Name: Technika przeszczepu nerki u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Naucz się zmodyfikowanej techniki anastomozy tętniczej do przeszczepów nerki u myszy, wykorzystującej mankiet piętowo-palcowy. Ta metoda zmniejsza ryzyko zakrzepicy i poprawia wyniki transplantacji w badaniach nad mikrochirurgią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez 1R03DK096151. Dziękujemy UAB-UCSD O'Brien Center (NIH P30 DK079337) za udzielenie wstępnej pomocy technicznej przy konfiguracji tego modelu.

Wszystkie myszy zostały zakupione w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) i trzymane w warunkach wolnych od patogenów na University of Colorado Denver, Barbara Davis Center Animal Facility zgodnie z wytycznymi NIH i za zgodą University of Colorado Denver IACUC.
1. Pobranie nerki od dawcy
<ol>
	<li>Sterylizuj wszystkie narzędzia, noś sterylne rękawiczki przez cały czas trwania zabiegu i utrzymuj sterylne pole. Wszystkie operacje należy wykonywać przy użyciu mikroskopu operacyjnego.</li>
	<li>Chirurgicznie usunąć nerki dawcy myszy od dawców znieczulonych pentobarbitalem (60 mg / kg IP). Ustal głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i obserwuj częstość oddechów.</li>
	<li>Przypnij futro, a następnie unieruchamij mysz za pomocą 4-kierunkowych pasów. Przygotuj skórę z jodonem powidonu i ułóż mysz w sterylny sposób.</li>
	<li>Wykonaj pionowe nacięcie brzucha o długości 2 cm w linii środkowej i wejdź do jamy brzusznej. Cofnij jelito w górę i uzewnętrznij je na klatkę piersiową. Utrzymuj jelito owinięte sterylną, wilgotną gazą przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Zidentyfikuj wielkie naczynia brzuszne i zmobilizuj je, zidentyfikuj wszelkie gałęzie lędźwiowe i kauteryzuj je lub podwiązaj za pomocą nylonowego szwu 10/0.</li>
	<li>Bezpośrednio dystalnie do lewej nerki naczynia nerkowe rozdzielić żyłę główną dolną (IVC) i aortę brzuszną (AA) przez rozwarstwienie na około 2 mm. Podwiązać nylonem 10/0 i oddzielić małe gałęzie tętnicze i żylne od naczyń nerkowych.</li>
	<li>Teraz ostrożnie oddziel żyłę nerkową od tętnicy nerkowej poprzez rozwarstwienie tych struktur. Pozwala to na dokładne stworzenie łaty Carrela na bliższym końcu żyły nerkowej, która posłuży do utworzenia zespolenia koniec do boku do biorcy IVC.</li>
	<li>Zidentyfikuj, podwiąż i podziel lewe naczynia nadnerczy. Umożliwia to dostęp do aorty nadnerczowej, a jedwabny szew 6-0 jest umieszczany wokół aorty w ramach przygotowań do podwiązania, ale nie jest w tym czasie wiązany.</li>
	<li>Zmobilizuj nerkę, naczynia i moczowód z otaczającej powięzi. Obróć nerkę w prawo i podwiązaj/podziel wszelkie tylne gałęzie. Następnie przywróć nerkę w lewo.</li>
	<li>Teraz skieruj uwagę na moczowód. Nie naruszając wnęki nerkowej, uwolnij moczowód z otaczającej go powięzi, dbając o zachowanie naczyń moczowodowych. Podziel moczowód na poziomie przewodu nasieniowodowego. Nerka jest teraz gotowa do regeneracji.</li>
	<li>Powoli wstrzyknąć 300 jednostek heparyny do dystalnego IVC, powodując w ten sposób heparynizację dawcy. Zawiązać jedwabny szew 6-0 umieszczony wokół nadnerczowego AA i wykonać perfuzję lewej nerki przez dystalną aortę brzuszną za pomocą 0,8 ml roztworu soli fizjologicznej heparyny (100 U/ml).</li>
	<li>Po ustaniu perfuzji natychmiast utwórz żylny plaster Carrela, aby wyeliminować przepływ wsteczny do nerki. Cofnij żyłę nerkową w kierunku nerki, odsłaniając AA i tętnicę nerkową pod spodem.</li>
	<li>Podziel aortę przylegającą do tętnicy nerkowej, tworząc mankiet pięty i palców, jak pokazano na rysunku 1. Usunąć nerkę, naczynia i moczowód od dawcy.</li>
	<li>Nerkę należy pobrać bezpośrednio do wcześniej przygotowanego biorcy (0 min czas niedokrwienia zimna) lub przechowywać w temperaturze 4 oC w wybranym roztworze przez wcześniej określony czas do czasu implantacji. Poddano dawcom eutanazję przez wykrwawienie i zwichnięcie szyjki macicy. Całkowity czas rekonwalescencji nerki dawcy wynosi ok. 15-20 min.</li>
</ol>
2. Technika implantu nerkowego
<ol>
	<li>Znieczulić mysz biorcę pentobarbitalem (dawka początkowa 60 mg/kg IP, w razie potrzeby dawka uzupełniająca 25 mg/kg IP). Ustal głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i obserwuj częstość oddechów. Obetnij futro, a następnie unieruchamij mysz za pomocą 4-kierunkowych ograniczeń i nałóż maść okulistyczną na oczy. Przygotuj skórę z jodonem powidonu i ułóż mysz w sterylny sposób.</li>
	<li>Wykonaj pionowe nacięcie brzucha o długości 2 cm w linii środkowej i wejdź do jamy brzusznej. Cofnij jelito wyżej i uzewnętrznij na klatkę piersiową. Utrzymuj jelito owinięte sterylną, wilgotną gazą przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>W tym czasie wykonaj prawostronną nefrektomię. Podwiązać tętnicę nerkową i żyłę za pomocą szwów jedwabnych 6-0. Wyciąć nerkę dystalnie do szwów. Podwiązać moczowód jedwabiem 6-0, a następnie podzielić proksymalnie do nerki.</li>
	<li>Odizoluj aortę brzuszną i żyłę główną dolną (IVC) poniżej naczyń nerkowych. Umieść bawełniane opaski 4-0 wokół aorty i IVC górne, a następnie poniżej miejsca zespolenia. Zidentyfikuj i podwiąż wszelkie naczynia lędźwiowe w terenie za pomocą nylonowego szwu 10-0.</li>
	<li>Zawiąż bawełniane krawaty, najpierw niższe, a następnie lepsze. W ten sposób część krwi zostaje zatrzymana w aorcie, co ułatwia aortomię.</li>
	<li>Uformuj aortomię za pomocą igły 30G, aby wprowadzić się do światła aorty. Przedłuż nacięcie cienkimi mikronożyczkami na długość około 2 mm.</li>
	<li>Wykonaj zespolenie końcowo-boczne mankietu piętowo-palcowego aorty dawcy z aortą biorcy w następujący sposób. Umieść nylonowy szew podtrzymujący 10-0 w aorcie dawczej i do dolnego kąta nacięcia w aorcie biorcy i zawiąż.</li>
	<li>Umieść drugi nylon 10-0 naprzeciwko pierwszego w aorcie dawczej i górnym rogu nacięcia w aorcie brzusznej i zawiąż. Wykonaj biegnącą linię szwu od górnej do dolnej w bocznej ścianie aorty i przywiąż do wcześniej umieszczonego ściegu podporowego. Następnie zszyj ścianę przyśrodkową w sposób biegowy i zawiąż.</li>
	<li>Wykonać zespolenie końca z boku żyły nerkowej dawcy do IVC biorcy w następujący sposób. Nakłuć IVC igłą 30G i przedłużyć nacięcie cienkimi mikronożyczkami. Przywiąż żyłę nerkową dawcy do dolnego rogu nacięcia w IVC nylonem 10-0. Wykonaj linię szwów biegnących między żyłą nerkową a IVC i zawiąż. 
	UWAGA: Niezwykle ważne jest również, aby uzyskać pełną grubość przejść igły do szwu, w tym przydankę naczyniową i błonę wewnętrzną. Odwrócenie krawędzi zapewnia również kontakt między błonami wewnętrznymi, co pomaga w uszczelnianiu i gojeniu zespoleń. Chociaż hemostatyczny środek krzepnięcia może być przydatny do zmniejszenia przecieków, zalecamy, aby chirurg zamiast tego polegał na dobrej technice.</li>
	<li>Upewnij się, że zespolenia są "czyste". Oznacza to, że przeciwległe ściany nie są zaczepiane podczas umieszczania szwów. Spowoduje to znaczne zwężenie przepływu, co spowoduje nieudany przeszczep, a w skrajnych przypadkach paraliż kończyn tylnych. 
	UWAGA: Kolejnym niezwykle ważnym czynnikiem jest zapewnienie, że napięcie linii szwów zespolenia jest również optymalne. Zbyt luźny i dojdzie do nieodwracalnego wycieku, spowoduje to zbyt ciasne i zwężenie przepływu. Jeśli po stronie tętniczej spowoduje to słabą perfuzję przeszczepu, jeśli po stronie żylnej dojdzie do przekrwienia nerki.</li>
	<li>Zwolnij dystalną bawełnianą opaskę 4-0, przywracając przepływ żylny. Po zaobserwowaniu hemostazy zespolenia żylnego stopniowo poluzuj proksymalną bawełnianą krawat 4-0 i obserwuj zespolenie tętnicze pod kątem hemostazy.</li>
	<li>Zdejmij bawełniane opaski z myszy, gdy oba zespolenia zostaną uznane za bezpieczne. Przekłuć pęcherz igłą o sile 20 G, tworząc dwa otwory.</li>
	<li>Przełóż końcówki zakrzywionych kleszczy przez otwory i przeciągnij moczowód dawcy przez pęcherz za pomocą kleszczy z bliższym końcem moczowodu zakotwiczonym w ścianie pęcherza moczowego za pomocą dwóch nylonowych szwów 10-0. Przyciąć nadmiar moczowodu wystającego z drugiego otworu, umożliwiając cofnięcie moczowodu w pęcherzu moczowym i zamknąć otwór dwoma nylonowymi szwami 10-0.</li>
	<li>Wróć do jelita brzusznego. Zamknij ścianę brzucha w dwóch warstwach za pomocą szwu 5-0 Silk w sposób biegowy.</li>
	<li>Podać 1,0 ml bolusa sterylnego, ciepłego roztworu soli fizjologicznej do jamy brzusznej w ramach resuscytacji płynowej po zamknięciu, a po operacji wstrzyknąć podskórnie 0,8 ml soli fizjologicznej. Podczas zabiegu nie są wymagane żadne inne środki wspomagające.</li>
	<li>Odzyskaj zwierzę na kocu rozgrzewającym. Całkowity czas implantacji to ok. 35-45 min. Podawać leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina, 0,05 mg/kg, SC, 0,1-0,2 ml na początku zabiegu i co 6-12 godzin przez 72 godziny po operacji.</li>
</ol>
3. Nefrektomia kontrallateralna
<ol>
	<li>W zależności od wymagań protokołu, kilka dni po zabiegu implantacji należy wykonać nefrektomię kontralateralną w znieczuleniu izofluranem (5% wziewnego izofluranu do indukcji, 1,5-2,0% do konserwacji).</li>
	<li>Wejdź do jamy brzusznej i delikatnie cofnij jelito w prawo od zwierzęcia. Odsłoń lewą nerkę i tępo wypreparuj z otaczającej powięzi.</li>
	<li>Podwiązać tętnicę nerkową, żyłę i moczowód za pomocą jedwabnych szwów 6-0, a następnie wyciąć nerkę powyżej szwów i usunąć nerkę. Całkowity czas operacji wynosi ok. 10 min.</li>
</ol>
4. Ocena przeszczepu
<ol>
	<li>Zmierz stężenie kreatyniny w surowicy za pomocą metody alkalicznego pikonianu (reakcja Jaffego).</li>
</ol>

<ol><li>Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+transplants+between+mice+of+graded+immunogenetic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity.</a> Transplant Proc. 5 (1), 721-725 (1973).</li>
<li>Kalina, S. L., Mottram, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microsurgical+technique+for+renal+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Aust+N+Z+J+Surg%22%5BJournal%5D)">A microsurgical technique for renal transplantation in mice.</a> Aust N Z J Surg. 63 (3), 213-216 (1993).</li>
<li>Han, W. R., Murray-Segal, L. J., Mottram, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+technique+for+kidney+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Modified technique for kidney transplantation in mice.</a> Microsurgery. 19 (6), 272-274 (1999).</li>
<li>Ge, F., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+successfully+establishing+a+kidney+transplant+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Strategies for successfully establishing a kidney transplant in a mouse model.</a> Exp Clin Transplant. 9 (5), 287-294 (2011).</li>
<li>Martins, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+curve%2C+surgical+results+and+operative+complications+for+kidney+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice.</a> Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+hearts+in+mice.+The+role+of+H-2D%2C+H-2K%2C+and+non-H-2+antigens+in+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection.</a> Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).</li>
<li>Zhang, Z. Kidney Transplantation in Mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+Z+%22Experimental+Organ+Transplantation%22">Experimental Organ Transplantation</a>. Chen, H., Qian, S. , Nova Science Publishers. 45-64 (2013).</li>
<li>Zhang, L., Moskovitz, M., Piscatelli, S., Longaker, M. T., Siebert, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+study+of+different+angled+end-to-side+anastomoses%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic study of different angled end-to-side anastomoses.</a> Microsurgery. 16 (2), 114-117 (1995).</li>
<li>Liu, Q., Mirc, D., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+mechanisms+of+thrombosis+in+intact+bent+microvessels+of+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanical mechanisms of thrombosis in intact bent microvessels of rat mesentery.</a> J Biomech. 41 (12), 2726-2734 (2008).</li>
<li>Chesnutt, J. K., Han, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tortuosity+triggers+platelet+activation+and+thrombus+formation+in+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Tortuosity triggers platelet activation and thrombus formation in microvessels.</a> J Biomech Eng. 133 (12), 121004(2011).</li>
<li>Han, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessel+buckling+within+soft+surrounding+tissue+generates+tortuosity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Blood vessel buckling within soft surrounding tissue generates tortuosity.</a> J Biomech. 42 (16), 2797-2801 (2009).</li>
<li>Gutierrez-Diaz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+thrombus+and+neointimal+hyperplasia+after+microvascular+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intraluminal thrombus and neointimal hyperplasia after microvascular surgery.</a> Surg Neurol. 24 (2), 153-159 (1985).</li>
<li>Khouri, R. K., Cooley, B. C., Kenna, D. M., Edstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+of+microvascular+anastomoses+in+traumatized+vessels%3A+fibrin+versus+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Thrombosis of microvascular anastomoses in traumatized vessels: fibrin versus platelets.</a> Plast Reconstr Surg. 86 (1), 110-117 (1990).</li>
<li>Johnson, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+platelet+deposition+at+the+human+microvascular+anastomosis%3A+effect+on+downstream+platelet+deposition+to+intact+and+injured+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Initial platelet deposition at the human microvascular anastomosis: effect on downstream platelet deposition to intact and injured vessels.</a> Plast Reconstr Surg. 90 (4), 650-658 (1992).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opanowanie tej techniki przeszczepu jest trudne, ale gdy już się ją osiągnie, jest to bardzo potężne narzędzie badawcze. Pacjent chirurg/badacz zostanie nagrodzony dbałością o szczegóły i spójnością techniki, co jest kluczem do opanowania każdej procedury chirurgicznej, tym bardziej w przypadku małych modeli zwierzęcych. Trudności techniczne związane z opanowaniem przeszczepu nerki u myszy są wielorakie i jest wysoce prawdopodobne, że przed przystąpieniem do tej procedury należy zdobyć doświadczenie w innych modelach prz...

Od 1973 roku model przeszczepu nerki u myszy jest cennym narzędziem badawczym, ale problemy techniczne utrudniają jego powszechne stosowanie. Na przestrzeni lat opublikowano kilka artykułów szczegółowo opisujących ulepszenia/udoskonalenia tej procedury. Jako model głównie unaczynionego przeszczepu narządów litych, procedura ta jest prawdopodobnie druga po heterotopowym modelu przeszczepu serca, który również został opracowany przez laboratorium Russella w 1973 roku. Oba modele nadają się do badań nad allogenicznymi reakcjami odrzucenia, rozwojem opóźnionej funkcji przeszczepu i uszkodzeniem reperfuzyjnym niedokrwiennym.
Jednym z najczęstszych problemów zgłaszanych przy przeszczepie nerki jest stosunkowo wysoka częstość występowania zakrzepicy tętniczej 4,5,7, której również doświadczyliśmy w naszym laboratorium. W związku z tym postanowiliśmy przeprowadzić przegląd literatury na temat powstawania skrzeplin i ewentualnie znaleźć przyczynę tego problemu technicznego, a także opracować możliwe rozwiązanie. Najbardziej prawdopodobną przyczyną zakrzepicy jest nieco kręta droga, jaką krew pokonuje od aorty biorczej do aorty nerkowej dawcy, a następnie dalej do tętnicy nerkowej dawcy. Ta ścieżka powoduje turbulencje w tętnicy nerkowej, które mogą prowadzić do aktywacji płytek krwi i tworzenia się skrzepliny. Na podstawie ostatnich obserwacji i przeszukania odpowiedniej literatury 8-14 opracowaliśmy nową technikę, która zmniejszyła zakrzepicę do 0%.
Opisana tutaj technika różni się od wcześniej opisanych technik tworzenia mankietu tętniczego pięty i palców, co poprawia przepływ krwi i znacznie zmniejsza powstawanie skrzeplin. Mankiet jest tworzony przez podzielenie aorty podnerkowej w poprzek powierzchni ujścia tętnicy nerkowej pod kątem mniejszym niż 45o do osi podłużnej aorty (ryc. 1A i 1B). Daje to mankiet o długości około 2 mm. Żylna łata Carrela powstaje przez przecięcie żyły nerkowej do IVC, zwiększając w ten sposób średnicę mankietu. Mankiet pięty i palców u nogi dawcy aorty brzusznej dawcy jest zespolony z boku do aorty brzusznej biorcy, a plaster żyły nerkowej/IVC dawcy jest zespoleny z boku do żyły głównej dolnej biorcy (IVC). Moczowód jest następnie wprowadzany do pęcherza moczowego i zakotwiczany w nim, jak opisano przez Hana i wsp. 3.
Dla tego badania porównano nieleczone przeszczepy z ciepłym czasem niedokrwienia (tj. bez zimnego niedokrwienia). W tym przypadku ciepłe niedokrwienie odnosi się do czasu od ustania przepływu krwi przez nerkę dawcy (krok 1.11 poniżej) i reperfuzji przeszczepu u biorcy (krok 2.11 poniżej). Zimne niedokrwienie odnosi się do czasu, w którym nerka nie jest perfundowana i jest przechowywana w chłodni do początku zabiegu implantacji.

<table><tbody><tr><td>Instrument</td><td>Roboz #</td><td>Fine Science Tools #</td><td>Arosurgical #</td></tr><tr><td>Prosty kleszcz do mikropreparacji #5</td><td>RS-5015</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiony kleszcz do mikropreparacji #7</td><td>RS-5047</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiony ząbkowany kleszcz</td><td>RS-5137</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji Vannas, krótkie</td><td>RS-5610</td><td></td><td>09.140.08</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji, proste, ostre, długie</td><td></td><td>11.602.11</td><td></td></tr><tr>Uchwyt <td></td><td></td><td>igły z mikrouchwytem sprężynowym</td><td>11.549.15</td></tr><tr>Kleszczyk <td></td><td>do komarów prosty</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji, proste,</td><td>RS-5962</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji, zakrzywione,</td><td>RS-5981</td><td>14079-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikro zwijacz</td><td>RS-6540</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taca na narzędzia, 10" x 6 i frac12; &rdquo; x & frac34; "</td><td>RT-1350S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szew jedwabny, 5/0, szpula 22,5 m</td><td>18020-50</td><td></td>Szew 10/0 nylon T4A10Q07 5/0 jedwab E19A05N Rękawiczki Zasłony Biogel od Medex Supply Precept, #64-9012-9 Strzykawki <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Aplikatory bawełniane</td><td></td></tr><tr><td>B-D 1cc insulina, #329424</td><td></td><td>Fisher-brand, #23-400-100</td><td></td></tr><tr>Waciki <td></td><td></td><td></td><td>powidonowo-jodowe</td></tr><tr><td>PDI, #B40600</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4/0 Krawaty</td><td></td><td></td><td></td>bawełniane</tr><tr><td>Bawełna domowa autoklawizowana z narzędziami</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

technika przeszczepu nerki u myszy

Murine Kidney Transplant Technique

Pierwsza technika przeszczepu nerki na myszach została opublikowana w 1973 roku1 przez laboratorium Russella. Chociaż zajęło kilka lat, aby inne laboratoria stały się biegłe w tej technice i wykorzystywały ją, obecnie jest ona szeroko stosowana przez wiele laboratoriów na całym świecie. Znaczące udoskonalenie oryginalnej techniki wykorzystującej aortę dawczą do tworzenia zespolenia tętniczego zamiast tętnicy nerkowej zostało opracowane i zgłoszone w 1993 r. przez Kalinę i Mottram 2, a dalszy postęp pochodził z tego samego laboratorium w 1999 r. 3. Chociaż można stać się biegłym w tym modelu, przeszukanie literatury pokazuje, że wiele laboratoriów nadal doświadcza wysokiego odsetka utraty przeszczepu z powodu zakrzepicy tętniczej. Opisujemy tutaj technikę, która została opracowana w naszym laboratorium, a która znacznie zmniejsza skrzeplinę tętniczą zgłaszaną przez innych 4,5. Osiąga się to poprzez utworzenie mankietu piętowo-palcowego aorty podnerkowej dawcy, który ułatwia większe zespolenie i prostszy przepływ krwi do nerki.

Ta technika chirurgiczna umożliwia przeprowadzanie zarówno prostych badań przeżycia/odrzucenia przeszczepu, jak i dość złożonych protokołów eksperymentalnych. Na poniższych rysunkach demonstrujemy zalety zastosowania tej udoskonalonej techniki anastomozy tętniczej. Dzięki zastosowaniu tej metody znacznie zredukowaliśmy częstość występowania zakrzepicy tętniczej z 35% do 0%, co zwiększyło wydajność badań. Stosujemy tę technikę od ponad roku, utrzymując ten sam wynik 0% zakrzepicy. Rysunek 1 opisuje metodę...

Celem tego manuskryptu jest opisanie kroków wymaganych do przeprowadzenia przeszczepu nerki u myszy, zwracając szczególną uwagę na szczegóły zespolenia tętniczego.

Technika przeszczepu nerki u myszy

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie zmodyfikowanej techniki anastomozy tętniczej w transplantacji nerek u myszy. Cel ten osiąga się poprzez dokładną dyssekcję odpowiednich naczyń u dawcy, a następnie stworzenie mankietu typu „heel and toe” z aorty brzusznej dawcy w sąsiedztwie tętnicy nerkowej.Następnie ten mankiet typu „pięta i palec” (heel and toe cuff) jest wykorzystywany do stworzenia anastomozy tętniczej u biorcy. Ostatecznie technika ta powinna skutkować bardzo niską częstotliwością występowania zakrzepicy tętniczej. Ten film przedstawi sposób wykonania tętniczego mankietu typu „pięta i palec”, aby ułatwić przeszczepy nerek w jamie ustnej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami oporowymi jest wyprostowanie drogi przepływu krwi z aorty biorcy do tętnicy nerkowej dawcy, co prowadzi do zmniejszenia aktywacji płytek krwi i powstawania zakrzepów. Wykorzystując technikę sterylną pod mikroskopem operacyjnym, przeprowadź prawidłowo pobranie nerki dawcy. Czas pobrania wyniesie od 15 do 20 minut. Usuń sierść, a następnie unieruchom zwierzę.Przygotuj miejsce operacyjne, myjąc skórę jodkiem powidonowym, załóż sterylne pole operatoracyjne i rozpocznij operację od dwucentymetrowego cięcia w linii środkowej brzucha. Odsuń jelita w stronę klatki piersiowej i owiń je wilgotną gazą. Przez cały czas trwania procedury dbaj o to, aby gaza pozostała wilgotna.Następnie zlokalizuj główne naczynia jamy brzusznej i zmobilizuj je. Wszelkie gałęzie lędźwiowe należy przypalić lub podwiązać szwem nylonowym 10-0. Następnie, metodą rozwarstwiającą, wypreparuj dwumilimetrowy odcinek żyły głównej dolnej oraz aorty dystalnie względem lewych naczyń nerkowych.Następnie podwiązujemy i przecinamy wszelkie małe odgałęzienia tętnicze i żylne przyczepione do naczyń nerkowych. Kontynuujemy tępe rozczłonkowanie, aby oddzielić żyłę nerkową od tętnicy nerkowej, co umożliwi późniejsze wykonanie łaty Carrolla w proksymalnym odcinku żyły nerkowej; łata ta zostanie wykorzystana do utworzenia zespolenia żylnego. Następnie podwiązujemy i przecinamy naczynia nadnercza lewego, aby uzyskać dostęp do aorty nadnerkowej.Po uzyskaniu dostępu, użyj nici jedwabnej 6-0. Nałóż szew wokół aorty nadnerkowej do późniejszego wykorzystania. Następnie uwolnij naczynia nerkowe i moczowód z otaczającej powięzi.Obróć nerkę w prawo po stronie tylnej, podwiąż i przetnij wszelkie odgałęzienia naczyniowe, koncentrując się na moczowodzie. Ostrożnie uwolnij moczowód z otaczającej go powięzi. Nie naruszaj wnęki nerkowej i zachowaj naczynia moczowodowe.Następnie należy przeciąć moczowód na wysokości ductus deferens. Teraz można wypreparować nerkę. Najpierw powoli wstrzyknij 300 jednostek heparyny do dystalnej części żyły głównej dolnej (IVC), aby przeprowadzić heparynizację dawcy.Po drugie, zawiąż szóstkę nici 0 wokół tętnic nadnerczowych. Następnie przeprowadź perfuzję lewej nerki z aorty brzusznej, wstrzykując 0,8 ml roztworu soli fizjologicznej z heparyną w stężeniu 100 jednostek na ml. Po perfuzji natychmiast wykonaj łatę naczyniową w obrębie żyły, aby zapobiec cofaniu się krwi do nerki.Odsuń żyłę nerkową w stronę nerki, aby odsłonić AA i tętnicę nerkową. Następnie przetnij aortę w sąsiedztwie tętnicy nerkowej. Wykonaj tzw. heel i cuff.Następnie, jeśli wymagany jest czas zimnej niedokrwienia równy zero minut, przenieść odzyskaną nerkę do przygotowanego biorcy. Alternatywnie, przenieść organy do komory przechowywczej o temperaturze 4°C, a następnie poddać dawców eutanazji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Procedura ta zajmuje od 35 do 45 minut, podobnie jak w przypadku znieczulenia dawcy.Odbiorcę należy również uzupełnić początkową dawką bolusa w razie potrzeby. Nałożyć odbiorcy krem okulistyczny. Następnie podać zwierzęciu iniekcję buprenorfiny i kontynuować jego podawanie po zabiegu; po wykonaniu początkowego nacięcia i odsunięciu jelit, analogicznie jak u dawcy, przeprowadzić prawostronną nefrektomię, podwiązać tętnicę i żyłę nerkową szwem 6-0, a następnie przeciąć moczowód proksymalnie w stosunku do nerki, używając szwu 6-0.Następnie wyciąć nerkę dystalnie względem szwu naczyniowego. Teraz, poniżej naczyń nerkowych, wyizolować AA i IVC, a następnie powyżej miejsca anastomozy. Założyć wiązanie bawełniane 4/0 wokół aorty i IVC, a następnie zrobić to samo poniżej tego miejsca.Wszelkie naczynia lędźwiowe znalezione w tym obszarze należy przypalić lub podwiązać szwem nylonowym 10-0, mocno zawiązując najpierw szew położony niżej, a następnie mocno szew położony powyżej. Pozwoli to zatrzymać część krwi w aorcie, co ułatwi autotomię AOR. Wykonaj autotomię igłą 30G, a następnie przedłuż nacięcie do około dwóch milimetrów, używając precyzyjnych mikronarzędzi tnących.Kolejnym krokiem jest wykonanie anastomozy koniec-koniec między mankietem piętowym i palcowym dawcy a aortą biorcy. Najpierw wykonaj szew stabilizujący w części piętowej aorty dawcy, używając nici 10 zero. Przeciągnij go przez dolny koniec nacięcia w aorcie biorcy i zawiąż.Po drugie, wykonaj szew 10-0 w górnej części nacięcia aorty, kontynuuj go przez palec mankietu dawcy i zawiąż. Po trzecie, zaczynając od górnego końca, wykonaj szew ciągły w bocznej ścianie aorty i zawiąż go przeciwlegle do wcześniej umieszczonego dolnego szwu stabilizującego. Następnie obróć nerkę i kontynuuj szew ciągły wzdłuż ściany przyśrodkowej, wiążąc go przeciwlegle do górnego szwu stabilizującego.Wykonaj zespolenie żylne, nakłuwając IVC igłą, a następnie poszerzając nacięcie za pomocą precyzyjnych mikronozycyc. Używając nici nylonowej 10-0, przywiąż żyłę nerkową dawcy do dolnego narożnika IVC. Umieść kolejny szew 10-0 na górnym końcu IVC i żyły dawcy, a następnie wykonaj szew ciągły wzdłuż obu stron.Podobnie jak w przypadku anastomozy tętniczej, wywinięcie krawędzi tkanek wspomaga uszczelnienie i gojenie. Teraz sprawdź wykonaną pracę. Przeciwległe ścianki nie powinny zostać pochwycone przez szwy, w przeciwnym razie przepływ krwi będzie zbyt ograniczony.Innym niezwykle istotnym czynnikiem jest zapewnienie optymalnego napięcia linii szwu anastomozy; zbyt słaby szew doprowadzi do nieodwracalnego przecieku, natomiast zbyt mocny spowoduje zwężenie światła naczynia. W przypadku strony tętniczej doprowadzi to do słabego ukrwienia przeszczepu, zaś w przypadku strony żylnej nastąpi zastój żylny w nerce.Po zakończeniu anastomoz poluzuj dystalną wiązkę bawełnianą, aby przywrócić przepływ żylny. Następnie stopniowo poluzuj wiązkę proksymalną i przepłucz miejsce anastomozy tętniczej w celu sprawdzenia hemostazy. Po potwierdzeniu szczelności obu anastomoz, w pęcherzu biorcy wykonaj dwie dziurki za pomocą igły 20G, wprowadź przez nie kleszczyki i przeciągnij moczowód dawcy przez pęcherz.Następnie przymocuj proksymalny koniec moczowodu do ściany pęcherza za pomocą dwóch szwów 10 0. Odetnij nadmiar wystającego moczowodu, tak aby cofnął się do wnętrza pęcherza. Następnie zamknij drugi otwór w pęcherzu szwem 10 0.Zakończ zabieg, wprowadzając jelita na miejsce, zamykając jamę brzusną dwuwarstwowo za pomocą ciągłego szwu jedwabnego 5-0 oraz wstrzykując 1 µL soli fizjologicznej do jamy brzusznej przed zamknięciem. Po zamknięciu jamy brzusznej wstrzyknij kolejne 0,8 mL soli fizjologicznej podskórnie i pozostaw zwierzę do rekonwalescencji na ciepłym kocu. W ciągu jednego roku zbierania danych technika ta znacząco zredukowała częstość występowania zakrzepicy tętnic z 35% do 0%, a wskaźnik 0% zakrzepicy utrzymywał się od czasu przeprowadzenia badania immunohistochemicznego na nerkach nietransplantowanych i przeszczepionych. Z zastosowaniem opisanej techniki, barwienie kwasem okresowym wykazało prawidłowy stan komórek cewek bliższych w grupie kontrolnej i u dawcy.Komórki są sześcianowe, z jasną cytoplazmą i okrągłym, jasnym jądrem w centrum komórki w obu przypadkach wskazanych strzałkami. Należy wskazać dowody na łagodne uszkodzenie rąbka szczoteczkowego, jednak większość rąbków szczoteczkowych jest regularna i dobrze zachowana. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić tętnicze zespolenie typu „heel and toe cup”, które zaowocuje zmniejszeniem liczby przypadków zakrzepicy i zwiększeniem sukcesu transplantacji nerek.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przeszczepianie nerek u myszy jest procedurą wymagającą technicznie, która w celu odniesienia sukcesu wymaga starannej opieki i leczenia pooperacyjnego.

Procedura transplantacji nerki u myszy

Kierowana różnicowanie hESC w konkretne komórki wzbudziło duże zainteresowanie w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół służący do określania losów wybranych hESC in vivo, który stanowi cenne narzędzie do charakteryzacji reagentów specyficznych dla tkanek w terapiach komórkowych.

Mapowanie losów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez tworzenie potworniaków

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

W tym filmie opisujemy procedurę pobierania nerki z przestrzeni zaotrzewnowej myszy. Wyekstrahowaną nerkę można następnie poddać mikrosekcji w celu uzyskania nienaruszonej nerki bez torebki nerkowej i otaczającej warstwy tłuszczu.

Ekstrakcja nienaruszonej nerki od myszy: technika uzyskiwania nerki bez torebki nerkowej z modeli mysich

Ten film opisuje ortotopowy autotransplantację nerki w modelu świni. Ten zabieg chirurgiczny polega na przeszczepieniu przeszczepu nerki zwierzęcia w jego pierwotnym anatomicznym położeniu. Model ten jest wykorzystywany do badania nowych metod leczenia schyłkowej fazy choroby nerek u ludzi.

Ortotopowy przeszczep nerki świni: technika przeszczepu nerki w modelu świni

Tutaj prezentujemy protokół do badania immunologii odrzucenia. Przedstawiony model chirurgiczny informuje o krótkim czasie operacji i zwięzłej technice. W zależności od kombinacji szczepu dawca-biorca, w przeszczepionej nerce może rozwinąć się ostre odrzucenie komórkowe lub przewlekłe uszkodzenie przeszczepu allogenicznego, zdefiniowane przez zwłóknienie śródmiąższowe i zanik kanalików słuchowych.

Przeszczep nerki u myszy: modele odrzucenia przeszczepu allogenicznego

Ten raport zawiera szczegółowy opis przeszczepiania mysiej thymi od myszy dawców w różnym wieku pod torebkę nerkową mysich biorców z niedoborem odporności. Celem tego podejścia jest modelowanie rozwoju limfocytów T i zdarzeń selekcji grasicy in vivo.

Izolacja i przeszczep różnych wiekowych mysich przeszczepów grasicy.

Celem tego manuskryptu i protokołu jest szczegółowe wyjaśnienie i demonstracja procedury chirurgicznej ortotopowego przeszczepu nerki u szczurów. Metoda ta jest uproszczona w celu uzyskania prawidłowej perfuzji nerki dawcy i skrócenia czasu reperfuzji poprzez zastosowanie techniki zespolenia mankietu żylnego i moczowodowego.

Ortotopowy przeszczep nerki szczura: nowatorskie i uproszczone podejście chirurgiczne

Oferujemy prostą i skuteczną metodę przeszczepiania grasicy leczonej 2'-deoksyguanozyną E18.5 do torebki nerkowej nagiej myszy. Metoda ta powinna pomóc w badaniu zarówno funkcji komórek nabłonka grasicy, jak i dojrzewania limfocytów T.

Podtorebkowe przeszczepienie nerki mysiej grasicy embrionalnej leczonej 2'-deoksyguanozyną u nagich myszy

Ten protokół przedstawia nową technikę chirurgiczną przeszczepu nerki u myszy, koncentrując się na zmodyfikowanej strategii zespolenia tętniczego. Przedstawiono również technikę zakładania szwów naczyniowych, w tym prostą i bezpieczniejszą metodę zespolenia moczowód-pęcherz moczowy. Modyfikacje te skracają czas operacji i poprawiają wskaźnik powodzenia procedury przeszczepu nerki u myszy.

Zmodyfikowana technika chirurgiczna przeszczepu nerki u myszy

Model ortotopowego przeszczepu nerki u szczurów przyczynia się do zbadania mechanizmu odrzucania alloprzeszczepu nerki. Obecny model zwiększa przeżywalność biorców bez zakłóceń w ukrwieniu i refluksu żylnego dolnej części ciała za pomocą zespolenia end-to-end implantacji nerki oraz metody "tunelowej" zespolenia moczowód-pęcherz moczowy.

Ortotopowy model przeszczepu nerki u szczura do odrzucania alloprzeszczepu nerki

Naucz się zmodyfikowanej techniki anastomozy tętniczej do przeszczepów nerki u myszy, wykorzystującej mankiet piętowo-palcowy. Ta metoda zmniejsza ryzyko zakrzepicy i poprawia wyniki transplantacji w badaniach nad mikrochirurgią.

Technika przeszczepu nerki u myszy

Przeglądaj więcej filmów