Nowa technika analizy ilościowej wypadania włosów u myszy z wykorzystaniem analizy w skali szarości

Łysienie jest powszechną formą wypadania włosów, która może wystąpić w wielu różnych stanach, w tym jako efekt uboczny chemioterapii. Opracowaliśmy metodę ilościowego określania wypadania włosów u myszy, wykorzystując standardowy obrazownik żelowy do przeprowadzenia analizy w skali szarości, aby ułatwić badanie obiecujących nowych terapii łysienia.

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie gęstości włosów za pomocą absorpcji światła. Osiąga się to poprzez uprzednie sfotografowanie zwierząt za pomocą naświetlarki żelowej. Kolejnym krokiem jest zdefiniowanie obszaru zainteresowania na zdjęciu i określenie absorpcji światła w obszarze zainteresowania.

Następnie absorpcja światła jest porównywana ze standardem fotograficznym. Ostatecznie absorpcję światła można uśrednić między podobnie leczonymi zwierzętami, aby pokazać wpływ interwencji na wzrost włosów. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest bezstronna, policzalna i powtarzalna.

Jest to niezwykle ważne, ponieważ pozwala na wykorzystanie standardów, technik statystycznych, takich jak Inova, do określenia istotności statystycznej wyników. Do tego protokołu użyj imagera żelowego z wbudowanym źródłem światła do fotografii refleksyjnej. Zapewnia to dobrą jednorodność światła, podczas gdy oświetlenie trans tworzy sylwetki nienadające się do analizy.

Zacznij od przygotowania imagera żelowego, ustaw ostrość i pole view. Korzystając z wydrukowanego tekstu, mysz może być nieco nieostra, ponieważ to faktycznie działa. Aby zmniejszyć błędy kwantowe w małych obszarach zainteresowania, należy zweryfikować jednorodność źródła światła w fotografowanym obszarze w celu uzyskania doskonałego uśrednienia optycznego w obszarze zainteresowania.

Następnie przygotuj zwierzę. Wybierz środek znieczulający, który szybko się rozpocznie i będzie działał krótko, i podaj tylko tyle, aby zwierzęta pozostały nieruchomo podczas fotografowania. Teraz umieść zwierzęta na imagerze pionowo i jak najbliżej równoległości.

W przypadku zdjęć grzbietowych należy umieścić zwierzęta w pozycji leżącej z wyciągniętymi kończynami. W przypadku zdjęć brzusznych należy umieścić zwierzęta w pozycji leżącej. Upewnij się, że nie są obrócone na boki.

Wartości absorpcji można przeciągać między obrazami, ale nie do tego maszyna została zaprojektowana. Tak więc dodanie standardu skali szarości pozwala nam znormalizować wartości absorpcji podczas kompilacji danych. Teraz umieść standard skali szarości w fotografowanym regionie.

Następnie zamknij komorę i zmniejsz oświetlenie otoczenia, które mogłoby dostać się do komory w aparacie. Ustaw przysłonę na ekspozycję, która sprawi, że obszar zainteresowania nie będzie przesycony ani niedoświetlony. Następnie zrób zdjęcie.

Jeśli przysłona F zostanie wybrana w taki sposób, że obraz jest nasycony, wartość skali szarości zostanie ustalona na wartości i B nieprzydatnej. Następnie zmień przysłonę o jeden, zachowując obszar zainteresowania i standard w liniowym zakresie ekspozycji, a następnie zrób drugie zdjęcie z zakończoną fotografią. Połóż zwierzęta na rozgrzewającym stole i monitoruj je, aż wyzdrowieją.

Mostek leżący. Następnie wróć zwierzęta do klatek, a ostatecznie do wiwarium w celu pełnego wyzdrowienia. Aby określić ilościowo absorpcję światła za pomocą oprogramowania do obrazowania żelowego, zaznacz obszary zainteresowania na obrazach zwierząt w widoku grzbietowym całego zwierzęcia.

Użyj prostokątnego obrazu, owalnego obrazu lub narzędzia wolnej ręki, aby obrysować przestrzeń od kończyn górnych do kończyn dolnych, rozciągając się na boki tak bardzo, jak to możliwe. Trzymaj się w obrębie krawędzi grzbietu zwierzęcia, aby uzyskać widok brzuszny całego zwierzęcia. Użyj dwóch prostokątów.

Jeden do zakrycia okolicy miednicy, która jest zadbana, a drugi do zakrycia obszaru klatki piersiowej, który nie jest zadbany. Mniejsze obszary zainteresowania, takie jak miejsce, w którym podawano lek, mogą być również oznaczone jako wymagane. Po drugie, zaznacz obszar zainteresowania w standardzie absorpcji w skali szarości.

Następnie zapisz absorpcję z każdego zaznaczonego obszaru zainteresowania w celu porównania między zdjęciami. Znormalizuj poziomy absorpcji do standardu tła przy użyciu logarytmicznej relacji ekspozycji do absorpcji. Aby to zrobić, należy wykreślić krzywą logarytmu ekspozycji w stosunku do logarytmu absorpcji.

Korzystając z wartości uzyskanych ze standardu absorpcji skali szarości, dostosuj je do zmian w standardzie każdego zdjęcia w następujący sposób. Najpierw wybierz przysłonę do odczytu zwrotu z inwestycji i przysłonę z punktu odniesienia i oblicz średnią absorpcję normy na wszystkich zdjęciach przy odczycie przysłony. Średnia ta jest standardową wartością referencyjną lub RSV.

Następnie oblicz różnicę w absorpcji między odczytanymi i referencyjnymi ustawieniami przysłony na każdym zdjęciu i wykonaj te same obliczenia dla normy i dla każdego zdefiniowanego zwrotu z inwestycji. Teraz, korzystając z danych z jednej wartości przysłony, oblicz skorygowaną absorpcję dla każdego zwrotu z inwestycji, korzystając z pokazanego wzoru. Następnie zastosuj standardowe metody statystyczne do analizy danych myszy wszczepionych C3 HHEJ, które modelowe łysienie ADA analizowano przy użyciu opisanej metody przy różnych ekspozycjach.

Różnice w nienakładającym się ROI były ściśle skorelowane zgodnie z oczekiwaniami. Podobne porównania dały tę samą ścisłą korelację w okresie trzech tygodni. Myszy zostały zobrazowane w celu ilościowego określenia ich oczekiwanego wypadania włosów.

80% sfotografowanych myszy wykazało wypadanie włosów w tym przedziale czasowym. Dla porównania, normalne myszy C 57 black six nie wykazywały żadnej utraty włosów w tym samym czasie. W drugim badaniu łysienie wywołane chemioterapią określono ilościowo przy użyciu opisanej techniki.

Myszy były leczone cyklofosfamidem przez trzy tygodnie i po dwóch miesiącach wykazały znaczną utratę włosów w porównaniu z grupą kontrolną. Po opanowaniu każdy obraz może zostać przeanalizowany w mniej niż pięć minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo ilość wzrostu włosów u gryzoni za pomocą standardowego systemu obrazowania żelowego.