali szarości.Następnie zapisz absorpcję z każdego zaznaczonego obszaru zainteresowania w celu porównania między zdjęciami. Znormalizuj poziomy absorpcji do standardu tła przy użyciu logarytmicznej relacji ekspozycji do absorpcji. Aby to zrobić, należy wykreślić krzywą logarytmu ekspozycji w stosunku do logarytmu absorpcji.Korzystając z wartości uzyskanych ze standardu absorpcji skali szarości, dostosuj je do zmian w standardzie każdego zdjęcia w następujący sposób. Najpierw wybierz przysłonę do odczytu zwrotu z inwestycji i przysłonę z punktu odniesienia i oblicz średnią absorpcję normy na wszystkich zdjęciach przy odczycie przysłony. Średnia ta jest standardową wartością referencyjną lub RSV.Następnie oblicz różnicę w absorpcji między odczytanymi i referencyjnymi ustawieniami przysłony na każdym zdjęciu i wykonaj te same obliczenia dla normy i dla każdego zdefiniowanego zwrotu z inwestycji. Teraz, korzystając z danych z jednej wartości przysłony, oblicz skorygowaną absorpcję dla każdego zwrotu z inwestycji, korzystając z pokazanego wzoru. Następnie zastosuj standardowe metody statystyczne do analizy danych myszy wszczepionych C3 HHEJ, które modelowe łysienie ADA analizowano przy użyciu opisanej metody przy różnych ekspozycjach.Różnice w nienakładającym się ROI były ściśle skorelowane zgodnie z oczekiwaniami. Podobne porównania dały tę samą ścisłą korelację w okresie trzech tygodni. Myszy zostały zobrazowane w celu ilościowego określenia ich oczekiwanego wypadania włosów.80% sfotografowanych myszy wykazało wypadanie włosów w tym przedziale czasowym. Dla porównania, normalne myszy C 57 black six nie wykazywały żadnej utraty włosów w tym samym czasie. W drugim badaniu łysienie wywołane chemioterapią określono ilościowo przy użyciu opisanej techniki.Myszy były leczone cyklofosfamidem przez trzy tygodnie i po dwóch miesiącach wykazały znaczną utratę włosów w porównaniu z grupą kontrolną. Po opanowaniu każdy obraz może zostać przeanalizowany w mniej niż pięć minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo ilość wzrostu włosów u gryzoni za pomocą standardowego systemu obrazowania żelowego.

a-new-technique-for-quantitative-analysis-hair-loss-mice-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza specyficzna dla tkanki w modelu regeneracji mieszka włosowego z wykorzystaniem lentiwirusów do mediacji funkcji wzmocnionej (gain-of-function) lub utraconej (loss-of-function).

Szybka analiza genetyczna sygnalizacji nabłonkowo-mezenchymalnej podczas regeneracji włosa

Ten film demonstruje metodę przeszczepiania ludzkiej skóry myszy z niedoborem odporności z obniżoną reakcją neutrofili. Metoda polega na nałożeniu ludzkiej skóry o podzielonej grubości na podłoże przeszczepu myszy, uszczelnieniu jej i przykryciu w celu odzyskania. W końcu ludzka skóra przylega do skóry myszy, ustanawiając unaczynienie i krążenie, co skutkuje udanym ksenoprzeszczepem skóry.

Technika przeszczepiania ludzkiej skóry w modelu mysim

Ten film demonstruje połączone nagrywanie mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych małżowiny usznej myszy. Przedstawiono w nim etapy mechanicznej stymulacji zakończeń nerwowych mieszków włosowych przed i po ekspozycji na barwnik z membrany fluorescencyjnej, elektrofizjologię rejestrującą generowane potencjały czynnościowe oraz wizualizację znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych.

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych myszy

Skóra ssaków zawiera różnorodny wachlarz struktur - takich jak mieszki włosowe i zakończenia nerwowe - które wykazują charakterystyczne wzorce organizacji przestrzennej. Analiza skóry jako płaskiego mocowania wykorzystuje dwuwymiarową geometrię tej tkanki do tworzenia pełnowymiarowych obrazów struktur skóry o wysokiej rozdzielczości.

Obrazowanie skóry myszy metodą flat mount i jego zastosowanie do analizy wzorca mieszków włosowych i morfologii aksonów czuciowych

Ten protokół opisuje, jak generować obustronne rany wycinające o pełnej grubości u myszy oraz jak następnie monitorować, zbierać i przygotowywać rany do analizy morfometrycznej. Dołączono szczegółowy opis sposobu wykorzystania seryjnych odcinków histologicznych do definiowania, precyzyjnego określania ilościowego i wykrywania wad morfometrycznych.

Mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę, która opiera się na mikrotomografii komputerowej, do segmentacji i pomiaru modeli 3D kości czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy, dla lepszej oceny rozwoju kości czaszkowo-szczękowo-twarzowej u myszy niż jest to możliwe przy użyciu obecnych metod.

Analiza malformacji czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy za pomocą trójwymiarowej mikrotomografii komputerowej

Kapilaroskopia jest dostępnym narzędziem do bezpośredniej, taniej i nieinwazyjnej wizualizacji mikrokrążenia. Celem tego protokołu jest umożliwienie naukowcom wykorzystania kapilaroskopii do wizualizacji obwodowej morfologii mikronaczyniowej w łożyskach paznokci myszy.

Nieinwazyjna wizualizacja morfologii mikrokrążenia łożyska paznokcia u myszy za pomocą kapilaroskopii

Celem niniejszego protokołu jest dostarczenie instrukcji i wytycznych dotyczących oceny kruchości fizycznej u laboratoryjnych myszy C57Bl/6x129J. Szczegóły dotyczące każdej miary używanej w indeksie kruchości fizycznej zostały wyjaśnione. Przedstawiono również kilka metod raportowania wyników dotyczących słabości.

Ocena słabości w modelu starzejącej się myszy

Badanie to przedstawia podejście in vivo do obrazowania dwufotonowego do wizualizacji struktur niskoprogowych zakończeń aksonów mechanoreceptorów (LTMR) w skórze przedniej łapy myszy. Wykorzystując powtarzalne, wysokorozdzielcze obrazowanie poszczególnych aksonów, metoda ta stanowi nową platformę do badania struktury i funkcji skórnego obwodu czuciowego podczas rozwoju oraz u dorosłych.

Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

Poznaj metodę ilościowej analizy wypadania włosów u myszy z wykorzystaniem analizy w skali szarości. Technika ta umożliwia obiektywną ocenę gęstości owłosienia i jest niezwykle przydatna w badaniach nad nowymi terapiami łysienia.

Nowa technika analizy ilościowej wypadania włosów u myszy z wykorzystaniem analizy w skali szarości

Przeglądaj więcej filmów