Name: Eksperymentalna ocena towarzyskości myszy przy użyciu podejścia do zautomatyzowanego przetwarzania obrazu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę automatycznej analizy wideo do oceny towarzyskości myszy w modelach autyzmu. To podejście znacząco przyspiesza badania nad lekami poprawiającymi zachowania społeczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Virginia's Commonwealth Health Research Board.

W celu ułatwienia wyjaśnień protokół został podzielony na 2 części: 1) Procedura eksperymentalna oraz 2) Analiza automatyczna. Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z Guide for the Care and Use of Laboratory Animals15, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Procedura eksperymentalna
<ol>
	<li>Przygotuj klatkę, która stanowi czarne, nierefleksyjne prostokątne pudełko z pleksiglasu (52 x 25 x 23 cm3) podzielone na trzy przedziały: społeczny, niespołeczny oraz neutralny przedział środkowy (Rysunek 1). W każdym z końcowych przedziałów umieść odwrócone druciane kubki podczas sesji I i II (omówionych poniżej) i umieść w nich mysz bodziec podczas sesji II.</li>
	<li>Ustaw kamerę w taki sposób, aby klatka wypełniała pole widzenia. Ponieważ oświetlenie może wpływać na zachowanie myszy, należy utrzymać natężenie oświetlenia wewnątrz klatki na poziomie nieprzekraczającym 3,5 lux, pochodzącego z pośredniego światła żarówki żarowej i mierzonego na dnie klatki w kierunku górnym. Należy również użyć źródła światła podczerwonego, którego myszy nie wyczuwają, ale które jest wykrywane przez kamerę. Wszystkie filmy należy nagrywać w standardowej rozdzielczości 720 x 480.</li>
	<li>Zarejestruj pojedynczą klatkę pustej klatki do późniejszego przetwarzania obrazu (tzw. „klatka referencyjna”) i zapisz ją jako obraz w skali szarości.</li>
	<li>Sesja I: Wprowadź mysz badaną do klatki i pomachaj ręką nad klatką, sygnalizując rozpoczęcie sesji (por. Analiza automatyczna). Nagrywaj film przez 10 min. Po upływie 10 min umieść mysz z powrotem w jej oryginalnej klatce.</li>
	<li>Sesja II: Umieść mysz bodziec pod jednym z odwróconych kubków (z zastosowaniem przeciwwagi).</li>
	<li>Użyj przycisku „Social left” (Społeczny lewy) lub „Social right” (Społeczny prawy), aby wybrać, czy mysz bodziec znajduje się w odwróconym kubku po lewej, czy po prawej stronie. 
	UWAGA: Odwrócony kubek z myszą bodziec nazywany jest „kubkiem społecznym”, natomiast drugi kubek „kubkiem niespołecznym”. Przedział, w którym znajduje się kubek społeczny, nazywany jest przedziałem społecznym, przedział z kubkiem niespołecznym to przedział niespołeczny, a przedział środkowy to „przedział neutralny”.</li>
	<li>Wprowadź mysz badaną do klatki. Pomachaj ręką nad klatką, aby zasygnalizować rozpoczęcie sesji. Nagrywaj film przez 10 min. Ważne jest, aby utrzymać myszy w aparaturze do badania socjalizacji przed usunięciem odwróconych kubków w celu rozpoczęcia sesji III.</li>
	<li>Sesja III: Usuń odwrócone kubki, wypuść obie myszy i pozwól myszy badanej oraz myszy bodziec na swobodną interakcję. Pomachaj ręką nad klatką, aby zasygnalizować rozpoczęcie sesji. Nagrywaj film przez 10 min. Po upływie 10 min umieść obie myszy z powrotem w ich odpowiednich klatkach.</li>
</ol>
2. Analiza zautomatyzowana
UWAGA: Polecenia w sekcji 2 są wydawane za pośrednictwem graficznego interfejsu użytkownika (patrz Rysunek 2), który steruje naszym oprogramowaniem. Poniżej wyjaśniamy krok po kroku procesy możliwe do przeprowadzenia w naszym oprogramowaniu; program ten umożliwia również przeprowadzenie analizy w trybie wsadowym bez ingerencji użytkownika.
<ol>
	<li>Dla każdego filmu wykonaj następujące kroki przetwarzania:
	<ol>
		<li>Wczytaj film (kliknij przycisk Load).</li>
		<li>Wybierz konfigurację klatki, która informuje program analityczny o położeniu granic klatki, granic przedziałów oraz lokalizacji kubków. Wybierz jedną z czterech zapisanych konfiguracji lub ręcznie dostosuj wszystkie współrzędne. 
		UWAGA: Konfiguracja zazwyczaj nie zmienia się między kolejnymi eksperymentami, dlatego może zostać wykorzystana ponownie.</li>
		<li>Dla każdej klatki filmu wykonaj następujące kroki przetwarzania (2.1.3.1-2.1.3.6).
		<ol>
			<li>Konwertuj klatkę na skalę szarości, klikając przycisk „Grayscale”.</li>
			<li>Odejmij cyfrowo referencyjną klatkę w skali szarości (patrz krok 1.3), klikając przycisk „Subtract”. UWAGA: Celem tego kroku jest sprawienie, aby wartości pikseli klatki były bardzo bliskie zeru wszędzie poza pozycją myszy.</li>
			<li>Zbinaryzuj klatkę, ustawiając wszystkie piksele poniżej określonego poziomu progu na czarne, a wszystkie piksele powyżej tego poziomu na białe (kliknij przycisk „Binarize”). 
			Uwaga: Założeniem jest to, że ponieważ piksele myszy mają zazwyczaj wyższe wartości niż pozostałe piksele, piksele myszy staną się białe, a wszystkie pozostałe czarne. Optymalny poziom progu zależy od warunków oświetlenia i można go określić, oceniając kształt myszy w całym filmie. Jeśli próg zostanie wybrany zbyt nisko, mysz wydaje się zbyt duża i piksele, które nie należą do myszy, mogą zostać pokolorowane na biało. Jeśli próg jest zbyt wysoki, mysz staje się mała i może rozpaść się na niepołączone fragmenty. W nagranych filmach optymalny próg zawsze mieścił się w zakresie od 20 do 35 (w skali od 0 do 255).</li>
			<li>Wykonaj erozję13 zbinaryzowanego obrazu e razy, następnie dylatację13 2e razy, a potem ponownie erozję e razy, naciskając przycisk „Erod/Dil”. 
			Uwaga: Celem tej procedury jest usunięcie ogona. Dla zastosowanej rozdzielczości (720 x 480) wartość e = 3 sprawdziła się we wszystkich przypadkach. 
			Uwaga: Oprogramowanie automatycznie sprawdza obecność dłoni na obrazie (podczas nagrywania filmów dłonie są przesuwane przez kadr, aby zasygnalizować początek sesji). Jeśli dłoń jest obecna, w zbinaryzowanej klatce pojawi się nietypowo duża liczba białych pikseli, ponieważ dłoń jest znacznie większa od myszy. Warunkiem stwierdzenia obecności dłoni jest wystąpienie ponad 10 000 białych pikseli w zbinaryzowanej klatce. Oprogramowanie wyznacza początki sesji I, II i III poprzez wykrywanie zakresu klatek, w których występują ruchy dłoni.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W sesjach I i II kontynuuj w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wykryj największą spójną składową zbioru białych pikseli (kliknij „LComp”). Uwaga: Celem tego kroku jest wyeliminowanie białych pikseli, które nie należą do myszy, np. tych spowodowanych ruchem myszy bodźca w sesji II. Największa spójna składowa w prawie wszystkich klatkach jest myszą.</li>
		<li>Wyznacz dwa najbardziej oddalone od siebie białe piksele (nazywane „końcami” myszy), klikając „Find Ends”. 
		Uwaga: Oprogramowanie ustala ciągłość tych dwóch końców, tj. przypisuje każdy z końców w pierwszej klatce do odpowiedniego końca w klatkach następnych. Ogólna zasada polega na tym, że ponieważ klatki są rejestrowane z wysoką częstotliwością, końce nie mogą przemieścić się daleko między jedną klatką a drugą, zatem prawidłowa kontynuacja końców z jednej klatki do następnej jest taka, która minimalizuje sumę odległości, o jakie przemieściły się końce. Więcej szczegółów znajduje się w sekcji Discussion.</li>
		<li>Określ, który koniec myszy jest nosem.
		<ol>
			<li>Wyznacz kierunek, w którym porusza się mysz, obserwując, jak zmienia się środek ciężkości (COG) z klatki na klatkę (ruch COG jest ruchem sumy wszystkich pikseli myszy). 
			Uwaga: Środek ciężkości (COG) zbioru pikseli p1, ... , pn o współrzędnych x1, .. , xn jest definiowany przez: 
			<img alt="Równanie środka ciężkości Σpixi/Σpi; schemat formuły matematycznej; obliczanie punktu równowagi." src="/files/ftp_upload/52508/52508eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
			Myszy zazwyczaj poruszają się naprzód (tj. w kierunku nosa). W sekcji obejmującej kilkaset klatek zawsze istnieje bardzo wysoka pewność co do wykrycia głowy/ogona. 
			Uwaga: Oprogramowanie automatycznie określa, w stronę którego z wykrytych końców porusza się mysz; koniec ten jest identyfikowany jako nos i zaznaczany czerwonym kółkiem na filmie. Gdy wykryty nos jest zaznaczony czerwonym kółkiem w każdej klatce, użytkownik może sprawdzić jakość detekcji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W sesji III kontynuuj w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wykryj dwie największe składowe białych pikseli.
		<ol>
			<li>Jeśli obie mają rozmiar akceptowalny dla myszy, a ich środki ciężkości (COG) są zgodne z COG myszy z poprzedniej klatki, uznaj te dwie składowe za dwie myszy.</li>
			<li>Uznaj rozmiary myszy za akceptowalne, jeśli nie zmieniły się o więcej niż 20% od poprzedniej klatki, a COG dwóch kolejnych klatek uznaj za zgodne, jeśli ich różnica nie jest większa niż odległość, jaką mysz może pokonać w czasie między klatkami (odległość ta wynika z maksymalnej prędkości myszy, którą można określić w ramach przygotowań do serii eksperymentów poprzez analizę ruchu kilku poszczególnych myszy (jak w sesjach I i II). 
			Uwaga: Jeśli dwie największe składowe nie mają rozmiarów akceptowalnych dla myszy lub ich COG zbyt mocno różnią się od tych w poprzedniej klatce, oprogramowanie automatycznie zwiększa próg binarizacji, aż dwie największe składowe osiągną akceptowalny rozmiar, a ich COG będą zgodne z tymi z poprzedniej klatki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kliknij mysz testową w pierwszej klatce. Użyj analizy z punktu 2.3.1, aby zidentyfikować zarówno mysz testową, jak i bodziec w każdej klatce sesji III.</li>
		<li>Zidentyfikuj klatki w sesji III, w których jedna mysz zbliża się społecznie do drugiej. Uwaga: Oprogramowanie realizuje ten krok poprzez automatyczne sprawdzanie, czy odległość między myszami jest mniejsza niż typowa odległość interakcji myszy (używamy 2 cm).</li>
		<li>Gdy oprogramowanie odtworzy dla użytkownika krótki fragment filmu z wykrytym zbliżeniem, kliknij przycisk, aby wskazać, czy zbliżenie to kwalifikuje się jako zbliżenie społeczne myszy testowej, unikanie społeczne myszy testowej, czy żadne z powyższych. 
		Uwaga: Krok 2.3.4 może zostać zautomatyzowany, jeśli wiadomo, która mysz jest myszą testową. Ponieważ informacja ta zostaje utracona, gdy myszy znajdą się zbyt blisko siebie (lub wejdą jedna na drugą), a nie znaleźliśmy jeszcze sposobu znakowania myszy, który mógłby być wiarygodnie wykrywany przez nasze oprogramowanie I nie wpływałby na ich zachowanie, na razie powróciliśmy do klasyfikacji ręcznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ocenić przetworzone filmy, wczytaj film za pomocą przycisku Load.
	<ol>
		<li>Kliknij Start Session 1, aby wyświetlić pierwszą klatkę sesji 1 (lub Start Session 2, aby wyświetlić pierwszą klatkę sesji 2).</li>
		<li>Kliknij Play/Stop, aby odtworzyć i zatrzymać filmy. 
		Uwaga: Przetworzone filmy będą wyświetlać mysz z głową i ogonem zaznaczonymi kółkami o różnych kolorach. Wszystkie miary socjalizacji są wyświetlane na ekranie i aktualizowane w miarę odtwarzania filmu.</li>
		<li>Eksportuj dane o socjalizacji w formacie Excel, klikając „Export”.</li>
		<li>Kliknij „Compile Data”, aby skompilować wszystkie dane ze wszystkich filmów w folderze do jednego pliku Excel.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brodkin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BALB%2Fc+mice%3A+Low+sociability+and+other+phenotypes+that+may+be+relevant+to+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">BALB/c mice: Low sociability and other phenotypes that may be relevant to autism.</a> Behavioural Brain Research. 176, 53-65 (2007).</li>
<li>Deutsch, S. I., Burket, J. A., Urbano, M. R., Herndon, A. L., Winebarger, E. E. Impaired sociability of the BALB/c mouse, an animal model of autism spectrum disorders, is attenuated by NMDA receptor agonist interventions: clinical implications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeutsch%2C+SI+%22Comprehensive+Book+on+Autism+Spectrum+Disorders%22">Comprehensive Book on Autism Spectrum Disorders</a>. Mohammadi, M. A. , InTech. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.intechopen.com/books/a-comprehensive-book-on-autism-spectrum-disorders/impaired-sociability-of-the-balb-c-mouse-an-animal-model-of-autism-spectrum-disorders-is-attenuated">http://www.intechopen.com/books/a-comprehensive-book-on-autism-spectrum-disorders/impaired-sociability-of-the-balb-c-mouse-an-animal-model-of-autism-spectrum-disorders-is-attenuated</a> 323-342 (2011).</li>
<li>Dunn, M. E., Burbine, T., Bowers, C. A., Tantleff-Dunn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderators+of+stress+in+parents+of+children+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Mental+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Moderators of stress in parents of children with autism.</a> Community Mental Health Journal. 37, 39-52 (2001).</li>
<li>Babineau, B. A., Yang, M., Berman, R. F., Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+home+cage+social+behaviors+in+BTBR+T%2Btf%2FJ+mice+during+juvenile+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Low home cage social behaviors in BTBR T+tf/J mice during juvenile development.</a> Physiology & Behavior. 114-115, 49-54 (2013).</li>
<li>Benson, A. D., Burket, J. A., Deutsch, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BALB%2Fc+mice+treated+with+d-cycloserine+arouse+increased+social+interest+in+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">BALB/c mice treated with d-cycloserine arouse increased social interest in conspecifics.</a> Brain Research Bulletin. 99, 95-99 (2013).</li>
<li>Burket, J. A., Benson, A. D., Tang, A. H., Deutsch, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+improves+sociability+in+the+BTBR+T%28%2B%29Itpr3%28tf%29%2FJ+mouse+model+of+autism+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Rapamycin improves sociability in the BTBR T(+)Itpr3(tf)/J mouse model of autism spectrum disorders.</a> Brain Research Bulletin. 100, 70-75 (2014).</li>
<li>Burket, J. A., Benson, A. D., Tang, A. H., Deutsch, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-Cycloserine+improves+sociability+in+the+BTBR+T%2B+Itpr3tf%2FJ+mouse+model+of+autism+spectrum+disorders+with+altered+Ras%2FRaf%2FERK1%2F2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">D-Cycloserine improves sociability in the BTBR T+ Itpr3tf/J mouse model of autism spectrum disorders with altered Ras/Raf/ERK1/2 signaling.</a> Brain Research Bulletin. 96, 62-70 (2013).</li>
<li>Burket, J. A., Herndon, A. L., Deutsch, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotor+activity+of+the+genetically+inbred+BALB%2Fc+mouse+strain+is+suppressed+by+a+socially+salient+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Locomotor activity of the genetically inbred BALB/c mouse strain is suppressed by a socially salient stimulus.</a> Brain Research Bulletin. 83, 255-256 (2010).</li>
<li>Deutsch, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-cycloserine+improves+sociability+and+spontaneous+typic+behaviors+in+4-week+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">D-cycloserine improves sociability and spontaneous typic behaviors in 4-week old mice.</a> Brain Research. 1439, 96-107 (2012).</li>
<li>Jacome, L. F., Burket, J. A., Herndon, A. L., Deutsch, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+inbred+BALB%2Fc+mice+differ+from+outbred+Swiss+Webster+mice+on+discrete+measures+of+sociability%3A+relevance+to+a+genetic+mouse+model+of+autism+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Research%22%5BJournal%5D)">Genetically inbred BALB/c mice differ from outbred Swiss Webster mice on discrete measures of sociability: relevance to a genetic mouse model of autism spectrum disorders.</a> Autism Research. 4, 393-400 (2011).</li>
<li>Jacome, L. F., Burket, J. A., Herndon, A. L., Cannon, W. R., Deutsch, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-serine+improves+dimensions+of+the+sociability+deficit+of+the+genetically-inbred+BALB%2Fc+mouse+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">D-serine improves dimensions of the sociability deficit of the genetically-inbred BALB/c mouse strain.</a> Brain Research Bulletin. 84, 12-16 (2011).</li>
<li>Deutsch, S. I., Burket, J. A., Jacome, L. F., Cannon, W. R., Herndon, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-Cycloserine+improves+the+impaired+sociability+of+the+BALB%2Fc+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">D-Cycloserine improves the impaired sociability of the BALB/c mouse.</a> Brain Research Bulletin. 84, 8-11 (2011).</li>
<li>Shih, F. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShih%2C+FY+%22Image+Processing+and+Mathematical+Morphology%3A+Fundamentals+and+Applications%22">Image Processing and Mathematical Morphology: Fundamentals and Applications</a>. , CRC Press. (2009).</li>
<li>Nixon, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNixon%2C+M+%22Feature+Extraction+%26+Image+Processing%22">Feature Extraction & Image Processing</a>. , Academic Press. (2008).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , Eighth Edition, The National Academic Press. (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dzięki połączeniu nagrywania myszy oraz automatycznej analizy filmów stworzyliśmy przystępną cenowo i niezawodną technikę przesiewania wysokoprzepustowego.
Dokładność zautomatyzowanej analizy porównano z wynikami analizy ręcznej dla ponad 100 filmów. W przytłaczającej większości klatek (&gt; 99%) nos myszy został zidentyfikowany z wysoką precyzją. Większość z (nielicznych) błędnych detekcji nie wpływa na miary socjalizacji, dzięki czemu około 80% filmów nie wymaga żadnych korekt.
<p class=...

Upośledzona towarzyskość jest jedną z głównych domen objawów w wielu zaburzeniach neurorozwojowych, w tym w zaburzeniach ze spektrum autyzmu (ASD)1,2. Poważnie ogranicza zdolność pacjentów do nawiązywania relacji i ma ogromny wpływ na pacjentów, ich rodziny i opiekunów2,3.
W celu lepszego zrozumienia mechanizmu leżącego u podstaw upośledzonej towarzyskości i opracowania metod leczenia, przebadano kilka modeli mysich1,4–9. Jednym z takich szczepów jest mysz BALB/c, szczep wsobny, który wykazuje uderzająco niską towarzyskość, przypominającą cechy obserwowane u pacjentów z ASD58-12. Na przykład mysz BALB/c wykazuje niższą częstotliwość podejść społecznych i zwykle negatywną reakcję na podejścia społeczne ze strony myszy bodźcowej (np. unikanie społeczne) niż szwajcarski szczep porównawczy Webstera10.
Aby sprawdzić, czy proponowana terapia jest skuteczna w zwiększaniu towarzyskości, potrzebne są obiektywne środki. Powszechnie akceptowanym modelem jest analiza towarzyskości w znormalizowanym aparacie, który ma trzy komory (patrz rysunek 1).
Lewa i prawa komora zawierają odwrócony druciany kubek, w którym znajduje się społecznie istotna mysz stymulacyjna. Mysz testową wprowadza się do aparatury na trzy interwały po 10 minut (sesje I-III); sesja I ocenia aktywność lokomotoryczną myszy testowej, podczas gdy sesje II i III oceniają różne aspekty towarzyskości myszy testowej.
W sesji I, mysz testowa może się zaaklimatyzować w urządzeniu. W tej sesji mierzona jest liczba przejść, które mysz testowa wykonuje między różnymi przedziałami. Co ważne, miary towarzyskości uzyskane w standardowym aparacie trójkomorowym są zależne od aktywności lokomotorycznej, a zmniejszona aktywność lokomotoryczna może zakłócić interpretację danych dotyczących towarzyskości.
W sesji II, mysz testowa porusza się swobodnie, a mysz bodźcowa jest umieszczana pod jednym z odwróconych kubków (z przeciwwagą). Myszy bodźcowe to 4-tygodniowe niekrewniacze samce myszy ICR, dopasowane pod względem wieku i płci do myszy testowych. Mysz bodźcowa jest zamknięta w odwróconym kubku po stronie wyznaczonej jako przedział społeczny, a pusta odwrócona filiżanka jest umieszczana po stronie wyznaczonej jako przegródka niespołeczna. W sesji II towarzyskość myszy testowej jest określana ilościowo poprzez porównanie czasu, jaki spędza w pobliżu "społecznego" odwróconego kubka (mniej niż 2 cm dalej) z czasem, który spędza w pobliżu "niespołecznego" odwróconego kubka, oraz przez czas, jaki spędza w przedziale społecznym z czasem, który spędza w przedziale niespołecznym. Szwajcarskie myszy porównawcze Webstera spędzają znacznie więcej czasu w przedziale społecznym i w pobliżu odwróconego kubka społecznego w porównaniu z myszami BALB/c, które nie wykazują znaczącej preferencji dla społecznego odwróconego kubka lub przedziału społecznego12.
W sesji III, myszy testowe i stymulujące mogą swobodnie wchodzić w interakcje (odwrócone kubki są usuwane). Miary towarzyskości, zachowań stereotypowych i przejść między przedziałami są wiarygodnie uzyskiwane w trzeciej 10-minutowej sesji swobodnej interakcji między myszami testowymi i bodźcami i analizowane. W tym raporcie towarzyskość myszy testowej jest określana ilościowo za pomocą dwóch miar: 1) liczby podejść społecznych, które wykonuje w stosunku do myszy bodźcowej, przy czym podejście społeczne definiuje się jako poruszanie się do przodu (najpierw nosem) w kierunku myszy bodźcowej, tak że nos znajduje się w odległości mniejszej niż 2 cm od myszy bodźcowej; 2) liczba unikań podejść społecznych przez mysz bodźcową. Uważa się, że mysz testowa unika podejścia, jeśli odwróci się lub odsunie od myszy bodźcowej, lub jeśli tymczasowo przestanie się poruszać ("zachowanie zamrażające") po zbliżeniu się myszy bodźcowej do myszy testowej. Myszy BALB / c wykazują spadek liczby podejść społecznych dokonywanych w stosunku do myszy bodźcowej i wzrost liczby negatywnych reakcji na podejścia społeczne przez mysz bodźcową, w porównaniu ze szwajcarskim szczepem porównawczym Webster10.
Ocena filmów behawioralnych była tradycyjnie wykonywana ręcznie, tj. poprzez uważne oglądanie filmu (możliwie ze zmniejszoną prędkością) i aktywowanie stoperów na czas, który mysz spędza w określonej komorze lub w pobliżu jednego z odwróconych kubków10. Metoda ta wymaga wielokrotnego oglądania filmu i dlatego jest bardzo czasochłonna. Dokładność jest również ograniczona czasem reakcji oceniającego na pomiary stopera i zdolnością do postrzegania, czy mysz znajduje się w odległości nie większej niż 2 cm od odwróconego kubka. W ostatnich pracach dwa związki (D-seryna i D-cykloseryna) okazały się skuteczne w przywracaniu towarzyskości u myszy BALB/c9,10,12. Wiadomo, że oba składniki modulują receptor NMDA, o którym wiadomo, że odgrywa kluczową rolę w zachowaniach społecznych2,12. Wiadomo, że szeroka gama związków moduluje aktywność receptora NMDA na różne, dobrze zdefiniowane sposoby, a potencjał przełomu w leczeniu ASD sprawia, że przyspieszona ocena tych związków jest priorytetem i szybką automatyczną metodą oceny, która jest wysoce pożądana.
Opisana poniżej jest automatyczna procedura analizy opracowana do oceny towarzyskości myszy. Wykorzystuje metody przetwarzania obrazu we wszystkich klatkach filmów myszy w celu zidentyfikowania pozycji myszy lub myszy. W sesjach I i II dodatkowo wykrywa pozycję nosa i wykorzystuje ją do obliczania miar towarzyskości. W sesji III automatycznie wykrywa wszystkie podejścia, ale wymagana jest ręczna klasyfikacja (podejście społeczne, unikanie społeczne lub inne).

<table><tbody><tr><td>Klatka z pleksiglasu</td><td>Norva Plastics, Norfolk, VA</td><td>na zamówienie</td><td>Wymiary i układ opisane w rękopisie, można dostosować do potrzeb. Użyj nieodblaskowej pleksi, aby ułatwić przetwarzanie obrazu</td></tr><tr><td>Kubki druciane</td><td>Kuchnia plus</td><td>315</td><td>Użyj jednego do domu myszy stymulującej, jednego pustego</td></tr><tr><td>Kamera wideo</td><td>SONY</td><td>HDR-PJ790</td><td>Może być zastąpiony przez dowolną kamerę z Porównywalne specyfikacje</td></tr><tr><td>OpenCV (biblioteka przetwarzania obrazu)</td><td>Willow Garage</td><td>N/A</td><td>Można użyć dowolnej nowoczesnej biblioteki przetwarzania obrazu .</td></tr></tbody></table>

eksperymentalna ocena towarzyskości myszy przy użyciu podejścia do zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Myszy są preferowanym organizmem modelowym do testowania leków zaprojektowanych w celu zwiększenia socjalizacji. Przedstawiamy metodę ilościowego pomiaru socjalizacji myszy, w której mysz testową umieszcza się w zestandaryzowanym aparacie, a odpowiednie zachowania ocenia się w trzech różnych sesjach (nazwanych sesją I, II i III).
Aparat składa się z trzech przedziałów (patrz Rycina 1); w przedziałach lewym i prawym znajduje się odwrócony kubek, w którym może przebywać mysz (tzw. „mysz bodziec”).
W sesji I mysz testowa zostaje umieszczona w klatce, a jej mobilność jest określana przez liczbę przejść między przedziałami. W sesji II mysz bodźcowa zostaje umieszczona pod jednym z odwróconych kubków, a socjalność myszy testowej jest kwantyfikowana poprzez pomiar czasu spędzonego w pobliżu kubka zawierającego zamkniętą mysz bodźcową vs. pustego odwróconego kubka. W sesji III odwrócone kubki zostają usunięte, a obie myszy wchodzą w swobodną interakcję. Socjalność myszy testowej w sesji III jest kwantyfikowana przez liczbę podejść społecznych skierowanych do myszy bodźcowej oraz liczbę sytuacji, w których mysz testowa unika podejścia społecznego ze strony myszy bodźcowej.
Zautomatyzowana ocena nagrania wykrywa nos myszy testowej, co pozwala na określenie wszystkich opisanych miar socjalizacji w sesji I i II (w sesji III podejścia są identyfikowane automatycznie, ale klasyfikowane ręcznie). Aby zlokalizować nos, z każdej klatki filmu cyfrowo odejmowany jest obraz pustej klatki, a otrzymany obraz jest binaryzowany w celu zidentyfikowania pikseli myszy. Ogon myszy jest usuwany automatycznie, a następnie wyznacza się dwa najbardziej oddalone od siebie punkty pozostałej sylwetki myszy; znajdują się one w pobliżu nosa i nasady ogona. Nos jest identyfikowany poprzez analizę ruchu myszy oraz z zastosowaniem argumentów ciągłości.
<img alt="Schemat śledzenia zachowania myszy w trzech sesjach w celu analizy uczenia się przestrzennego w labiryncie." src="/files/ftp_upload/52508/52508fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ocena socjalizacji podczas 3 sesji. Sesja I (góra): Aklimatyzacja myszy testowej do klatki. Sesja II (środek): Myszy testowa poruszająca się swobodnie w klatce, podczas gdy mysz bodziec jest zamknięta w odwróconym kubku. Sesja III (dół): Zarówno myszy testowej, jak i myszy bodziec pozwolono na swobodne poruszanie się i interakcję ze sobą.

Rycina 3 przedstawia kolorową klatkę z filmu behawioralnego z pustą klatką. Mysz nie została jeszcze wprowadzona do klatki. Na obraz nałożono pozycje kubków (społecznych i niespołecznych) oraz granice przedziałów. Kolorowa klatka z pustą klatką zostaje przekonwertowana na 8-bitową skalę szarości, jak pokazano na Rycynie 4, i służy jako klatka referencyjna. Klatka referencyjna jest odejmowana od każdej kolejnej klatki zarejestrowanego filmu.
Rycina 5</s...

Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania towarzyskości myszy. Myszy są filmowane, gdy poruszają się i wchodzą w interakcje w specjalnej klatce. Przetwarzanie filmów pozwala na zautomatyzowaną kwantyfikację towarzyskości z doskonałą dokładnością i niezawodnością.

Eksperymentalna ocena towarzyskości myszy przy użyciu podejścia do zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Ogólnym celem tych eksperymentów behawioralnych połączonych z automatyczną analizą jest ilościowe określenie socjalizacji myszy w sposób efektywny czasowo. Metoda ta może wspomóc szybki screening leków zwiększających socjalizację w zwalidowanych modelach mysich zaburzeń spektrum autyzmu. Główną zaletą wprowadzenia zautomatyzowanej analizy jest przyspieszenie procesu i zwiększenie efektywności screeningu.Konieczność opracowania zautomatyzowanej metody oceny zachowań społecznych myszy wynikła z faktu, że wizualny screening jednej dawki związku kandydującego w czasie rzeczywistym zajmuje ponad 50 godzin. W dalszej części filmu mój student studiów magisterskich Frency Varghese zaprezentuje zautomatyzowaną analizę. Rozpocznij od przygotowania trójakomodowej klatki z czarnymi ściankami.W pierwszej sesji w każdym z końcowych przedziałów klatki należy umieścić pusty, odwrócony metalowy kubek. Następnie należy przygotować kamerę wideo tak, aby rejestrowała obraz klatki z góry. Wszystkie trzy przedziały powinny być widoczne w rozdzielczości co najmniej 720 na 480 pikseli.Następnie oświetl klatkę pośrednim światłem żarowym w taki sposób, aby natężenie światła wewnątrz klatki, mierzone na poziomie podłogi, nie przekraczało 3,5 Lux. Zapewnij również oświetlenie podczerwienią na poziomie wykrywalnym przez kamerę. Wykonaj pojedynczy kadr pustej klatki do celów referencyjnych.W pierwszej sesji umieść mysz testową w klatce. Następnie, aby uruchomić zautomatyzowaną analizę nagrania wideo, wykonaj jeden ruch ręką nad klatką. Pozwól myszy badać klatkę testową przez 10 minut.Następnie należy zwrócić go do klatki macierzystej. Podczas drugiej sesji należy umieścić mysz-bodziec pod jednym z dwóch odwróconych kubków. Wybór kubka powinien odbywać się w sposób zrównoważony.W oprogramowaniu należy wskazać, pod którym kubkiem umieszczono mysz stymulującą. Zgodnie z przyjętą konwencją nazewnictwa, kubek zawierający zamkniętą mysz to kubek społeczny, natomiast drugi kubek to kubek niespołeczny. Przedziały są nazywane w podobny sposób.Zasygnalizuj początek drugiej sesji ruchem ręki, analogicznie do pierwszej sesji. Na koniec drugiej sesji usuń odwrócone kubki, aby wypuścić drugą mysz. Użyj kolejnego ruchu ręki, aby wskazać początek trzeciej sesji, i pozwól dwóm myszom na interakcję w klatce testowej przez 10 minut.Po 10 minutach należy przenieść obie myszy z powrotem do ich klatek domowych. Ta sekcja wyjaśnia, jak przetwarzać nagrania za pomocą interfejsu użytkownika. Możliwa jest jednak również szybka analiza w trybie wsadowym bez udziału użytkownika.Zacznij od wczytania filmu za pomocą przycisku Load. Następnie wybierz konfigurację klatki. Program analityczny zlokalizuje granice klatki, przedziały i kubki.Wybierz jedną z czterech predefiniowanych konfiguracji lub ręcznie dostosuj współrzędne. Następnie dla każdej klatki filmu wykonaj następujące kroki przetwarzania. Najpierw przekształć klatki na skalę szarości.Następnie należy odjąć obraz referencyjny w skali szarości wykonany podczas przygotowań, aby wyzerować wartości pikseli we wszystkich obszarach z wyjątkiem pozycji myszy. W trzecim kroku należy zbinaryzować klatki, ustawiając wszystkie piksele o jasności powyżej określonego progu na kolor biały, a pozostałe na czarny. Należy dostosować to ustawienie do panujących warunków oświetlenia.Teraz usuń ogon z obrazów, korzystając z funkcji Erozja/Dylatacja (Erode/Dilate). Najpierw przeprowadź trzykrotną erozję zbinaryzowanego obrazu. Następnie wykonaj sześciokrotną dylatację klatki.Następnie wykonaj erozję klatek jeszcze trzy razy. Może to wymagać korekty w przypadku zastosowania innej rozdzielczości pikseli. Ruchy dłoni są łatwo identyfikowalne jako gwałtowne skoki objętości białych pikseli.Umożliwia to automatyczne wykrywanie rozpoczęcia sesji oraz kolejności sesji. W ramach każdej sesji należy wykryć największy komponent białych pikseli za pomocą polecenia L/Comp. Eliminuje to piksele, które nie należą do myszy.Następnie należy użyć funkcji Find Ends, aby wyznaczyć dwa najbardziej oddalone od siebie piksele w obrębie największego komponentu białych pikseli. Są to odpowiednio nos i ogon. Oprogramowanie wyznacza środek ciężkości (COG) obiektu złożonego z białych pikseli i oblicza kierunek jego ruchu z klatki na klatkę.W przypadku sesji z dwiema myszami należy śledzić dwa obiekty. Wybrać i zorientować dwa największe obiekty składające się z białych pikseli, korzystając z tego samego zestawu poleceń. Oprogramowanie automatycznie weryfikuje środki ciężkości (COG) z klatki na klatkę.Jeśli rozmiar któregokolwiek z obiektów zmieni się o więcej niż 20% lub środek ciężkości (COG) przesunie się o dystans przekraczający możliwości ruchu myszy, próg binaryzacji jest automatycznie zwiększany do momentu spełnienia tych kryteriów. Oprogramowanie automatycznie sprawdza położenie środków ciężkości z klatki na klatkę. Jeśli rozmiar któregokolwiek z obiektów zmieni się o więcej niż 20% lub środek ciężkości przesunie się o dystans przekraczający możliwości ruchu myszy, próg binaryzacji jest automatycznie korygowany do momentu spełnienia tych kryteriów.Interakcje są automatycznie wykrywane, gdy obiekty znajdują się w odległości dwóch centymetrów. Segmenty te są odtwarzane w celu wprowadzenia danych przez użytkownika. Dla każdego segmentu należy określić perspektywę myszy testowej jako unikanie społeczne (Social avoidance), podejście społeczne (Social approach) lub żadne z powyższych (Neither).Aby zweryfikować automatyczną analizę, należy wczytać film za pomocą przycisku Load. Następnie należy kliknąć Start Session 1, aby wyświetlić pierwszą klatkę tej sesji. Do sterowania odtwarzaniem należy używać polecenia Play/Stop.Przetworzone filmy przedstawiają każdą mysz z kółkiem innego koloru przy głowie i ogonie. Na ekranie wyświetlane są również miary socjalizacji, które są aktualizowane podczas odtwarzania. Należy poprawić wszelkie błędy napotkane podczas zautomatyzowanej analizy.Najczęstszym błędem jest odwrócenie głowy i ogona, co można naprawić za pomocą narzędzia w interfejsie. Problem ten występuje w około 20% filmów. W rzadkich przypadkach bardziej skomplikowanych błędów można je zazwyczaj rozwiązać poprzez ręczne wskazanie położenia nosa myszy w określonej serii klatek wideo.Po weryfikacji należy wyeksportować dane dotyczące socjalizacji do formatu arkusza kalkulacyjnego za pomocą funkcji Export. Aby wyeksportować dane z wielu filmów do jednego arkusza, filmy muszą zostać zgrupowane w jednym folderze, a operację tę wykonuje funkcja Compile Data. W pierwszej sesji śledzono czterotygodniową mysz testową szczepu BALB/c, która w ciągu 10 minut przemieszczała się między komorami 59 razy.Czas spędzony w każdej z komór uznano za wartość bazową preferencji dotyczących komór bez bodźca społecznego. W drugiej sesji zaprezentowano kubek społeczny oraz niespołeczny, w którym ukryto czterotygodniową mysz szczepu ICR. Zaobserwowano wyraźną tendencję do spędzania czasu w komorze społecznej.Konkretnie mysz spędzała więcej czasu przy kubku z obiektem społecznym niż przy kubku niespołecznym. W trzeciej sesji podniesiono kubki i pozwolono myszom na interakcję. W ciągu 10 minut odnotowano łącznie 35 podejść społecznych.Po opracowaniu technika ta umożliwia szybsze przesiewowe badanie obiecujących leków w celu poprawy głównego obszaru objawów w postaci upośledzonej socjalizacji w walidowanych modelach mysich zaburzeń widma autyzmu. Zautomatyzowany proces przetwarzania można dostosować do różnych konstrukcji klatek oraz gatunków. Każde interesujące zachowanie może zostać ocenione, o ile uda się opracować algorytm pozwalający na jego wiarygodne wykrycie.

experimental-assessment-mouse-sociability-using-an-automated-image

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Eksperymentalna Ocena Społeczności Myszy Za Pomocą Zautomatyzowanego Podejścia Do Przetwarzania Obrazów

W niniejszym materiale opisujemy szczegółowy protokół badania socjalizacji u myszy z wykorzystaniem testu socjalizacji i preferencji nowości społecznej według Crawleya. Opisujemy zalety i możliwe zastosowania tej procedury, w tym istotne szczegóły ważne dla prawidłowej interpretacji wyników.

Ocena zachowań interakcji społecznych

Długotrwałe i kompleksowe monitorowanie myszy w środowisku domowym pozwala na głębsze zrozumienie nieprawidłowych zachowań w mysich modelach chorób mózgu. W artykule opisano Zintegrowaną Stację Behawioralną (INBEST) jako kluczowy komponent współczesnej analizy behawioralnej.

Fenotypowanie behawioralne modeli chorób myszy za pomocą Zintegrowanej Stacji Behawioralnej (INBEST)

Przedstawiamy prosty i bezstronny test węchowy na myszach. Dzięki temu protokołowi dyskryminacja węchowa, preferencje, unikanie i wrażliwość na nowy zapach w porównaniu z wodą mogą być oceniane w pojedynczych sesjach behawioralnych. Ta metoda jest wskazana dla pojedynczego eksperymentatora, a analiza opiera się na komputerowym przetwarzaniu wideo.

Proste i wspomagane komputerowo testy węchowe dla myszy

Mysie ultradźwiękowe wokalizacje są używane jako proxy do modelowania genetycznych podstaw deficytów komunikacji głosowej w mysich modelach zaburzeń neuropsychiatrycznych. Niniejszy protokół opisuje trzy konteksty eksperymentalne, które niezawodnie wywołują ultradźwiękowe wokalizacje od szczeniąt (w trakcie rozwoju) i dorosłych myszy (interakcje tej samej płci, interakcje samca-samicy w rui).

Nagrywanie wokalizacji ultradźwiękowych myszy w celu oceny komunikacji społecznej

Ten protokół mierzy przestrzenne uczenie się i pamięć za pomocą labiryntu Barnesa. Nowatorski paradygmat damy w niebezpieczeństwie służy do oceny aktywności lokomotorycznej i zachowań prospołecznych u myszy.

Analiza uczenia się przestrzennego i zachowań prospołecznych u myszy przy użyciu paradygmatów labiryntu Barnesa i damy w niebezpieczeństwie

Oswajanie u zwierząt obejmuje zmniejszenie reakcji unikania wobec ludzi (pasywne oswajanie) i wzrost aktywnych podejść do ludzi (aktywne oswajanie). W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły dla trzech testów behawioralnych (aktywne oswojenie, pasywne oswojenie i testy pozostania przy ręce), aby oddzielnie zmierzyć aktywną i pasywną oswajalność myszy.

Pomiar aktywnego i pasywnego oswajania oddzielnie u myszy

Opisany tutaj jest nowatorski zautomatyzowany system eksperymentalny, który stanowi alternatywę dla testu trzykomorowego, a także rozwiązuje kilka zastrzeżeń. System ten dostarcza wielu parametrów behawioralnych, które umożliwiają rygorystyczną analizę dynamiki zachowania małych gryzoni podczas testów preferencji społecznych i preferencji nowości społecznych.

System do śledzenia dynamiki zachowań preferencji społecznych u małych gryzoni

Rola niedawno odkrytych genów związanych z chorobą w patogenezie zaburzeń neuropsychiatrycznych pozostaje niejasna. Zmodyfikowana technika obustronnej elektroporacji in utero pozwala na transfer genów w dużych populacjach neuronów i badanie przyczynowego wpływu zmian ekspresji genów na zachowania społeczne.

Rurociąg wykorzystujący obustronną elektroporację in utero do badania wpływów genetycznych na zachowanie gryzoni

Modele gryzoni są cennymi narzędziami do badania podstawowych zachowań związanych z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD). W tym artykule wyjaśniamy dwa testy behawioralne do modelowania podstawowych cech ASD u myszy: samopielęgnację, który ocenia powtarzające się zachowanie, oraz trzykomorowy test interakcji społecznych, który dokumentuje upośledzenia społeczne.

Strategie oceny zachowań podobnych do autystycznych u myszy

Poprzez parowanie negatywnie lub pozytywnie ocenianych doświadczeń z indywidualnymi celami społecznymi, opracowaliśmy zadania behawioralne do badania rozpoznawania tożsamości myszy C57BL/6. Zadania te pozwalają na badanie mechanizmów pamięci społecznej poszczególnych celów społecznych w zdrowych i związanych z chorobą modelach mysich z upośledzonym poznaniem społecznym.

Zadania behawioralne do badania rozpoznawania tożsamości u myszy

Poznaj metodę automatycznej analizy wideo do oceny towarzyskości myszy w modelach autyzmu. To podejście znacząco przyspiesza badania nad lekami poprawiającymi zachowania społeczne.

Eksperymentalna ocena towarzyskości myszy przy użyciu podejścia do zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Przeglądaj więcej filmów