Eksperymentalna ocena towarzyskości myszy przy użyciu podejścia do zautomatyzowanego przetwarzania obrazu
15 maja 2016
Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania towarzyskości myszy. Myszy są filmowane, gdy poruszają się i wchodzą w interakcje w specjalnej klatce. Przetwarzanie filmów pozwala na zautomatyzowaną kwantyfikację towarzyskości z doskonałą dokładnością i niezawodnością.
Ogólnym celem tych eksperymentów behawioralnych w połączeniu z automatyczną analizą jest ilościowe określenie towarzyskości myszy w sposób efektywny czasowo. Metoda ta może pomóc w szybkim badaniu przesiewowym leków w celu zwiększenia towarzyskości w zwalidowanych mysich modelach zaburzeń ze spektrum autyzmu. Główną zaletą wprowadzenia automatycznej analizy jest to, że przyspiesza ona proces i sprawia, że badania przesiewowe są bardziej wydajne.
Potrzeba zautomatyzowanej metody oceny zachowań społecznych myszy pojawiła się, ponieważ wizualne badanie przesiewowe w czasie rzeczywistym pojedynczej dawki potencjalnego związku zajmuje ponad 50 godzin. W dalszej części filmu moja studentka Frency Varghese zademonstruje automatyczną analizę. Zacznij od ustawienia trzykomorowej klatki o czarnych ściankach.
Na pierwszą sesję umieść pusty odwrócony druciany kubek w każdej końcowej komorze klatki. Teraz przygotuj kamerę wideo, aby zobaczyć klatkę z góry. Wszystkie trzy przedziały powinny być widoczne w rozdzielczości co najmniej 720 na 480 pikseli.
Następnie oświetl klatkę pośrednim oświetleniem żarowym, tak aby wnętrze klatki, mierzone od podłogi, miało nie więcej niż 3,5 luksa. Zapewnij również światło podczerwone, aby oświetlić klatkę na poziomie, który kamera może wykryć. Zrób jednoklatkowy obraz pustej klatki w celach informacyjnych.
Na pierwszą sesję umieść mysz testową w klatce. Następnie, aby ustawić się w kolejce do automatycznej analizy wideo, machnij ręką na klatkę tylko raz. Pozwól myszy eksplorować klatkę testową przez 10 minut.
Następnie umieść go z powrotem w klatce domowej. W drugiej sesji umieść mysz bodźcową pod jednym z dwóch odwróconych kubków. Wybierz kubek w sposób przeciwwagi.
W oprogramowaniu wskaż kubek, pod którym została umieszczona mysz bodźcowa. W przypadku konwencji nazewnictwa kubek zawierający zamkniętą mysz jest kubkiem towarzyskim, podczas gdy drugi kubek jest kubkiem niespołecznym. Przedziały są nazwane w podobny sposób.
Ustaw w kolejce początek drugiej sesji z machnięciem ręką, tak jak w pierwszej sesji. Pod koniec drugiej sesji zdejmij odwrócone miseczki, aby zwolnić drugą mysz. Użyj kolejnego machnięcia ręką, aby wskazać początek trzeciej sesji i pozwól dwóm myszom wchodzić w interakcję w klatce testowej przez 10 minut.
Po 10 minutach obie myszy wracają do swoich domowych klatek. W tej sekcji wyjaśniono, jak przetwarzać filmy za pomocą interfejsu użytkownika. Możliwa jest jednak również szybka analiza w trybie wsadowym bez udziału użytkownika.
Zacznij od załadowania filmu za pomocą przycisku Wczytaj. Następnie wybierz konfigurację klatki. Program analityczny lokalizuje granice koszyka, komory i przyssawki.
Wybierz jedną z czterech wstępnie ustawionych konfiguracji lub ręcznie dostosuj współrzędne. Teraz dla każdej klatki filmu wykonaj następujące kroki przetwarzania. Najpierw przekonwertuj klatki na skalę szarości.
Po drugie, odejmij ramkę odniesienia w skali szarości utworzoną podczas przygotowań, zerując w ten sposób wartości pikseli wszędzie, z wyjątkiem pozycji myszy. Po trzecie, należy podzielić klatki na binaryzację, ustawiając wszystkie piksele powyżej progu jasności na kolor biały i sprawiając, że wszystkie pozostałe są czarne. Dostosuj to ustawienie, aby dopasować je do warunków oświetleniowych.
Teraz usuń ogon z obrazów za pomocą funkcji Erode/Dilate. Najpierw trzykrotnie zeroduj zuniaryzowany obraz. Następnie rozszerz ramkę sześć razy.
Następnie zeroduj ramy jeszcze trzy razy. Może to wymagać korekty, jeśli używana jest inna rozdzielczość pikseli. Fale dłoni można łatwo zidentyfikować jako ogromne skoki w głośności białych pikseli.
Pozwala to na automatyczne wykrywanie rozpoczęcia sesji i kolejności sesji. W ramach każdej sesji wykryj największy składnik białych pikseli za pomocą polecenia L/Comp. Eliminuje to piksele, które nie należą do myszy.
Następnie użyj funkcji Znajdź końce, aby określić dwa najbardziej odległe piksele w obrębie największego składnika białych pikseli. Są to nos i ogon. Oprogramowanie określa środek ciężkości lub COG dla obiektu z białymi pikselami i oblicza jego kierunek ruchu z klatki na klatkę.
W przypadku sesji z dwiema myszami należy śledzić dwa obiekty. Zaznacz i zorientuj dwa największe obiekty z białymi pikselami za pomocą tego samego zestawu poleceń. Oprogramowanie automatycznie sprawdza COG z klatki na klatkę.
Jeśli któryś z obiektów zmieni rozmiar o więcej niż 20% lub COG przesunie się dalej niż jest to możliwe dla myszy, próg binaryzacji jest automatycznie zwiększany, aż te kryteria zostaną spełnione. Oprogramowanie automatycznie sprawdza środki ciężkości od ramy do ramy. Jeśli któryś z obiektów zmieni rozmiar o więcej niż 20% lub środek ciężkości przesunie się dalej niż jest to możliwe dla myszy, próg binaryzacji jest automatycznie dostosowywany, aż te kryteria zostaną spełnione.
Interakcje są wykrywane automatycznie, gdy obiekty znajdują się w odległości nie większej niż dwa centymetry. Segmenty te są odtwarzane w celu wprowadzenia danych przez użytkownika. Dla każdego segmentu oznacz perspektywę myszy testowej jako Unikanie społeczne, Podejście społeczne lub Brak.
Aby zweryfikować automatyczną analizę, wczytaj film za pomocą przycisku Załaduj. Następnie kliknij Rozpocznij sesję 1, aby wyświetlić pierwszą klatkę tej sesji. Użyj polecenia Play/Stop, aby sterować odtwarzaniem.
Przetworzone filmy pokazują każdą mysz z innym kolorowym okręgiem na głowie i ogonie. Również miary towarzyskości są wyświetlane na ekranie i aktualizowane podczas odtwarzania. Popraw wszelkie błędy napotkane w automatycznej analizie.
Najczęstszym błędem jest odwrócenie orła-ogona, które można naprawić za pomocą narzędzia w interfejsie. Dzieje się tak w około 20% filmów. W rzadkich przypadkach bardziej skomplikowanego błędu można go zwykle rozwiązać, ręcznie wskazując położenie nosa myszy w określonej serii klatek wideo.
Po weryfikacji wyeksportuj dane towarzyskie w formacie arkusza kalkulacyjnego za pomocą funkcji Eksportuj. Aby wyeksportować dane z wielu filmów jako pojedynczy arkusz kalkulacyjny, filmy muszą być spakowane w jednym folderze, a operację wykonuje funkcja Kompiluj dane. W pierwszej sesji czterotygodniowa mysz testowa BALB/c była śledzona poruszając się między przedziałami 59 razy w ciągu 10 minut.
Czas spędzony w każdym przedziale jest uważany za punkt odniesienia dla preferencji przedziału bez bodźców społecznych. W drugiej sesji zaprezentowano kubek towarzyski i niespołeczny z ukrytą czterotygodniową myszką ICR. Istniała wyraźna tendencja do spędzania czasu w przedziale towarzyskim.
W szczególności mysz spędzała więcej czasu z kubkiem towarzyskim niż z kubkiem niespołecznym. W trzeciej sesji kubki zostały podniesione i myszom pozwolono na interakcję. W sumie w ciągu 10 minut wykonano 35 podejść społecznych.
Po opracowaniu technika ta ułatwia szybsze badania przesiewowe obiecujących leków w celu poprawy podstawowej domeny objawów upośledzonej towarzyskości w zwalidowanych mysich modelach zaburzeń ze spektrum autyzmu. Zautomatyzowane przetwarzanie można dostosować do różnych konstrukcji klatek i gatunków. Każde interesujące zachowanie może zostać ocenione, o ile uda się opracować algorytm do jego niezawodnego wykrywania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę ilościowego oznaczania socjalizacji u myszy z wykorzystaniem zautomatyzowanej analizy nagrań wideo. Podejście to zwiększa efektywność badań przesiewowych socjalizacji w modelach mysich zaburzeń spektrum autyzmu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Badania nad autyzmem
Wstęp
- Ocena socjalizacji myszy jest kluczowa dla zrozumienia zachowań społecznych.
- Tradycyjne metody są czasochłonne i wymagają dużych nakładów pracy.
- Zautomatyzowana analiza może znacznie skrócić czas wymaganego przeprowadzania ocen socjalizacji.
- Metoda ta jest szczególnie istotna w przypadku przesiewania leków w badaniach nad autyzmem.
Cel badania
- Opracowanie efektywnego czasowo sposobu ilościowego pomiaru socjalizacji u myszy.
- Ułatwienie szybkiego przesiewu związków, które mogą zwiększać socjalizację.
- Poprawa dokładności i niezawodności ocen socjalizacji.
Zastosowane metody
- Nagrywanie myszy w specjalnie zaprojektowanej klatce trójdzielnej.
- Zautomatyzowane przetwarzanie danych wideo w celu ilościowej oceny socjalizacji.
- Porównanie wyników z tradycyjnymi metodami przesiewu wizualnego.
- Demonstracja procesu zautomatyzowanej analizy.
Główne wyniki
- Zautomatyzowana metoda zapewnia dokładne i wiarygodne pomiary socjalizacji.
- Znacząco skraca czas potrzebny na ocenę socjalizacji.
- Umożliwia efektywny screening leków w modelach mysich.
- Wykazana skuteczność w rzeczywistym układzie eksperymentalnym.
Wnioski
- Zautomatyzowana analiza stanowi cenne narzędzie do oceny socjalizacji myszy.
- Metoda ta może przyspieszyć badania nad zaburzeniami ze spektrum autyzmu.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym podejściu w celu dalszych analiz behawioralnych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Zautomatyzowana kwantyfikacja socjalizacji myszy umożliwia szybkie przesiewowe badanie związków celujących w deficyty zachowań społecznych w zwalidowanych modelach zaburzeń spektrum autyzmu. Dzięki skróceniu czasu oceny z ponad 50 godzin na dawkę do wydajnego przetwarzania partiami, metoda ta wspiera wysokoprzepustową walidację celów i identyfikację wiodących kandydatów. Zapewnia ona ilościowe i powtarzalne odczyty behawioralne, które zwiększają wiarygodność prognostyczną w decyzjach na wczesnym etapie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na ilościowe określenie socjalizacji poprzez pomiar czasu spędzonego w pobliżu bodźców społecznych w porównaniu z niespołecznymi oraz liczbę podejść społecznych, co umożliwia mechaniczną weryfikację hipotez terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zautomatyzowane śledzenie nosa i analiza ruchu eliminują ręczne punktowanie, co zwiększa przepustowość i zmniejsza zmienność międzyobserwacyjną.
- Wartość prognostyczna: Generuje zależne od dawki wskaźniki socjalizacji, które wspierają ograniczanie ryzyka związanego z celem molekularnym oraz selekcję projektów w badaniach nad lekami na OUN.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Znormalizowany aparat trójkomorowy z zautomatyzowaną analizą wideo tworzy powtarzalną platformę do oceny socjalizacji.
- Dane ilościowe: Pomiar przejść między komorami, czasu spędzonego w strefie społecznej oraz zdarzeń podejścia/unikania kontaktu społecznego jako zmiennych ciągłych do przesiewania związków.
- Skalowalność: Możliwość przetwarzania wsadowego pozwala na równoległą ocenę wielu związków, co wspiera proces optymalizacji trafień do związków wiodących (hit-to-lead).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Bezpośrednio modeluje upośledzenie socjalizacji, będące głównym obszarem objawowym w zaburzeniach widma autyzmu, co umożliwia dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwia podłużną ocenę zmian w socjalizacji w zależności od schematów leczenia w zwalidowanych modelach mysich.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Obiektywne dane dotyczące socjalizacji wspierają decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), ograniczając niejednoznaczność mechanistyczną fenotypów behawioralnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu terapeutycznego, przez identyfikację wiodących związków, aż po przedkliniczną ocenę skuteczności, oferując socjalność jako mierzalny punkt końcowy dla związków modulujących zachowania społeczne.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów socjalizacji poprzez ilościowe określenie preferencji interakcji społecznych oraz zachowań zbliżeniowych.
- Przesiew): Dostarcza ustandaryzowane, zautomatyzowane wyniki socjalizacji, które wspierają powtarzalność testu oraz porównywanie związków między różnymi płytkami i dniami.
- Analityka: Generuje numeryczne wskaźniki socjalizacji (czas, przejścia, liczba podejść), co ułatwia analizę statystyczną i modelowanie zależności struktura-aktywność.
- Badania translacyjne: Odnosi się do istotności klinicznej poprzez modelowanie kluczowej domeny diagnostycznej autyzmu, wspierając przedkliniczną walidację zgodną z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zautomatyzowany proces dostosowuje się do różnych konstrukcji klatek i gatunków, umożliwiając zastosowanie w różnych programach badawczych w ramach farmakologii behawioralnej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Dostarcza obiektywnych, ilościowych miar socjalizacji, co ogranicza subiektywizm i zwiększa pewność co do zaangażowania celu.
- Wartość operacyjna: Automatyzacja skraca czas pracy manualnej przy jednym teście z godzin do minut, co umożliwia prowadzenie kampanii przesiewowych o wysokiej przepustowości.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza optymalizację związków wiodących poprzez dostarczanie szybkich informacji zwrotnych o socjalizacji, co poprawia efektywność kapitałową w programach CNS.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie solidnych profili socjalizacji w modelach istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu neuronauki behawioralnej oraz algorytmów śledzenia wideo w celu konfiguracji i walidacji.
- Wymaga ustandaryzowanego oświetlenia, możliwości podczerwieni oraz kamery o rozdzielczości minimum 720x480 dla niezawodnej detekcji nosa.
- Wymaga spójnego czasu trwania sesji i zrównoważonego rozmieszczenia bodźców, aby uniknąć błędu pozycyjnego.
- Wiąże się z ręczną weryfikacją orientacji głowa-ogon w około 20% filmów w celu korekty błędów automatycznego śledzenia.
- Zależy od dostrojenia progu binaryzacji w celu utrzymania dokładności śledzenia przy różnym oświetleniu i różnych szczepach myszy.
