Name: Optymalizacja białek syntetycznych: identyfikacja zależności interpozycyjnych wskazujących na strukturalnie i/lub funkcjonalnie powiązane reszty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Odkryj metodę identyfikacji koewoluujących reszt w białkach przy użyciu narzędzia StickWRLD. Poznaj techniki wizualizacji zależności interpozycyjnych IPD w celu optymalizacji projektowania białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

StickWRLD było możliwe częściowo dzięki funduszom dostarczonym dr Rayowi przez Instytut Badawczy w Nationwide Children's Hospital, oraz dzięki grantowi NSF DBI-1262457.

1. Pobieranie i instalacja oprogramowania
<ol>
	<li>Użyj komputera z procesorem Intel i5 lub lepszym z co najmniej 4 GB pamięci RAM i systemem operacyjnym Mac OS X lub GNU/Linux (np. Ubuntu). Ponadto wymagane są biblioteki Pythona 2.7.610 i wxPython 2.811, SciPy12 i PyOpenGL13 Pythona — pobierz i zainstaluj każdą z nich z odpowiednich repozytoriów.</li>
	<li>Pobierz <a href="http://www.stickwrld.org" target="_blank">StickWRLD</a> jako archiwum zip zawierające wszystkie odpowiednie skrypty Pythona. Pobierz skrypt "fasta2stick.sh" do konwersji standardowych dopasowań sekwencji DNA/białka FASTA do formatu StickWRLD.</li>
	<li>Rozpakuj archiwum i umieść wynikowy folder StickWRLD na pulpicie. Umieść również skrypt "fasta2stick.sh" na pulpicie.</li>
</ol>
2. Przygotuj wyrównanie
<ol>
	<li>Utwórz wyrównanie sekwencji białek za pomocą dowolnego standardowego oprogramowania do wyrównywania (np. ClustalX14). Zapisz wyrównanie na pulpicie w formacie FASTA.</li>
	<li>Otwórz aplikację terminala na komputerze Mac lub GNU/Linux i przejdź do pulpitu (lokalizacja skryptu powłoki "fasta2stick.sh"), wpisując cd ~/Desktop i naciskając Return. Wykonaj skrypt "fasta2stick.sh", wpisując ./fasta2stick.sh w terminalu. Jeśli skrypt nie zostanie wykonany, upewnij się, że jest on wykonywalny – w terminalu wpisz chmod +x fasta2stick.sh, aby skrypt był wykonywalny.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie w skrypcie, aby określić nazwę pliku wejściowego (plik utworzony w wersji 1.2 powyżej) i żądaną nazwę wyjściową. Zapisz plik wyjściowy (który jest teraz w formacie odpowiednim dla StickWRLD) na pulpicie.</li>
</ol>
3. Uruchamianie StickWRLD
<ol>
	<li>Przejdź do folderu plików wykonywalnych StickWRLD za pomocą aplikacji terminalowej komputera Mac lub GNU/Linux. Na przykład, jeśli folder StickWRLD znajduje się na pulpicie, wpisz cd ~/Desktop/StickWRLD/exec w terminalu.</li>
	<li>Uruchom StickWRLD, wpisując python-32 stickwrld_demo.py w terminalu.</li>
	<li>Sprawdź, czy panel StickWRLD Data Loader jest widoczny na ekranie (Rysunek 3).</li>
</ol>
4. Wczytywanie danych
<ol>
	<li>Załaduj przekonwertowane wyrównanie sekwencji białka, naciskając przycisk "Załaduj białko...".</li>
	<li>Wybierz plik utworzony w kroku 3 powyżej i naciśnij "Otwórz". StickWRLD otworzy kilka nowych okien, w tym "StickWRLD Control" (Rysunek 4) i "StickWRLD - OpenGL" (Rysunek 5).</li>
	<li>Wybierz okno "StickWRLD – OpenGL". Wybierz "Resetuj widok" z menu "OpenGL", aby wyświetlić domyślną wizualizację StickWRLD w widoku "z góry na dół" przez cylinder reprezentujący dane w oknach OpenGL o zmiennym rozmiarze.</li>
</ol>
5. Opcje widoku
<ol>
	<li>Zaznacz pola "Etykiety kolumn" i "Etykiety kulek" w okienku "Sterowanie StickWRLD" (Rysunek 4), aby wyświetlić wartości kolumn i kulek.</li>
	<li>Usuń zaznaczenie pola "Krawędzie kolumny" w panelu "Sterowanie StickWRLD", aby ukryć linie krawędzi kolumny.</li>
	<li>Ustaw "Grubość kolumny" na 0,1 w panelu "Sterowanie StickWRLD", aby narysować cienką linię przez kolumny, co ułatwi nawigację po widoku 3D. Naciśnij Return, aby zaakceptować zmianę.</li>
	<li>Zresetuj widok w oknie "StickWRLD – OpenGL" jak w kroku 5.3 powyżej, a następnie naciśnij przycisk "pełny ekran", aby zmaksymalizować widok.</li>
</ol>
6. Nawigacja
<ol>
	<li>Obróć wyświetlacz 3D StickWRLD, przytrzymując lewy przycisk myszy podczas przesuwania myszy w dowolnym kierunku.</li>
	<li>Powiększ ekran 3D StickWRLD, przytrzymując prawy przycisk myszy podczas przesuwania myszy w górę lub w dół.</li>
</ol>
7. Znajdowanie zależności interpozycyjnych (IPD)
<ol>
	<li>Przeglądaj widok, przesuwając i powiększając zgodnie z opisem w kroku 6. Współewoluujące pozostałości przekraczające wymagania progowe zarówno p, jak i reszty są połączone liniami krawędziowymi, jak pokazano na rysunku 6. Jeśli jest zbyt wiele lub zbyt mało krawędzi łączących pozostałości, zmień próg resztkowy (w panelu "Kontrola StickWRLD"), aby wyświetlić mniej lub więcej krawędzi.</li>
	<li>Zwiększ próg rezydualny w panelu sterowania StickWRLD, aż nie zostaną wyświetlone żadne linie krawędzi IPD, a następnie powoli zmniejszaj, aż pojawią się relacje. Kontynuuj zwiększanie reszty, aż uzyskasz wystarczającą liczbę relacji do zbadania.</li>
	<li>Zidentyfikuj relacje, które obejmują albo reszty o znanym znaczeniu (np. w motywie lub miejscu wiązania/funkcjonalnego), albo pozostałości, które są dystalne względem siebie w obrębie wyrównania (co sugeruje, że są proksymalne w pofałdowanym białku)</li>
</ol>
8. Wybieranie i zapisywanie wyników
<ol>
	<li>Za pomocą polecenia + kliknij lewym przyciskiem myszy dowolne krawędzie zainteresowania. Panel kontrolny StickWRLD wskaże kolumny i połączy określone pozostałości, np. "(124|G) (136|h)" (Rysunek 7). Linie ciągłe reprezentują pozytywne skojarzenia; Linie przerywane reprezentują negatywne skojarzenia.</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Output Edges" na panelu "StickWRLD Control", aby zapisać plik w formacie zwykłego tekstu (edge_residual.csv) wszystkich widocznych krawędzi, w tym połączonych pozostałości i ich rzeczywistych wartości resztkowych, w katalogu /StickWRLD/exec/.</li>
</ol>

<ol><li>Ray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+the+unmet+need+for+visualizing+conditional+random+fields+in+biological+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC%22%5BJournal%5D)">Addressing the unmet need for visualizing conditional random fields in biological data.</a> BMC. 15, 202(2014).</li>
<li>Sullivan, B. J., Durani, V., Magliery, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triosephosphate+isomerase+by+consensus+design%3A+dramatic+differences+in+physical+properties+and+activity+of+related+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Triosephosphate isomerase by consensus design: dramatic differences in physical properties and activity of related variants.</a> Journal of molecular biology. 413, 195-208 (2011).</li>
<li>Smith, M. A., Bedbrook, C. N., Wu, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocrea+jecorina+cellobiohydrolase+I+stabilizing+mutations+identified+using+noncontiguous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+synthetic+biology%22%5BJournal%5D)">Hypocrea jecorina cellobiohydrolase I stabilizing mutations identified using noncontiguous recombination.</a> ACS synthetic biology. 2, 690-696 (2013).</li>
<li>Ray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+sequence+requirements+of+protein+families%3A+insights+from+the+BioVis+2013+contests%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+proceedings%22%5BJournal%5D)">Understanding the sequence requirements of protein families: insights from the BioVis 2013 contests.</a> BMC proceedings. 8, S1(2014).</li>
<li>Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+hidden+Markov+model%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">What is a hidden Markov model?</a> Nature biotechnology. 22, 1315-1316 (2004).</li>
<li>Ray, W. C., Ozer, H. G., Armbruster, D. W., Daniels, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+identity+-+when+classical+homology+searching+fails%2C+why%2C+and+what+you+can+do+about+it%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+4th+Ohio+Collaborative+Conference+on+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Beyond identity - when classical homology searching fails, why, and what you can do about it.</a> Proceedings of the 4th Ohio Collaborative Conference on Bioinformatics. , IEEE Press. New York, NY. 51-56 (2009).</li>
<li>Ovchinnikov, S., Kamisetty, H., Baker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+and+accurate+prediction+of+residue-residue+interactions+across+protein+interfaces+using+evolutionary+information%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Robust and accurate prediction of residue-residue interactions across protein interfaces using evolutionary information.</a> eLife. 3, e02030(2014).</li>
<li>Trudeau, D. L., Lee, T. M., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+thermostable+fungal+cellulases+exhibit+efficient+synergistic+cellulose+hydrolysis+at+elevated+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Engineered thermostable fungal cellulases exhibit efficient synergistic cellulose hydrolysis at elevated temperatures.</a> Biotechnology and bioengineering. 111, 2390-2397 (2014).</li>
<li>Ray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVL+and+StickWRLD%3A+visually+exploring+relationships+in+nucleic+acid+sequence+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">MAVL and StickWRLD: visually exploring relationships in nucleic acid sequence alignments.</a> Nucleic acids research. 32, W59-W63 (2004).</li>
<li>Python Language Reference v.2.7.6. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.python.org/download/releases/2.7.6/">https://www.python.org/download/releases/2.7.6/</a> (2014).</li>
<li>Talbot, H. wxPython, a GUI Toolkit. Linux Journal. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.linuxjournal.com/article/3776">http://www.linuxjournal.com/article/3776</a> (2000).</li>
<li>Jones, E., Oliphant, T., Peterson, P., et al. SciPy: Open Source Scientific Tools for Python. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.scipy.org/">http://www.scipy.org/</a> (2001).</li>
<li>PyOpenGL The Python OpenGL Binding. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://pyopengl.sourceforge.net/">http://pyopengl.sourceforge.net/</a> (2014).</li>
<li>Larkin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustal+W+and+Clustal+X+version+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Clustal W and Clustal X version 2.0.</a> Bioinformatics. 23, 2947-2948 (2007).</li>
<li>Ozer, H. G., Ray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVL%2FStickWRLD%3A+analyzing+structural+constraints+using+interpositional+dependencies+in+biomolecular+sequence+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">MAVL/StickWRLD: analyzing structural constraints using interpositional dependencies in biomolecular sequence alignments.</a> Nucleic acids research. 34, W133-W136 (2006).</li>
<li>Ray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVL%2FStickWRLD+for+protein%3A+visualizing+protein+sequence+families+to+detect+non-consensus+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">MAVL/StickWRLD for protein: visualizing protein sequence families to detect non-consensus features.</a> Nucleic acids research. 33, W315-W319 (2005).</li>
<li>Ray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Visual+Analytics+approach+to+identifying+protein+structural+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%22%5BJournal%5D)">A Visual Analytics approach to identifying protein structural constraints.</a> IEEE. , Ohio State Univ. Biophys. Program. Columbus, OH. 249-250 (2010).</li>
<li>Wheeler, T. J., Clements, J., Finn, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skylign%3A+a+tool+for+creating+informative%2C+interactive+logos+representing+sequence+alignments+and+profile+hidden+Markov+models%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skylign: a tool for creating informative, interactive logos representing sequence alignments and profile hidden Markov models.</a> BMC bioinformatics. 15, 7(2014).</li>
<li>Perrier, V., Burlacu-Miron, S., Bourgeois, S., Surewicz, W. K., Gilles, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+zinc-chelating+adenylate+kinase+from+Escherichia+coli+with+enhanced+thermal+stability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered zinc-chelating adenylate kinase from Escherichia coli with enhanced thermal stability.</a> The Journal of biological chemistry. 273, 19097-19101 (1998).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

StickWRLD został z powodzeniem wykorzystany do identyfikacji takich IPD w domenie16 kinazy adenylanowej, a także powiązanych zasad DNA w terminatorach zależnych od rho9 oraz nowej specyficzności splicingowej w miejscach docelowych endonukleazy intronowej6 archeonów tRNA. Te IPD nie były wykrywalne poprzez bezpośrednie badanie wyrównania.
StickWRLD wyświetla każdą pozycję wyrównania jako kolumnę 20 "kul", gdzie każda kula reprezentuje jedną z 20 reszt aminokwasowych, a rozmiar kuli wskazuje częstotliwość występowania tej konkretnej reszty w tej kolumnie (rysunek 4). Kolumny są ułożone w walcu, z liniami krawędzi łączącymi pozostałości w różnych kolumnach (wskazującymi na IPD). Te linie graniczne są rysowane tylko wtedy, gdy odpowiadające im reszty współzmieniają się z częstotliwością przekraczającą zarówno wartość p (istotność), jak i resztki (oczekiwane - obserwowane) progi.
Wykrywanie współwystępujących współzależnych reszt lub IPD w dystalnych regionach wyrównania sekwencji DNA lub białka jest trudne przy użyciu standardowych narzędzi do dopasowywania sekwencji6. Podczas gdy takie narzędzia generują konsensus lub sekwencję motywów, konsensus ten jest w wielu przypadkach zwykłym uśrednianiem reguły większości i nie przekazuje relacji współzmienności, które mogą tworzyć jeden lub więcej podmotywów – grup reszt, które mają tendencję do współewolucji. Nawet modele HMM, które są w stanie wykryć sąsiednie zależności, nie są w stanie dokładnie modelować motywów sekwencji za pomocą dystalnych IPD5. Rezultat jest taki, że obliczony konsensus może być w rzeczywistości "syntetyczną" sekwencją, której nie ma w naturze – a zmodyfikowane białka oparte na takim konsensusie obliczeniowym mogą w rzeczywistości nie być optymalne. W rzeczywistości Pfam HMM dla ADK sugerowałby, że chimeryczne białko zawierające połowę motywu tetracysteiny i połowę motywu H,S,D,T, jest funkcjonalnie tak samo akceptowalne, jak każdy faktycznie istniejący ADK. Tak nie jest, ponieważ takie chimery (i wiele innych mieszanek tych motywów) są katalitycznie martwe4,19.
Szukając korelacji, bardzo ważne jest, aby próg resztkowy został dostosowany tak, aby umożliwić wykrycie odpowiednich korelacji poprzez ustawienie progu powyżej poziomu, przy którym widoczne są wszelkie krawędzie, a następnie stopniowe zmniejszanie progu. Gwarantuje to, że początkowo brane są pod uwagę tylko najważniejsze krawędzie.
Alternatywnym podejściem jest rozpoczęcie od bardzo niskiego progu rezydualnego. Powoduje to wyświetlenie wszystkich istotnych krawędzi. Od tego momentu próg resztkowy może być powoli zwiększany, co pozwala na wypadanie krawędzi, aż pojawią się wzory. Chociaż takie podejście jest mniej przydatne, gdy szuka się włączenia określonych węzłów (np. zastosowanie wiedzy o domenie), pozwala na odkrywanie nieoczekiwanych relacji za pomocą StickWRLD jako wizualnego narzędzia analitycznego do odkrywania pojawiających się wzorców w wizualizacji danych.
StickWRLD jest ograniczony przede wszystkim dostępną pamięcią systemu, na którym jest uruchomiony, a także rozdzielczością urządzenia wyświetlającego. Chociaż nie ma teoretycznego limitu liczby punktów danych, które StickWRLD może zbadać, a sekwencje do 20 000 pozycji zostały przetestowane, w praktyce StickWRLD działa najlepiej z sekwencjami do około 1 000 pozycji.
Podstawową zaletą StickWRLD jest jego zdolność do identyfikowania grup pozostałości, które są ze sobą zgodne. Jest to znacząca przewaga nad tradycyjnym podejściem do statystycznej sekwencji konsensusu, która jest prostym uśrednianiem statystycznym i nie uwzględnia koewolucji. Podczas gdy w niektórych przypadkach współzmienne reszty mogą być po prostu artefaktem filogenezy, nawet te reszty przetrwały "test selekcji" i jako takie jest mało prawdopodobne, aby umniejszały funkcjonalność jakiegokolwiek białka zmodyfikowanego tak, aby je zawierało.
Chociaż użycie StickWRLD do identyfikacji IPD w kanonicznym konsensusie/motywie sekwencji DNA lub białka przed inżynierią syntetycznych wariantów zmniejszy ryzyko błędu i wesprze szybką optymalizację funkcji, należy zauważyć, że StickWRLD może być używany jako uogólnione narzędzie do identyfikacji korelacji i nie ogranicza się wyłącznie do danych dotyczących białek. StickWRLD może być używany do wizualnego odkrywania współwystępowania dowolnych zmiennych w dowolnym prawidłowo zakodowanym zestawie danych.

Dopasowania białek od dawna są używane do oceny podobieństwa reszt w rodzinie białek. Często najciekawsze cechy białka (np. katalityczne lub inne miejsca wiązania) są wynikiem fałdowania białek, które stykają się z dystalnymi regionami sekwencji liniowej, w wyniku czego te pozornie niepowiązane regiony w dopasowaniu mają tendencję do ewolucji i zmian w skoordynowany sposób. W innych przypadkach funkcja białka może być zależna od jego sygnatury elektrostatycznej, a mutacje, które wpływają na dipol elektronowy, są kompensowane przez zmiany odległych naładowanych reszt. Efekty allosteryczne mogą również indukować długodystansowe zależności sekwencyjne i przestrzenne między tożsamościami pozostałości. Niezależnie od ich pochodzenia, te funkcjonalnie wymagane współzmienności reszt - zależności międzypozycyjne (IPD) - mogą nie być oczywiste przy wizualnym badaniu wyrównania (Rysunek 1). Identyfikacja IChP - jak również tego, które określone reszty w tych pozycjach mają tendencję do współzmienności jako jednostka - może dostarczyć ważnych wskazówek na temat procesów fałdowania białek i tworzenia miejsc funkcjonalnych. Informacje te można następnie wykorzystać do optymalizacji białek syntetycznych (inżynieryjnych) pod względem termostabilności i aktywności. Od dawna wiadomo, że nie wszystkie mutacje punktowe w kierunku konsensusu zapewniają lepszą stabilność lub aktywność. Ostatnio wykazano, że białka zaprojektowane tak, aby wykorzystywać znane IChP w swojej sekwencji, powodują większą aktywność niż to samo białko zaprojektowane wyłącznie na podstawie konsensusu1,2 (manuskrypt w przygotowaniu), podobnie jak w przypadku idei stabilizacji mutacji punktowych3.
Niestety, tradycyjne modele budowania konsensusu (np. zasada większości) przechwytują IPD tylko przez przypadek. Metody Consensus i Position Specific Scoring Matrix ignorują IPD i tylko "poprawnie" uwzględniają je w modelach, podczas gdy reszty zależne są również najpopularniejszymi pozostałościami dla tych pozycji w rodzinie. Modele łańcucha Markowa mogą przechwytywać IPD, gdy są one sekwencyjnie proksymalne, ale ich typowa implementacja ignoruje wszystko poza bezpośrednimi sekwencyjnymi sąsiadami, a nawet w najlepszym przypadku obliczenia ukrytego modelu Markowa (patrz rysunek 2) stają się nierozwiązywalne, gdy zależności są oddzielone w sekwencji o więcej niż kilkanaście pozycji4. Ponieważ te IPD zasadniczo tworzą "podmotywy", których nie można przewidzieć za pomocą prostej "reguły większości" lub nawet modeli konsensusu opartych naHMM5,6, wynikiem może być biologicznie nieprawidłowy "konsensus", który nie tylko nigdy nie występuje w naturze, ale jest mniej żywotny niż jakiekolwiek istniejące białko. Systemy oparte na polach losowych Markowa, takie jak GREMLIN7, próbują przezwyciężyć te problemy. Ponadto, podczas gdy zaawansowane techniki biologiczne/biochemiczne, takie jak nieciągła rekombinacja3,8, mogą być stosowane do identyfikacji niezbędnych elementów białkowych według regionów, wymagają one znacznego czasu i pracy laboratoryjnej, aby można było osiągnąć precyzję pojedynczej pary zasad.
StickWRLD9 to program oparty na Pythonie, który tworzy interaktywną reprezentację 3D wyrównania białek, dzięki czemu IPD są jasne i łatwe do zrozumienia. Każda pozycja w wyrównaniu jest reprezentowana jako kolumna na wyświetlaczu, gdzie każda kolumna składa się ze stosu kulek, po jednej dla każdego z 20 aminokwasów, które mogą być obecne w tej pozycji w wyrównaniu. Rozmiar kuli zależy od częstotliwości występowania aminokwasu, tak że użytkownik może natychmiast zebrać resztę konsensusu lub względny rozkład aminokwasów w tej pozycji, po prostu patrząc na rozmiar kulek. Kolumny reprezentujące każdą pozycję są zawijane wokół walca. Daje to każdej sferze reprezentującej możliwy aminokwas w każdej pozycji w wyrównaniu, wyraźną "linię wzroku" do każdej innej możliwości aminokwasu w każdej innej pozycji. Przed wizualizacją StickWRLD oblicza siłę korelacji między wszystkimi możliwymi kombinacjami pozostałości w celu identyfikacji IPD9. Aby przedstawić IPD, narysowane są linie między pozostałościami, które współewoluują w wyższym lub niższym tempie, niż można by się spodziewać, gdyby pozostałości obecne w tych pozycjach były niezależne (IPD).
Ta wizualizacja nie tylko pokazuje, które pozycje sekwencji oddziałują na siebie ewolucyjnie, ale ponieważ linie krawędziowe IPD są rysowane między sferami aminokwasów w każdej kolumnie, użytkownik może szybko określić, które konkretne aminokwasy mają tendencję do współewolucji w każdej pozycji. Użytkownik ma możliwość obracania i eksploracji wizualizowanej struktury IPD, a także dynamicznej zmiany progów statystycznych kontrolujących wyświetlanie korelacji, dzięki czemu StickWRLD jest potężnym narzędziem do wykrywania IPD.
Aplikacje takie jak GREMLIN7 podobnie wyświetlają złożone informacje relacyjne między pozostałościami - ale te relacje są obliczane za pomocą bardziej tradycyjnych modeli Markowa, które nie są zaprojektowane do określania jakichkolwiek relacji warunkowych. W związku z tym można je wyświetlać jako projekcje 2D. W przeciwieństwie do tego, StickWRLD może obliczać i wyświetlać wielowęzłowe zależności warunkowe, które mogą być zaciemnione, jeśli są renderowane jako wykres 2D (zjawisko znane jako okluzja krawędziowa).
Widok 3D StickWRLD ma również kilka innych zalet. Umożliwiając użytkownikom manipulowanie obrazem – przesuwanie, obracanie i powiększanie – funkcje, które mogą być zaciemnione lub nieintuicyjne w reprezentacji 2D, można łatwiej dostrzec w cylindrze 3D StickWRLD. StickWRLD jest zasadniczo narzędziem do analizy wizualnej, wykorzystującym moc zdolności ludzkiego mózgu do rozpoznawania wzorców w celu dostrzegania wzorców i trendów, a także zdolność do eksplorowania danych z różnych perspektyw.

<table><tbody><tr><td>Komputer Mac lub Ubuntu OS</td><td>Różne</td><td></td><td>Dowolny komputer Mac lub GNU/Linux (np. Ubuntu) zdolny do uruchamiania Pythona i powiązanych skryptów powłoki</td></tr><tr><td>Język programowania Python</td><td>python.org</td><td></td><td>Python w wersji 2.7.6 lub nowszej Zalecana</td></tr><tr><td>biblioteka wxPython</td><td>wxpython.org</td><td></td><td>Najnowsza wersja zalecana</td></tr><tr><td>biblioteka</td> <td>SciPy</td><td></td> scipy.org <td>Zalecana najnowsza wersja</td></tr><tr><td>Biblioteka PyOpenGL</td><td>pyopengl.sourceforge.net</td><td></td><td>Zalecana najnowsza wersja</td></tr><tr><td>StickWRLD Skrypty Pythona</td><td>NCH BCCM</td><td></td><td>Dostępne pod adresem <a href="http://www.stickwrld.org" target="_blank">http://www.stickwrld.org</a></td></tr><tr><td>fasta2stick.sh konwerter plików</td><td>NCH BCCM</td><td></td><td>Dostępne pod adresem <a href="http://www.stickwrld.org" target="_blank">http://www.stickwrld.org</a></td></tr><tr><td>Dane sekwencji</td><td></td><td></td> białek i/lub DNA <td>Próbki dostępne pod adresem <a href="http://www.stickwrld.org" target="_blank">http://www.stickwrld.org</a></td></tr></tbody></table>

optymalizacja białek syntetycznych: identyfikacja zależności interpozycyjnych wskazujących na strukturalnie i/lub funkcjonalnie powiązane reszty

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Dopasowania białek są powszechnie używane do oceny podobieństwa reszt białkowych, a uzyskana sekwencja konsensusu służy do identyfikacji jednostek funkcjonalnych (np. domen). Tradycyjne modele budowania konsensusu nie uwzględniają zależności interpozycyjnych – funkcjonalnie wymaganej współzmienności reszt, które mają tendencję do pojawiania się jednocześnie w trakcie ewolucji i w całym drzewie filogenetycznym. Zależności te mogą ujawnić ważne wskazówki na temat procesów fałdowania białek, termostabilności i tworzenia funkcjonalnych miejsc, które z kolei mogą być wykorzystane do informowania o inżynierii białek syntetycznych. Niestety, relacje te zasadniczo tworzą podmotywy, których nie można przewidzieć za pomocą prostej "reguły większości" lub nawet modeli konsensusu opartych na HMM, a wynikiem może być biologicznie nieprawidłowy "konsensus", który nie tylko nigdy nie występuje w naturze, ale jest mniej żywotny niż jakiekolwiek istniejące białko. Opracowaliśmy narzędzie do analizy wizualnej, StickWRLD, które tworzy interaktywną reprezentację 3D wyrównania białek i wyraźnie wyświetla współbieżne reszty. Użytkownik ma możliwość przesuwania i powiększania, a także dynamicznej zmiany progu statystycznego leżącego u podstaw identyfikacji kowariantów. StickWRLD był wcześniej z powodzeniem stosowany do identyfikacji funkcjonalnie wymaganych kozmiennych reszt w białkach, takich jak kinaza adenylanowa, oraz w sekwencjach DNA, takich jak miejsca docelowe endonukleazy.

Program StickWRLD był wcześniej wykorzystywany do wykrywania zależności międzypozycyjnych (IPDs) między resztami w dopasowaniach zarówno DNA3, jak i białek15-17. Te współewoluujące reszty, choć często oddalone od siebie w dopasowaniu sekwencji, są zazwyczaj blisko siebie w sfałdowanym białku. StickWRLD umożliwia szybkie odkrywanie specyficznego dla reszt współwystępowania w takich miejscach, np., alanina w pozycji „x” jest silnie skorelowana z treoniną w pozycji „y”. Takie korelacje mogą wskazywać na możliwe do udowodnienia zależności strukturalne i zazwyczaj dotyczą miejsc, które z konieczności współewoluują. StickWRLD jest w stanie wykryć te zależności nawet wtedy, gdy bardziej „tradycyjne” podejścia wykorzystujące HMM do opisu motywów zawodzą. Na przykład analiza dopasowania PFAM domeny pokrywy ADK za pomocą StickWRLD ujawnia silną dodatnią korelację między cysteinami (C) w pozycjach 4 i 8 a skoordynowaną parą C w pozycjach 35 i 38. Jednocześnie StickWRLD wykazał podobną silną dodatnią zależność między histydyną (H) a seryną (S) w pozycjach 4 i 8, silną ujemną zależność między nimi a kwartetem C w pozycjach 4, 8, 35 i 38, oraz silną dodatnią zależność z kwasem asparaginowym (D) i treoniną (T) odpowiednio w pozycjach 35 i 38. Dodatkowe IPDs występują między motywem H,S,D,T a T i G w pozycjach **** 10 i 29 u b subtilis ****, co podkreśla warunkowy charakter tych IPDs – motyw tetracysteiny nie „zależy” od tożsamości reszt w tych dwóch pozycjach, podczas gdy hydrofilowa triada H,S,D,T wymaga w tych pozycjach konkretnych reszt niemal absolutnie. Te dwa całkowicie różne, zależne od pozycji motywy reszt mogą pełnić tę samą rolę w pokrywie ADK. Jak widać na Rysunku 6, na pierwszym planie widoczny jest duży klaster IPDs, w tym powiązanie 3 węzłów między G (glicyną) w pozycji 132, Y (tyrozyną) w pozycji 135 a P (proliną) w pozycji 141 (Rysunek 6A). Na Rysunku 6B widok został przesunięty tak, aby użytkownik znajdował się nieco powyżej cylindra, co ujawniło IPD między H (histydyną) w pozycji 136 a M (metioniną) w pozycji 29, oddalonymi o 107 reszt. Tymczasem motyw domeny pochodzący z PFAM HMM (Rysunek 2) nie tylko nie wykrywa ich jako specyficznie współwystępujących wariantów motywu, ale również definiuje ogólne grupowania według schematu niepopartego biologicznie16.
<img alt="Schemat procesu fałdowania białka z sekwencją aminokwasową i oddziaływaniami strukturalnymi." src="/files/ftp_upload/52878/52878fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentacja typu „mapa metra” struktury domeny Lid kinazy adenozyny (ADK) z B. subtilis. Strzałki wskazują IPD zidentyfikowane przez StickWRLD w dopasowaniu PFAM domeny Lid ADK. StickWRLD jest w stanie prawidłowo zidentyfikować IPD w obrębie klastra reszt, które znajdują się w bliskim sąsiedztwie w sfałdowanym białku. Szczególne zainteresowanie budzi para T i G w pozycjach 9 i 29, która tworzy IPD tylko wtedy, gdy tetrada reszt w pozycjach 4, 7, 24 i 27 nie jest C,C,C,C). Wyświetlone numery reszt reprezentują pozycje w B. subtilis, a nie pozycje w dopasowaniu PFAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Logo sekwencji aminokwasowej przedstawiające rozkład częstotliwości; wizualizacja danych bioinformatycznych." src="/files/ftp_upload/52878/52878fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Logo sekwencji ukrytego modelu Markowa (HMM) Skylign18 dla domeny pokrywy ADK. Chociaż modele HMM są potężnymi narzędziami do wyznaczania prawdopodobieństw w każdej pozycji, a także wkładu każdego miejsca w ogólny model, niezależność pozycyjna HMM sprawia, że nie nadają się one do wykrywania IPD. Model ten nie wskazuje żadnej z zależności zaobserwowanych w reprezentacjach StickWRLD (Rysunek 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Interfejs GUI przetwarzania danych; opcje menu do ładowania zbiorów danych genetycznych i analitycznych, oprogramowanie naukowe." src="/files/ftp_upload/52878/52878fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Ładowarka danych StickWRLD. Użytkownicy mogą wybrać istniejące dane demonstracyjne lub wczytać własne dane w formie dopasowań sekwencji DNA lub białek.
<img alt="Interfejs panelu sterowania StickWRLD, wyświetlający ustawienia wykresu 2D dla obliczeń krawędzi i opcje wyświetlania." src="/files/ftp_upload/52878/52878fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Okno sterowania StickWRLD. Panel sterowania umożliwia użytkownikowi zmianę różnych właściwości widoku, a także regulację progów kontrolujących wyświetlanie linii krawędzi wskazujących relacje między resztami (IPDs). Czerwonym kółkiem zaznaczono wartości domyślne, które zazwyczaj wymagają dostosowania dla najlepszego podglądu dowolnego zestawu danych. Wartość Residual ustawia próg (obserwowane-oczekiwane), dla którego rysowane są linie łączące/asocjacyjne. Sterowniki etykiet Column i Ball kontrolują, czy wyświetlana jest pozycja kolumny oraz wartości reszt (np. „A” dla argininy). Sterownik Column Edge Line włącza i wyłącza wyświetlanie linii krawędzi łączących kolumny – w przypadku gęstych zestawów danych lepiej jest go wyłączyć. Column Thickness kontroluje, czy sama kolumna jest wyświetlana – ustawienie tej wartości na bardzo małą (np. 0.1) narysuje linię przechodzącą przez sfery w kolumnie, co ułatwia odróżnienie kolumn od siebie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat dynamicznej symulacji OpenGL; wizualizacja połączonych węzłów sieci, geometria obliczeniowa." src="/files/ftp_upload/52878/52878fig5highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Widok początkowy okna StickWRLD OpenGL z załadowanym zestawem danych białka domeny pokrywy kinazy adenylanowej. Początkowa perspektywa ukazuje widok „z góry” przez cylinder składający się z pozycji dopasowania sekwencji. Użytkownik może obracać cylinder, przeciągając lewym przyciskiem myszy, oraz przybliżać i oddalać widok, przeciągając prawym przyciskiem myszy. Widok początkowy jest dość gęsty, ponieważ domyślne ustawienie wyświetla nawet niewielkie wskaźniki koewolucji. Dla wielu białek przy tych ustawieniach można wykryć wyraźne moduły, jednak nawet w białkach o gęstej koewolucji widok można szybko i interaktywnie uprościć za pomocą interfejsu StickWRLD, aby zidentyfikować najważniejsze IPD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig5highres.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Trójwymiarowa struktura białka, chromatogram, wizualizacja danych widmowych, oddziaływanie molekularne, schemat analizy." src="/files/ftp_upload/52878/52878fig6highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Powiększony widok wizualizacji StickWRLD białka domeny pokrywy kinazy adenylanowej. Tutaj zmieniono domyślną wartość Residual na 0,2. Zwiększa to próg wyświetlania krawędzi międzyresztkowych, co skutkuje pokazaniem mniejszej liczby krawędzi. Pozostałe krawędzie wskazują silnie powiązane IPD. Dodatkowo widok został obrócony i przybliżony, aby ułatwić obserwację krawędzi. (A) Na pierwszym planie widoczny jest duży klaster IPD, obejmujący powiązanie trzech węzłów między G (glicyną) w pozycji 132, Y (tyrozyną) w pozycji 135 i P (proliną) w pozycji 141. (B) Perspektywę przesunięto tak, aby użytkownik znajdował się nieco powyżej cylindra, co ujawnia IPD między H (histydyną) w pozycji 136 a M (metioniną) w pozycji 29, oddalonymi od siebie o 107 reszt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Graficzny interfejs użytkownika przedstawiający ustawienia filtrów; wybór operatora obiektu." src="/files/ftp_upload/52878/52878fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Widok informacji w prawym dolnym rogu okna sterowania StickWRLD. Kliknięcie lewym przyciskiem myszy z wciśniętym klawiszem CTRL na obiekcie (np. sferze lub krawędzi) w oknie OpenGL wyświetla informacje o tym obiekcie w prawym dolnym rogu okna sterowania StickWLRD. Tutaj widoczne są informacje dla krawędzi IPD pomiędzy metioniną w pozycji 29 a histydyną w pozycji 136.

Syntetyczne sekwencje białek oparte na motywach konsensusu zazwyczaj ignorują współewoluujące resztki, które implikują zależności interpozycyjne (IPD). IPD mogą być niezbędne do działania, a projekty, które je ignorują, mogą skutkować nieoptymalnymi wynikami. Protokół ten wykorzystuje StickWRLD do identyfikacji IPD i pomaga w racjonalnym projektowaniu białek, co skutkuje bardziej wydajnymi wynikami.

Optymalizacja białek syntetycznych: identyfikacja zależności interpozycyjnych wskazujących na strukturalnie i/lub funkcjonalnie powiązane reszty

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja współewoluujących reszt w wyrównaniach białek, które wskazują na zależności międzypozycyjne (ang. interpositional dependencies, IPDs). Jest to realizowane poprzez załadowanie wyrównania do programu stick world, który jest narzędziem analityki wizualnej tworzącym interaktywną reprezentację 3D wyrównania białek i przejrzyście wyświetlającym współzmienne reszty. Każda pozycja w wyrównaniu jest reprezentowana jako kolumna składająca się ze stosu sfer – po jednej sferze dla każdego z 20 możliwych aminokwasów w danej pozycji wyrównania, których rozmiar zależy od częstotliwości występowania; kolumny reprezentujące każdą pozycję są owinięte wokół cylindra w celu przedstawienia IPDs.Linie są rysowane pomiędzy resztami, które koewoluują w stopniu wyższym lub niższym, niż oczekiwano by w przypadku, gdyby reszty znajdujące się na tych pozycjach były zależne w ramach programu. Wartość rezydualna jest dostrajana aż do uzyskania zarządzalnej liczby krawędzi, a następnie identyfikowane są krawędzie budzące zainteresowanie. Ostatecznie program stick world służy do identyfikacji reszt, które koewoluują ze sobą.Takie funkcjonalnie wymagane reszty tworzące pętlę osłonową (coving residues) zidentyfikowano w kinazie wentylacyjnej. Jednym z powodów, dla których badacze mają trudności z tym procesem, jest jego nowatorski charakter. Jest to w niemal równym stopniu sztuka, co nauka.Wizualna prezentacja Stick World jest istotna, ponieważ jest to narzędzie analityki wizualnej wymagające interakcji użytkownika. Działanie. Należy użyć komputera wyposażonego w procesor Intel i5 lub lepszy, co najmniej 4 GB pamięci RAM, z zainstalowanym systemem operacyjnym Mac OS 10 lub Linux oraz bibliotekami Python wymienionymi w protokole tekstowym. Pobierz Stick World jako archiwum zip zawierające wszystkie odpowiednie skrypty Python.Należy również pobrać skrypt FASTA two stick służący do konwersji standardowych dopasowań sekwencji DNA i białek w formacie FASTA na format stick world. Należy wypakować archiwum, a otrzymany folder stick world oraz skrypt FASTA two stick umieścić na pulpicie. Następnie, przy użyciu dowolnego standardowego oprogramowania do dopasowań, należy utworzyć dopasowanie sekwencji białkowych.Zapisz dopasowanie na pulpicie. Wybierz odpowiedni format. Otwórz aplikację terminala na komputerze macro Linux i przejdź do pulpitu, wpisując CD tilda slash desktop, a następnie naciskając klawisz enter w terminalu.Wpisz polecenie, aby nadać uprawnienia do wykonywania skryptowi FASTA two stick, a następnie wpisz polecenie w celu uruchomienia skryptu. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby określić nazwę pliku wejściowego oraz pożądaną nazwę pliku wyjściowego. Zapisz plik wyjściowy na pulpicie.Przejdź do folderu z plikami wykonywalnymi stick world, korzystając z aplikacji terminala w systemie Mac lub Linux. Uruchom stick world, wpisując w terminalu Python dash 32 stick world demo PI. Upewnij się, że na ekranie widoczny jest panel ładowania danych stick world. Następnie załaduj przekonwertowane dopasowanie sekwencji białkowych, naciskając przycisk load protein.Wybierz utworzony plik i naciśnij otwórz; program Stick World otworzy kilka nowych okien, w tym Stick World Control oraz Stick World Open GL. Wybierz okno Stick World Open GL. Z menu Open GL wybierz opcję Reset View, aby wyświetlić domyślną wizualizację Stick World w rzucie z góry przez cylinder, reprezentującą dane w skalowalnych oknach Open GL.W środowisku stick world dostępnych jest kilka opcji widoku. Zaznacz pola etykiet kolumn i etykiet kul w panelu sterowania stick world, aby wyświetlić wartości dla kolumn i kul. Odznacz pole krawędzi kolumn w panelu sterowania stick world, aby ukryć linie krawędzi kolumn.W panelu sterowania stick world ustaw grubość kolumn na 0.1, aby narysować cienką linię przechodzącą przez kolumny. Aby ułatwić nawigację w widoku 3D, naciśnij Enter, aby zatwierdzić zmianę. Zresetuj widok w oknie open GL stick world.Następnie naciśnij przycisk pełnego ekranu, aby zmaksymalizować widok i umożliwić nawigację w programie. Obracaj trójwymiarowy model świata pałeczek, przytrzymując lewy przycisk myszy i przesuwając mysz w dowolnym kierunku. Powiększaj lub pomniejszaj widok modelu świata pałeczek, przytrzymując prawy przycisk myszy i przesuwając mysz w górę lub w dół.Przeglądaj widok za pomocą panowania i powiększania; współewoluujące reszty przekraczające wymagane progi zarówno dla p, jak i residual są połączone liniami krawędzi. Jeśli liczba krawędzi łączących reszty jest zbyt duża lub zbyt mała, zmień próg residual, aby wyświetlić mniej lub więcej krawędzi. Zwiększ próg residual w panelu sterowania stick world, aż linie krawędzi IPD znikną, a następnie powoli go obniżaj, aż pojawią się relacje. Kontynuuj zwiększanie residual, dopóki liczba relacji nie będzie wystarczająca do przeprowadzenia analizy.Zidentyfikuj relacje obejmujące pozostałości o znanym znaczeniu lub pozostałości oddalone od siebie w obrębie dopasowania, używając kombinacji klawisza command i lewego przycisku myszy, a następnie zaznacz interesujące Cię krawędzie. Panel sterowania „stick world” wskaże kolumny i połączy konkretne pozostałości. Linie ciągłe reprezentują powiązania dodatnie.Podczas gdy linie przerywane reprezentują asocjacje negatywne. Należy nacisnąć przycisk krawędzi wyjściowych (output edges) w panelu sterowania stick world, aby zapisać w odpowiednim katalogu plik tekstowy ze wszystkimi widocznymi krawędziami, zawierający pozostałości łączące oraz ich rzeczywiste wartości pozostałościowe. Na pierwszym planie widoczny jest duży klaster zależności interpozycyjnych (IPDs), w tym asocjacja trzech węzłów pomiędzy glicyną w pozycji 1 32, tyrozyną w pozycji 1 35 i proliną w pozycji 1 41.Tutaj widok został przesunięty, aby ustawić użytkownika nieco powyżej cylindra, co ujawnia IPD pomiędzy histydyną w pozycji 36 a metioniną w pozycji 107, oddalonymą o dwudziestu dziewięciu resztach. Z kolei motyw pochodny A-P-A-M-H-M-M tej samej domeny nie wykrywa tych elementów jako specyficznie współwystępującej wariancji motywu i definiuje ogólne grupowania według schematu niepopartego biologicznie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby wypróbować ją na dwa różne sposoby.Zacznij od wysokiej wartości pozostałości i stopniowo ją zmniejszaj lub zacznij od niskiej wartości i stopniowo ją zwiększaj, aby w ten sposób zbadać przestrzeń na dwa różne sposoby.

optimization-synthetic-proteins-identification-interpositional

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisano wytyczne dotyczące komputerowej charakterystyki strukturalnej i funkcjonalnej białka z wykorzystaniem potoku I-TASSER. Wychodząc od sekwencji białka zapytania, generowane są modele 3D przy użyciu wielokrotnych dopasowań wątkowych oraz iteracyjnych symulacji montażu strukturalnego. Następnie wyciągane są wnioski funkcjonalne na podstawie dopasowań do białek o znanej strukturze i funkcjach.

Protokół komputerowego przewidywania struktury i funkcji białek

Opracowaliśmy obliczeniowe metody projektowania białek de novo, które są w stanie zająć się kilkoma ważnymi obszarami projektowania białek. Aby rozpowszechnić te metody, prezentujemy Protein WISDOM, internetowe narzędzie do projektowania białek (http://www.proteinwisdom.org). Zaczynając od szablonu strukturalnego, można zaprojektować białka monomeryczne w celu zwiększenia stabilności i kompleksów w celu zwiększenia powinowactwa wiązania.

Protein WISDOM: Stół warsztatowy do projektowania in silico de novo biomolekuł

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Przedstawiono protokół do badania online relacji sekwencja-struktura-dynamika białek za pomocą Bio3D-web.

Badanie zależności między sekwencją, strukturą i dynamiką białek za pomocą Bio3D-web

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Strukturalnie powiązane białka często pełnią odrębne funkcje biologiczne. Wymiana równoważnych regionów tych białek w celu wytworzenia białek chimerycznych stanowi innowacyjne podejście do identyfikacji krytycznych regionów białkowych, które są odpowiedzialne za ich funkcjonalną dywergencję.

Identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych

Opisany tutaj protokół zawiera szczegółowe instrukcje, jak analizować interesujące regiony genomu pod kątem potencjału kodowania mikrobiałek za pomocą PhyloCSF w przyjaznej dla użytkownika przeglądarce genomu UCSC. Ponadto zaleca się stosowanie kilku narzędzi i zasobów w celu dalszego zbadania charakterystyki sekwencji zidentyfikowanych mikrobiałek w celu uzyskania wglądu w ich przypuszczalne funkcje.

Zintegrowane podejście do identyfikacji mikrobiałek i analizy sekwencji

Opisujemy metodologię opartą na dywersyfikacji sekwencji w celu oszacowania preferencji aminokwasowych wielospecyficznych miejsc wiązania w interakcjach białko-białko (PPI). W ramach tej strategii tysiące potencjalnych ligandów peptydowych są generowane i badane in silico, pokonując w ten sposób niektóre ograniczenia dostępnych metod eksperymentalnych.

Obliczeniowe przewidywanie preferencji aminokwasów potencjalnie wielospecyficznych domen wiążących peptydy zaangażowanych w interakcje białko-białko

Tutaj opisujemy protokół optymalizacji i parametryzacji reszt aminokwasowych modyfikowanych reaktywnymi gatunkami karbonylowymi, które można dostosować do systemów białkowych. Etapy protokołu obejmują projektowanie i optymalizację struktury, przypisywanie ładunków, konstrukcję parametrów i przygotowanie układów białkowych.

Synteza aminokwasów modyfikowanych reaktywnymi karbonylkami in silico w celu oceny efektów strukturalnych przy użyciu symulacji dynamiki molekularnej

Projektowanie białek polega na budowie sekwencji aminokwasów i włączaniu określonych motywów w celu stworzenia funkcjonalnych wariantów. Takie podejście ma kluczowe znaczenie dla opracowania peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) do zwalczania patogenów opornych na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę budowy białek z wykorzystaniem różnych narzędzi bioinformatycznych.

Zastosowanie I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, serwera HADDOCK i lorii HEX do projektowania białek De Novo i In Silico

Odkryj metodę identyfikacji koewoluujących reszt w białkach przy użyciu narzędzia StickWRLD. Poznaj techniki wizualizacji zależności interpozycyjnych IPD w celu optymalizacji projektowania białek.

Optymalizacja białek syntetycznych: identyfikacja zależności interpozycyjnych wskazujących na strukturalnie i/lub funkcjonalnie powiązane reszty (Wideo) | JoVE Journal

Optymalizacja białek syntetycznych: identyfikacja zależności interpozycyjnych wskazujących na strukturalnie i/lub funkcjonalnie powiązane reszty

Przeglądaj więcej filmów