Optymalizacja białek syntetycznych: identyfikacja zależności interpozycyjnych wskazujących na strukturalnie i/lub funkcjonalnie powiązane reszty
14 lipca 2015
Syntetyczne sekwencje białek oparte na motywach konsensusu zazwyczaj ignorują współewoluujące resztki, które implikują zależności interpozycyjne (IPD). IPD mogą być niezbędne do działania, a projekty, które je ignorują, mogą skutkować nieoptymalnymi wynikami. Protokół ten wykorzystuje StickWRLD do identyfikacji IPD i pomaga w racjonalnym projektowaniu białek, co skutkuje bardziej wydajnymi wynikami.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja współewoluujących reszt w wyrównaniach białek, które wskazują na zależności międzypozycyjne (ang. interpositional dependencies, IPDs). Jest to realizowane poprzez załadowanie wyrównania do programu stick world, który jest narzędziem analityki wizualnej tworzącym interaktywną reprezentację 3D wyrównania białek i przejrzyście wyświetlającym współzmienne reszty. Każda pozycja w wyrównaniu jest reprezentowana jako kolumna składająca się ze stosu sfer – po jednej sferze dla każdego z 20 możliwych aminokwasów w danej pozycji wyrównania, których rozmiar zależy od częstotliwości występowania; kolumny reprezentujące każdą pozycję są owinięte wokół cylindra w celu przedstawienia IPDs.
Linie są rysowane pomiędzy resztami, które koewoluują w stopniu wyższym lub niższym, niż oczekiwano by w przypadku, gdyby reszty znajdujące się na tych pozycjach były zależne w ramach programu. Wartość rezydualna jest dostrajana aż do uzyskania zarządzalnej liczby krawędzi, a następnie identyfikowane są krawędzie budzące zainteresowanie. Ostatecznie program stick world służy do identyfikacji reszt, które koewoluują ze sobą.
Takie funkcjonalnie wymagane reszty tworzące pętlę osłonową (coving residues) zidentyfikowano w kinazie wentylacyjnej. Jednym z powodów, dla których badacze mają trudności z tym procesem, jest jego nowatorski charakter. Jest to w niemal równym stopniu sztuka, co nauka.
Wizualna prezentacja Stick World jest istotna, ponieważ jest to narzędzie analityki wizualnej wymagające interakcji użytkownika. Działanie. Należy użyć komputera wyposażonego w procesor Intel i5 lub lepszy, co najmniej 4 GB pamięci RAM, z zainstalowanym systemem operacyjnym Mac OS 10 lub Linux oraz bibliotekami Python wymienionymi w protokole tekstowym. Pobierz Stick World jako archiwum zip zawierające wszystkie odpowiednie skrypty Python.
Należy również pobrać skrypt FASTA two stick służący do konwersji standardowych dopasowań sekwencji DNA i białek w formacie FASTA na format stick world. Należy wypakować archiwum, a otrzymany folder stick world oraz skrypt FASTA two stick umieścić na pulpicie. Następnie, przy użyciu dowolnego standardowego oprogramowania do dopasowań, należy utworzyć dopasowanie sekwencji białkowych.
Zapisz dopasowanie na pulpicie. Wybierz odpowiedni format. Otwórz aplikację terminala na komputerze macro Linux i przejdź do pulpitu, wpisując CD tilda slash desktop, a następnie naciskając klawisz enter w terminalu.
Wpisz polecenie, aby nadać uprawnienia do wykonywania skryptowi FASTA two stick, a następnie wpisz polecenie w celu uruchomienia skryptu. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby określić nazwę pliku wejściowego oraz pożądaną nazwę pliku wyjściowego. Zapisz plik wyjściowy na pulpicie.
Przejdź do folderu z plikami wykonywalnymi stick world, korzystając z aplikacji terminala w systemie Mac lub Linux. Uruchom stick world, wpisując w terminalu Python dash 32 stick world demo PI. Upewnij się, że na ekranie widoczny jest panel ładowania danych stick world. Następnie załaduj przekonwertowane dopasowanie sekwencji białkowych, naciskając przycisk load protein.
Wybierz utworzony plik i naciśnij otwórz; program Stick World otworzy kilka nowych okien, w tym Stick World Control oraz Stick World Open GL. Wybierz okno Stick World Open GL. Z menu Open GL wybierz opcję Reset View, aby wyświetlić domyślną wizualizację Stick World w rzucie z góry przez cylinder, reprezentującą dane w skalowalnych oknach Open GL.
W środowisku stick world dostępnych jest kilka opcji widoku. Zaznacz pola etykiet kolumn i etykiet kul w panelu sterowania stick world, aby wyświetlić wartości dla kolumn i kul. Odznacz pole krawędzi kolumn w panelu sterowania stick world, aby ukryć linie krawędzi kolumn.
W panelu sterowania stick world ustaw grubość kolumn na 0.1, aby narysować cienką linię przechodzącą przez kolumny. Aby ułatwić nawigację w widoku 3D, naciśnij Enter, aby zatwierdzić zmianę. Zresetuj widok w oknie open GL stick world.
Następnie naciśnij przycisk pełnego ekranu, aby zmaksymalizować widok i umożliwić nawigację w programie. Obracaj trójwymiarowy model świata pałeczek, przytrzymując lewy przycisk myszy i przesuwając mysz w dowolnym kierunku. Powiększaj lub pomniejszaj widok modelu świata pałeczek, przytrzymując prawy przycisk myszy i przesuwając mysz w górę lub w dół.
Przeglądaj widok za pomocą panowania i powiększania; współewoluujące reszty przekraczające wymagane progi zarówno dla p, jak i residual są połączone liniami krawędzi. Jeśli liczba krawędzi łączących reszty jest zbyt duża lub zbyt mała, zmień próg residual, aby wyświetlić mniej lub więcej krawędzi. Zwiększ próg residual w panelu sterowania stick world, aż linie krawędzi IPD znikną, a następnie powoli go obniżaj, aż pojawią się relacje. Kontynuuj zwiększanie residual, dopóki liczba relacji nie będzie wystarczająca do przeprowadzenia analizy.
Zidentyfikuj relacje obejmujące pozostałości o znanym znaczeniu lub pozostałości oddalone od siebie w obrębie dopasowania, używając kombinacji klawisza command i lewego przycisku myszy, a następnie zaznacz interesujące Cię krawędzie. Panel sterowania „stick world” wskaże kolumny i połączy konkretne pozostałości. Linie ciągłe reprezentują powiązania dodatnie.
Podczas gdy linie przerywane reprezentują asocjacje negatywne. Należy nacisnąć przycisk krawędzi wyjściowych (output edges) w panelu sterowania stick world, aby zapisać w odpowiednim katalogu plik tekstowy ze wszystkimi widocznymi krawędziami, zawierający pozostałości łączące oraz ich rzeczywiste wartości pozostałościowe. Na pierwszym planie widoczny jest duży klaster zależności interpozycyjnych (IPDs), w tym asocjacja trzech węzłów pomiędzy glicyną w pozycji 1 32, tyrozyną w pozycji 1 35 i proliną w pozycji 1 41.
Tutaj widok został przesunięty, aby ustawić użytkownika nieco powyżej cylindra, co ujawnia IPD pomiędzy histydyną w pozycji 36 a metioniną w pozycji 107, oddalonymą o dwudziestu dziewięciu resztach. Z kolei motyw pochodny A-P-A-M-H-M-M tej samej domeny nie wykrywa tych elementów jako specyficznie współwystępującej wariancji motywu i definiuje ogólne grupowania według schematu niepopartego biologicznie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby wypróbować ją na dwa różne sposoby.
Zacznij od wysokiej wartości pozostałości i stopniowo ją zmniejszaj lub zacznij od niskiej wartości i stopniowo ją zwiększaj, aby w ten sposób zbadać przestrzeń na dwa różne sposoby.
Przegląd
Niniejszy protokół wykorzystuje narzędzie StickWRLD do identyfikacji współewoluujących reszt w wyrównaniach białek, wskazując zależności międzypozycyjne (IPDs), które są kluczowe dla aktywności białek. Poprzez uwzględnienie IPDs w projektowaniu białek, badacze mogą osiągnąć bardziej efektywne wyniki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Projektowanie białek
- Bioinformatyka
- Biologia strukturalna
Wstęp
- Współewoluujące reszty wskazują na zależności międzypozycyjne (IPDs).
- Ignorowanie IPDs może prowadzić do nieoptymalnego projektowania białek.
- StickWRLD jest narzędziem analityki wizualnej do analizy dopasowania białek.
- Zrozumienie IPDs jest niezbędne dla racjonalnego projektowania białek.
Cel badania
- W celu zidentyfikowania współewoluujących reszt, które wskazują na IPDs.
- W celu zwiększenia efektywności procesów projektowania białek.
- W celu zaprezentowania użyteczności StickWRLD w wizualizacji dopasowań białek.
Zastosowane metody
- Wczytaj dopasowania białek do programu StickWRLD.
- Wizualizuj współewoluujące reszty za pomocą reprezentacji 3D.
- Dostosuj progi resztowe, aby zidentyfikować istotne zależności.
- Wyeksportuj dane dotyczące zidentyfikowanych IPD do dalszej analizy.
Główne wyniki
- Identyfikacja istotnych IPD w sekwencjach białkowych.
- Wizualizacja współewoluujących reszt za pomocą interaktywnych modeli 3D.
- Wykazanie znaczenia IPD dla funkcjonalności białek.
- Skuteczne zastosowanie StickWRLD w analizie dopasowań białkowych.
Wnioski
- Włączenie nieustrukturyzowanych regionów białkowych (IPD) do projektowania białek może zwiększyć ich aktywność.
- StickWRLD służy jako skuteczne narzędzie do wizualizacji oddziaływań białkowych.
- Zrozumienie koewolucji jest kluczowe dla racjonalnej inżynierii białek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Identyfikacja zależności interpozycyjnych (IPDs) w sekwencjach białek umożliwia dokładniejsze projektowanie syntetycznych białek poprzez ujawnienie ewolucyjnie konserwowanych relacji między resztami, które wpływają na fałdowanie, stabilność i funkcję. Ignorowanie tych kowariacji niesie ze sobą ryzyko generowania niewykonalnych sekwencji konsensusowych, które są pozbawione znaczenia biologicznego. StickWRLD oferuje podejście oparte na analityce wizualnej do wykrywania takich zależności, wspierając racjonalną inżynierię białek terapeutycznych z wyższą pewnością prognostyczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Ujawnia funkcjonalnie powiązane reszty, które mogą wskazywać na krytyczne miejsca strukturalne lub katalityczne w białkach docelowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia opartą na hipotezach analizę kowariancji reszt w celu zmniejszenia ryzyka związanego z mechanizmami celu na wczesnym etapie procesu odkrywania.
Przesiew oraz opracowanie testu
- Wartość naukowa: Identyfikacja współewoluujących par reszt, które mogą pomóc w projektowaniu stabilizowanych wariantów białek w celu zwiększenia odporności testu.
- Wartość operacyjna: Wsparcie rozwoju ustandaryzowanych wejść białkowych z zachowanymi interfejsami funkcjonalnymi dla zapewnienia powtarzalności przesiewu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy kowariację sekwencji z motywami strukturalnymi, które mogą korelować z domenami funkcjonalnymi istotnymi dla mechanizmów chorobowych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przeniesienie projektów opartych na IPD do modeli przedklinicznych poprzez zachowanie interakcji reszt zbliżonych do natywnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków, dostarczając mechanistycznych informacji niezbędnych do walidacji celu oraz umożliwiając optymalizację związków wiodących poprzez projektowanie oparte na strukturze, wspierane analizą kowariancji ewolucyjnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wskazywanie sieci reszt, które mogą leżeć u podstaw funkcji białka lub regulacji allosterycznej.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie wariantów białek z zachowanymi powierzchniami oddziaływań, co poprawia spójność angażowania celu w testach.
- Analityka: Generuje ilościowe dane krawędziowe (wartości resztkowe) między resztami ewoluującymi wspólnie, aby rankingować i priorytetyzować hipotezy strukturalne.
- Badania translacyjne: Łączy wzorce ewolucyjne z ciągłością strukturalną, pomagając w projektowaniu białek z zachowaną funkcją w różnych modelach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia wielokrotnego użytku platformę analityki wizualnej do iteracyjnego projektowania białek dla wielu celów i projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w projektowaniu białek poprzez uwzględnienie oddziaływań reszt ograniczonych ewolucyjnie.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzowanej wizualizacji i detekcji par współewoluujących z dostosowaniem progów.
- Wartość strategiczna: Redukuje ryzyko niepowodzenia na późnym etapie badań poprzez poprawę biologicznej wiarygodności białek syntetycznych we wczesnej fazie rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do inżynierii białek w oparciu o analizę ryzyka, bazując na strukturalnych i funkcjonalnych zależnościach reszt.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie dopasowywania sekwencji białkowych oraz analizy ewolucyjnej.
- Wymagana jest stacja robocza z systemem Python 3.2+, wsparciem OpenGL oraz określonymi bibliotekami do uruchomienia programu StickWRLD.
- Wymagane są ustandaryzowane dopasowania wejściowe i spójne ustawienia progów w celu zapewnienia powtarzalności detekcji IPD pomiędzy zespołami.
- Proces obejmuje manualną inspekcję wizualizacji 3D w celu zidentyfikowania biologicznie istotnych oddziaływań reszt.
- Ograniczeniem jest jakość i głębokość wejściowego wielokrotnego dopasowania sekwencji, co wpływa na siłę sygnału kowariancji.
