Name: Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Poznaj metodę sieciowania specyficznego dla miejsca z radiomarkowaniem puls-chase do badania dynamicznych interakcji białkowych w żywych komórkach E. coli. Technika ta pozwala monitorować tworzenie się czynników wirulencji bakteryjnych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Intramural Research Program Narodowego Instytutu Cukrzycy i Chorób Układu Pokarmowego i Nerek.

1. Budowa plazmidu
<ol>
	<li>Po sklonowaniu genu, który koduje interesujące białko do odpowiedniego wektora ekspresji, wprowadź mutacje bursztynowe w pożądanych lokalizacjach za pomocą zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. 
	UWAGA: Informacje strukturalne i przewidywania ekspozycji powierzchniowej mogą służyć jako użyteczne przewodniki do określania pozycji mutacji. Ponieważ skuteczność tłumienia i sieciowania bursztynu może się znacznie różnić, mutacje bursztynu powinny być wprowadzane w wielu pozycjach. Ponadto, ponieważ Bpa jest analogiem tyrozyny i fenyloalaniny, należy spróbować wprowadzić mutacje bursztynu w pozycjach, które normalnie kodują duże hydrofobowe aminokwasy, aby zminimalizować zaburzenia struktury i funkcji białka. Wreszcie, wybierając wektor ekspresji, należy pamiętać, że nadprodukcja białka będącego przedmiotem zainteresowania na bardzo wysokim poziomie może ograniczyć efektywność inkorporacji Bpa.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultury
<ol>
	<li>Użyj elektroporacji, aby przekształcić odpowiedni szczep E. coli z plazmidem, który koduje bursztynowy system supresyjny (pDULE-p Bpa; patrz odniesienie4) i kompatybilnym plazmidem, który koduje białko będące przedmiotem zainteresowania z bursztynową mutacją.</li>
	<li>Płytki komórkowe na agarze LB zawierające odpowiednie antybiotyki (użyć 5 μg/ml tetracykliny do wyboru pDULE-p Bpa). Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia rozpocznij hodowle O/N z pojedynczych kolonii w 3-5 ml pożywki M914 zawierającej 0,2% glicerolu, wszystkie L-aminokwasy z wyjątkiem metioniny i cysteiny (40 μg/ml) oraz antybiotyki. Inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia odwirować kultury O/N o masie 2,500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml świeżej pożywki M9 i powtórzyć wirowanie. 
	UWAGA: Ten etap płukania ma kluczowe znaczenie dla utrzymania plazmidów, które kodują oporność na ampicylinę, ponieważ niewielkie ilości laktamazy b, które są obecne w pożywce z kultur O/N, rozkładają świeżo dodaną ampicylinę, zanim nastąpi znaczny wzrost komórek.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 2 ml świeżej pożywki i zmierzyć stężenie komórek w spektrofotometrze (OD550).</li>
	<li>Dodać komórki do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml pożywki M9 i antybiotyków o OD550 = 0,03. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w wytrząsającej łaźni wodnej.</li>
</ol>
3. Włączenie Bpa i przygotowanie do fotosieciowania
UWAGA: Protokół opisany poniżej dotyczy przykładowego kursu czasowego, który ma trzy punkty czasowe (0, 1 i 5 minut). Dostosuj odpowiednio głośność, jeśli pożądana jest inna liczba punktów czasowych. Zarys procedury przedstawiono na rysunku 1.
<ol>
	<li>Podczas gdy kultury rosną, przygotuj świeży 1 M (1,000x) roztwór Bpa w 1 M NaOH (27 mg Bpa w 100 μl 1 M NaOH). Użyj rurki o ciemnych ściankach, aby utrzymać roztwór w ciemności.</li>
	<li>Gdy kultury osiągną wczesną do środkowej fazy logarytmicznej (OD550 = 0,2), dodaj 50 μl 1 M Bpa do każdej kultury. Dodawaj Bpa po jednej kropli na raz, obracając kolbę, aby uniknąć wytrącania się. Następnie dodaj wszelkie induktory, które są potrzebne do napędzania ekspresji bursztynowego mutanta. Kontynuować inkubację kultur w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 30 minut.</li>
	<li>Podczas 30-minutowego okresu indukcji oznaczyć sześć jednorazowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml punktem czasowym (0 min, 1 min, 5 min) i "+ UV" lub "- UV". Umieść probówki na lodzie.</li>
	<li>Napełnij drugie wiadro na lód lodem i umieść 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej na wierzchu lodu.</li>
	<li>Rozmrozić 35S-metioninę i 35 S-cysteinę o wysokiej aktywności właściwej (1000mCi/mmol) (lub wstępnie przygotowaną mieszaninę tych dwóch związków) do znakowania impulsowego i przygotować (lub rozmrozić) roztwór nieradioaktywnej L-cysteiny i L-metioniny (po 100 mM każdy) do pościgu.</li>
	<li>Włącz lampę UV pięć minut przed znakowaniem radioaktywnym. 
	UWAGA: Lampa powinna być regulowana tak, aby można ją było ustawić ~3-4 cm od próbek w płytce wielodołkowej.</li>
	<li>Dodaj lód (~2 ml) do każdej probówki oznaczonej "- UV" i do dwóch studzienek w płytce wielodołkowej. 
	UWAGA: Lód należy dodać do trzeciego dołka bezpośrednio przed 5-minutowym punktem czasowym. Niezbędne jest umieszczanie lodu bezpośrednio w rurach i studzienkach, aby natychmiast zatrzymać reakcje wewnątrzkomórkowe w każdym punkcie czasowym, a tym samym uzyskać dokładne "migawki" określonego szlaku biochemicznego.</li>
	<li>Pod koniec 30-minutowego okresu indukcji przenieść 25 ml kultury do wstępnie podgrzanej jednorazowej kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml. Umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Etykietowanie impulsowe i promieniowanie UV
UWAGA: Etykietowanie impulsowe i protokół naświetlania promieniowaniem UV składa się z wielu kroków, które muszą być wykonane w odpowiednim czasie i które wymagają znacznej organizacji i wcześniejszego przygotowania. Wszystkie odczynniki i probówki powinny być łatwo dostępne. Poniżej przedstawiono protokół eksperymentu, który ma punkty czasowe 0, 1 i 5 minut.
<ol>
	<li>O godzinie 0:00 (min:s) przenieść 25 ml kultury do kolby o pojemności 125 ml.</li>
	<li>O godzinie 0:30 dodać 30 μCi/ml radioaktywnych aminokwasów; szybko zamieszać, aby wymieszać. Umieścić kolbę w łaźni wodnej wytrząsającej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>O godzinie 1:00 dodać 250 μl 100 mM roztworu metioniny i cysteiny; szybko zamieszać do wymieszania.
	<ol>
		<li>Natychmiast odpipetować 4 ml kultury do jednego z dołków schłodzonej płytki wielodołkowej zawierającej lód. Odpipetować drugą porcję o pojemności 4 ml do probówki o pojemności 15 ml oznaczonej "0 min - UV". Umieścić kolbę z powrotem w łaźni wodnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>O godzinie 2:00 odpipetować 4 ml kultury do drugiego dołka schłodzonej płytki wielodołkowej, która zawiera lód. Odpipetować kolejną porcję o pojemności 4 ml do 15 ml probówki oznaczonej "1 min - UV". Umieścić kolbę z powrotem w łaźni wodnej.</li>
	<li>O godzinie 6:00 odpipetować 4 ml kultury do trzeciego dołka schłodzonej płytki wielodołkowej, która zawiera lód. Odpipetować kolejną porcję o pojemności 4 ml do 15 ml probówki oznaczonej "5 min - UV".</li>
	<li>Umieść pojemnik na lód z płytką wielodołkową pod podgrzaną lampą UV i naświetlaj każdą próbkę indywidualnie przez 4 min. 
	UWAGA: W eksperymentach, w których punkty czasowe są oddalone od siebie o co najmniej 4 minuty, każda próbka powinna być napromieniana zaraz po jej odpipetowaniu do płytki wielodołkowej.</li>
	<li>Przenieś komórki do schłodzonych probówek o pojemności 15 ml oznaczonych "0 min + UV", 1 min + UV" itp.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić każdą próbkę w 300 μl pożywki M9 lub PBS i dodać 33 μl 100% zimnego kwasu trichlorooctowego (TCA) w celu wytrącenia białek. Odwirować TCA, wytrącić w mikrodymie z maksymalną prędkością przez 10 minut i usunąć supernatant. W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
5. Wykrywanie produktów immunoprecypitacji i sieciowania
<ol>
	<li>Dodać 50 μl buforu do rozpuszczania (15% glicerolu, 200 mM Trisbase, 15 mM EDTA, 4% SDS, 2 mM PMSF) do każdej próbki i podgrzewać z mieszaniem w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu rozpuszczenia wytrąconego białka.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0% Igepal CA-630, 0,5% deoksycholanu, 0,1% SDS) i przeprowadzić standardowe immunoprecypitacje15 przy użyciu jednej piątej do połowy każdej próbki. 
	UWAGA: Igepal CA-630 (glikol oktylofenylopolietylenowy) jest stosowany zamiast NP-40, który nie jest już dostępny na rynku. Te dwa związki są chemicznie nie do odróżnienia.</li>
	<li>Rozpoznawanie białek immunoprecypitowanych za pomocą SDS-PAGE. Bejcować, odbarwiać i suszyć żele.</li>
	<li>Wystaw żele na działanie ekranu luminoforowego O/N i wykryj białka radioaktywne (w tym produkty sieciowania) za pomocą luminowizora.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+large-scale+data+sets+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions.</a> Nature. 417, 399-403 (2002).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.</a> PNAS. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-cross-linking+interacting+proteins+with+a+genetically+encoded+benzophenone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone.</a> Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).</li>
<li>Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ligand-receptor+interfaces%3A+approaching+the+resolution+limit+of+benzophenone-based+photaffinity+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning.</a> Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).</li>
<li>Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+spatially+restricted+interactions+of+assembly+factors+with+an+autotransporter+beta+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain.</a> PNAS. 108, 383-391 (2011).</li>
<li>Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Deiters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+amino+acids+with+novel+reactivity+to+the+genetic+code+of+Saccharyomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+repertoire+of+the+methylotrophic+yeast+Pichiapastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris.</a> Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).</li>
<li>Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).</li>
<li>Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+self+sufficiency+to+dependence%3A+mechanisms+and+factors+important+for+autotransporter+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).</li>
<li>Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+an+autotransporter+passenger+domain+with+BamA+during+its+translocation+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane.</a> PNAS. 106, 19120-19125 (2009).</li>
<li>Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+barrel+assembly+and+the+initiation+of+autotransporter+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion.</a> PNAS. 110, (2013).</li>
<li>Harlow, D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+D+%22Using+antibodies%3A+a+laboratory+manual%22">Using antibodies: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autotransporter+structure+reveals+intra-barrel+cleavage+followed+by+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).</li>
<li>Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecY+protein%2C+a+membrane-embedded+secretion+factor+of+E.+coli%2C+is+cleaved+by+the+ompT+protease+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W artykule opisano metodę, która łączy fotosieciowanie specyficzne dla miejsca z etykietowaniem impulsowym w celu zbadania dynamiki interakcji między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a innymi składnikami żywej komórki. Metoda jest szczególnie przydatna do badania wieloetapowych procesów, w których białko oddziałuje sekwencyjnie z innymi czynnikami. W przeciwieństwie do tradycyjnych podejść do chemicznego sieciowania, fotosieciowanie specyficzne dla miejsca dostarcza szczegółowych informacji o stanie poszczegó...

Często konieczne jest zidentyfikowanie i scharakteryzowanie interakcji między interesującym białkiem a innymi składnikami komórkowymi, aby określić jego rolę w szlaku biologicznym, zrozumieć jego składanie lub wyjaśnić mechanizm jego działania. Do badania interakcji białko-białko powszechnie stosuje się wiele różnych podejść, ale wszystkie mają swoje ograniczenia. Najprostszą bezstronną metodą identyfikacji białek, które wiążą się z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, jest kooczyszczanie (lub koimmunoprecypitacja), ale takie podejście wymaga, aby kompleks białkowy pozostał nienaruszony podczas procedury oczyszczania. Słabe lub przejściowe interakcje białek można ustabilizować poprzez chemiczne sieciowanie, ale ta metoda zazwyczaj wymaga użycia związków, które łączą białka za pośrednictwem amin pierwszorzędowych, które są szeroko rozproszone w sekwencji białka. Można generować skomplikowane wzorce sieciowania, które są trudne do interpretacji, zwłaszcza gdy interesujące białka są składnikami kompleksów wielobiałkowych. Ponadto, ponieważ ramiona dystansowe chemicznych środków sieciujących zwykle przekraczają długość 10 A, wiązania kowalencyjne mogą być tworzone z białkami, które znajdują się w pobliżu, ale nie oddziałują bezpośrednio z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Metody takie jak chromatografia powinowactwa i badania przesiewowe dwóch hybryd są również często przydatne do identyfikacji interakcji białko-białko. Pierwsze podejście wymaga jednak odtworzenia warunków, które sprzyjają fizjologicznie istotnym interakcjom i nie mogą być wykorzystywane do wykrywania słabych interakcji. To ostatnie podejście wymaga, aby interakcje wiążące mogły być replikowane w organizmie gospodarza i były utrzymywane, gdy białko będące przedmiotem zainteresowania i jego partnerzy wiążący są umieszczane w kontekście białka fuzyjnego. Metody dwuhybrydowe mają również tendencję do generowania wyników fałszywie dodatnich2. Po ustaleniu interakcji białko-białko często konieczne jest znaczne nałożenie pracy na mapowanie miejsca interakcji. Być może najważniejszą wadą tradycyjnych podejść jest to, że nie dostarczają one żadnych informacji na temat czasowej sekwencji oddziaływań międzycząsteczkowych ani kinetyki wiązania.
Ten artykuł opisuje prostą metodę, która pokonuje niektóre ograniczenia innych podejść, które są używane do badania interakcji białko-białko. Początkowo do genu kodującego białko o znaczeniu bawełnianym wprowadzana jest pojedyncza mutacja bursztynowa. Bursztynowy mutant ulega następnie koekspresji z bursztynowym supresorowym tRNA i syntetazą aminoacylo-tRNA pochodzącą z Methanococcus jannaschii, które zostały zaprojektowane tak, aby zawierały fotoaktywowany analog aminokwasu p-benzoilofenyloalaniny (Bpa) tylko w bursztynowych kodonach3. Naświetlanie komórek światłem ultrafioletowym (UV) o dużej długości fali (~365 nm) ułatwia następnie tworzenie wiązania kowalencyjnego między Bpa a białkami mieszczącymi się w zakresie ~3-8 A4,5. W niektórych kontekstach eksperymentalnych mogą również powstawać wiązania krzyżowe między aktywowanym Bpa a niebiałkowymi składnikami komórek, takimi jak lipidy i kwasy nukleinowe6. Cząsteczki, które są zakończone na bursztynowym kodonie, powinny być na ogół łatwe do odróżnienia od pełnowymiarowego białka na SDS-PAGE i nie mogą być sieciowane z innymi białkami. Poddając komórki znakowaniu radioaktywnemu impulsowo przed sieciowaniem, a następnie immunoprecypitacji lub produktom sieciowania oczyszczającym powinowactwo, można ustalić sekwencję i czas trwania interakcji białko-białko. Zdolność do generowania czasowych informacji o interakcjach międzycząsteczkowych jest szczególnie cenna w badaniu progresji białka będącego przedmiotem zainteresowania przez dowolny uporządkowany wieloetapowy szlak składania, transportu lub sygnalizacji oraz w identyfikowaniu produktów pośrednich szlaku. Podobnie jak sieciowanie chemiczne, sieciowanie specyficzne dla miejsca wykrywa interakcje białko-białko, które zachodzą w warunkach fizjologicznych, ale wprowadzenie sieciownika w jednej pozycji ułatwia analizę interakcji między poszczególnymi segmentami białka a innymi czynnikami. Ta unikalna cecha sieciowania specyficznego dla miejsca jest szczególnie korzystna, gdy białko będące przedmiotem zainteresowania ma wiele segmentów lub domen, które mają potencjał do interakcji z różnymi partnerami wiążącymi. Co więcej, sieciowanie specyficzne dla danego miejsca może być stosowane w połączeniu z metodami takimi jak spektrometria mas w celu precyzyjnego mapowania reszt, które pośredniczą w interakcjach białko-białko. Chociaż metoda ta jest zoptymalizowana do stosowania w E. coli, włączenie analogów aminokwasów fotaktywowanych do białek przez supresję bursztynu odnotowano w Mycobacterium, drożdżach i komórkach ssaków7-11. Dzięki temu w zasadzie nasza metoda może być stosowana w innych systemach.
Intensywnie używaliśmy tej metody do identyfikacji interakcji międzycząsteczkowych, które ułatwiają biogenezę EspP, czynnika wirulencji E. coli O157:H7. EspP należy do nadrodziny białek znanych jako "autotransportery", które zawierają dużą N-końcową domenę zewnątrzkomórkową ("domena pasażera") i domenę aC-końcową ("domena b"), która składa się w cylindryczną strukturę beczki b i zakotwicza białko w błonie zewnętrznej (OM)12. Mechanizm, za pomocą którego domena pasażerów jest przenoszona przez OM, od dawna był tajemnicą. Podobnie jak wszystkie białka powierzchniowe komórek bakteryjnych, EspP musi być transportowany przez błonę wewnętrzną, transportowany przez peryplazmę (przestrzeń między błoną wewnętrzną i zewnętrzną) i kierowany do OM w serii uporządkowanych zdarzeń. Po translokacji przez OM, domena pasażerska EspP jest również oddzielana od domeny b przez rozszczepienie proteolityczne i uwalniana z powierzchni komórki. Łącząc sieciowanie specyficzne dla miejsca z radioznakowaniem impulsowym, wykazaliśmy, że obie domeny białka początkowo oddziałują z molekularnym chaperonem Skp w peryplazmie6. Następnie dyskretne segmenty domeny b oddziałują w sposób stereospecyficzny ze składnikami heterooligomeru zwanego kompleksem Bam, który katalizuje integrację białek beczkowych b z bakteryjnym OM za pomocą nieznanego mechanizmu. Być może najciekawsze jest to, że odkryliśmy, że domena pasażerska jest w kontakcie z jedną z podjednostek kompleksu Bam (BamA) podczas jej przechodzenia przez OM13. Nasze wyniki pozwoliły nam skonstruować szczegółowy model montażu autotransportera14 i uwikłać kompleks Bam w transport domeny pasażerskiej przez OM.

<table><tbody><tr><td>QuikChange II Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>BPA (H-p-Bz-Phe-OH)</td><td>Bachem</td><td>F-2800</td><td></td></tr><tr><td>TRAN35S-LABEL, odczynnik do znakowania metabolicznego (35S-L-metionina i 35S-L-cysteina, >1,000 Ci/mmol)</td><td>MP Biomedicals</td><td>51006</td><td></td></tr><tr><td>Spektrolina SB-100P Lampa UV o bardzo wysokiej intensywności, 365 nm</td><td>Spectronics Corporation</td><td>SB-110P</td><td></td></tr><tr><td>Wymienna żarówka spektrolinowa 100S</td><td>Spectronics Corporation</td><td>11-992-15</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowych Falcon, 6-dołkowa</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa kolba Erlenmeyera 125 ml</td><td>Corning</td><td>430421</td><td></td></tr><tr><td>Innova 3100 wytrząsająca kąpiel wodna</td><td>Nowość Brunswick Scientific</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Ten artykuł opisuje metodę wykrywania i analizowania dynamicznych interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami in vivo. Nasza metoda opiera się na technologii tłumienia bursztynu, która została pierwotnie opracowana przez Petera Schultza i współpracowników1. Bursztynowa mutacja jest najpierw wprowadzana do określonego kodonu genu kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania. Bursztynowy mutant ulega następnie ekspresji w E. coli wraz z genami kodującymi bursztynowe supresorowe tRNA i syntetazę aminoacylo-tRNA pochodzącą z Methanococcus jannaschii. Za pomocą tego systemu fotoaktywowany analog aminokwasu p-benzoilofenyloalanina (Bpa) jest włączony do bursztynowego kodonu. Komórki są następnie naświetlane światłem ultrafioletowym w celu kowalencyjnego połączenia reszty Bpa z białkami znajdującymi się w granicach 3-8 A. Fotosieciowanie przeprowadza się w połączeniu ze znakowaniem impulsowym i immunoprecypitacją białka będącego przedmiotem zainteresowania w celu monitorowania zmian w interakcjach białko-białko, które zachodzą w skali czasu od sekund do minut. Zoptymalizowaliśmy procedurę, aby zbadać składanie bakteryjnego czynnika wirulencji, który składa się z dwóch niezależnych domen, domeny zintegrowanej z błoną zewnętrzną i domeny, która jest translokowana do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, ale metoda może być stosowana do badania wielu różnych procesów składania i szlaków biologicznych zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Zasadniczo za pomocą spektrometrii mas można zidentyfikować czynniki oddziałujące, a nawet specyficzne reszty czynników oddziałujących, które wiążą się z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

Zastosowano specyficzne dla miejsca fotousieciowanie, aby zidentyfikować białka oddziałujące z EspP podczas jego transportu do błony zewnętrznej (OM). W przedstawionych tutaj eksperymentach kodony fenyloalaniny w pozycjach 1113 i 1214 zastąpiono kodonami bursztynowymi. Obie pozycje znajdują się w domenie β, która integruje się z OM i służy jako kotwica błonowa. Struktura krystaliczna domeny β EspP16 pokazuje, że oba reszty znajdują się po stronie periplazmatycznej beczki β, ale są oddalone od siebie o ok. 120<...

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie dynamiki oddziaływań białko-białko wewnątrz żywej komórki. Osiąga się to poprzez ekspresję badanego białka w e coli, wbudowanie analogu aminokwasu benzoylophenylalaniny w białko w konkretnym miejscu oraz przeprowadzenie radiomarkowania metodą pulse-chase w celu oznaczenia niewielkiej populacji synchronicznie syntetyzowanych cząsteczek białka. Jako drugi krok.Aliquoty komórek pobrane w różnych punktach czasowych podczas etapu pogoni są naświetlane w celu wywołania tworzenia wiązań kowalencyjnych pomiędzy analizowanym białkiem a czynnikami, z którymi ono oddziałuje. Następnie białka są immunoprecypitowane przy użyciu specyficznych przeciwciał i rozdzielane metodą elektroforezy żelowej SDS-PAGE w celu identyfikacji oddziałujących czynników; otrzymane wyniki wykazują zmiany w oddziaływaniach pomiędzy analizowanym białkiem a innymi czynnikami wewnątrzkomórkowymi w czasie, na podstawie zmian w mobilności elektroforetycznej produktów sieciowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak koimmunoprecypitacja czy sieciowanie chemiczne, jest możliwość uzyskania informacji temporalnych o oddziaływaniach zachodzących pomiędzy konkretnym resztą w analizowanym białku a innymi cząsteczkami.Takie dane są szczególnie cenne podczas badania progresji białka w wieloetapowej ścieżce składania oraz w celu identyfikacji produktów pośrednich składania. Chociaż metoda ta została zoptymalizowana do zastosowania w e coli, może być ona również wykorzystana w innych systemach, w tym w innych bakteriach, drożdżach i komórkach ssaków. Szczegółowe informacje dotyczące przygotowania hodowli znajdują się w protokole tekstowym.Przygotuj krótko pięć mililitrów pożywki M9 zawierającej 0,2% glicerolu, wszystkie aminokwasy z wyjątkiem metioniny i cystyny oraz antybiotyki. Rozpocznij hodowle nocne, dodając E. coli przekształcone plazmidem kodującym białko zainteresowania z mutacją amber oraz plazmidem kodującym system supresji amber. Inkubuj w temperaturze 37 °C. W dniu eksperymentu dodaj odpowiednią ilość komórek z hodowli nocnej do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 mililitrów zawierającej 50 mililitrów pożywki M9 i antybiotyki, aby uzyskać gęstość optyczną przy 550 nm wynoszącą 0,03. Inkubuj hodowle w temperaturze 37 °C w wytrząsanej łaźni wodnej.Gdy hodowle osiągną wczesną lub środkową fazę logarytmiczną, należy dodać 50 µL jednomolarnego benzoilofenylalaniny lub BPA do każdej hodowli. BPA należy dodawać po jednej kropli, obracając kolbę, aby zapobiec wytrącaniu osadu. Następnie należy dodać niezbędne induktory w celu wymuszenia ekspresji mutanta bursztynowego.Kontynuuj inkubację kultur w temperaturze 37°C przez kolejne 30 minut w trakcie 30-minutowego okresu indukcji. Opisz sześć jednorazowych probówek do wirowania o pojemności 15 ml, podając punkt czasowy oraz oznaczenie plus UV lub minus UV. Umieść opisane probówki na lodzie.Umieść sześciodołkową płytkę do hodowli tkankowych na drugim wiadrze z lodem wypełnionym lodem. Włącz lampę UV na pięć minut przed radioznakowaniem. Następnie dodaj około dwóch mililitrów lodu do każdej probówki oznaczonej jako minus UV oraz do dwóch dołków w płytce wielodołkowej.Niezbędne jest bezpośrednie schładzanie probówek i studzienek w lodzie, aby natychmiast przerwać reakcje wewnątrzkomórkowe w każdym punkcie czasowym, a tym samym uzyskać dokładny obraz szlaku biochemicznego pod koniec 30-minutowego okresu indukcji. Przenieś 25 ml kultury do uprzednio ogrzanej jednorazowej kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml. Umieść kolbę w wytrząsającej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.Kroki w procedurze znakowania metodą pulse-chase oraz naświetlania promieniami UV muszą być wykonane w określonym czasie i wymagają starannej organizacji oraz zaawansowanego przygotowania. W czasie jedna minuta zero sekund dodać do hodowli 30 micro curies per milliliter methionine i cysteine znakowanych S 35, a następnie szybko zamieszać wirowem w celu wymieszania.Dodaj 250 µL nieradiacyjnego 100 mM roztworu metioniny i cysteiny i szybko zamieszaj. Aby natychmiast wymieszać, przelej cztery mililitry kultury do jednej z studni schłodowanej płytki wielodotykowej zawierającej lód, a następnie przelej drugą dawkę czterech mililitrów do probówki 15 ml oznaczonej jako zero minut minus UV w czasie dwie minuty zero sekund.Pipetuj cztery mililitry hodowli do drugiej studni schłodowanej płytki wielodobowej zawierającej lód. Następnie pipetuj kolejną porcję czterech mililitrów do probówki o pojemności 15 mililitrów oznaczonej jako jedna minuta minus UV bezpośrednio przed punktem czasowym pięciu minut, a następnie około dwa mililitry lodu do trzeciej studni w płytce wielodobowej w czasie sześć minut zero sekund. Pipetuj cztery mililitry hodowli do trzeciej studni schłodzonej płytki wielodobowej zawierającej lód.Kolejną 4 ml alikwot przeniesiono do probówki 15 ml oznaczonej jako pięć minut minus UV. Umieszczono wiadro z lodem z płytką wielodołkową pod wstępnie podgrzaną lampą UV i naświetlono każdą próbkę indywidualnie przez cztery minuty. Przeniesiono komórki do schłodzonych probówek 15 ml oznaczonych jako zero minut plus UV, jedna minuta plus UV i tak dalej.Następnie odwiruj komórki przy 2 500 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Resuspenduj każdą próbkę w 300 µL medium M9 lub PBS oraz 33 µL 100% zimnego kwasu trójchlorooctowego (TCA) w celu wytrącenia białek. Odwiruj osady TCA w mikrocentry fudze z maksymalną prędkością przez 10 minut. Przed usunięciem nadsadewki dodaj 50 µL buforu solubilizującego do każdej próbki i podgrzewaj z wytrząsaniem w temperaturze 95 °C przez pięć minut, aby zsolubilizować wytrącone białko.Po dodaniu jednego mililitra buforu do radioimmunoprecypitacji należy przeprowadzić standardową immunoprecypitację, wykorzystując od jednej piątej do jednej połowy każdej próbki. Białka poddane immunoprecypitacji należy rozdzielić za pomocą elektroforezy żelowej w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Następnie barwione i wysuszone żele należy naświetlić przez noc na ekranie fosforowym, a następnie wykryć białka promieniotwórcze, w tym produkty sieciowania, za pomocą obrazownika fosforowego. Specyficzne dla miejsca fotousieciowanie zostało wykorzystane do zidentyfikowania białek, które oddziałują z ESPP podczas jego transportu do błony zewnętrznej.W tym eksperymencie kodony alaniny w pozycjach 1113 i 1214 domeny beta ESPP zostały zastąpione kodonami Amber. Struktura krystaliczna domeny beta ESPP wykazuje, że oba te reszty znajdują się po stronie periplazmatycznej beczki beta, będąc oddzielone od siebie o około 120 stopni. Dwa różne polipeptydy zostały immunoprecypitowane z komórek napromieniowanych oraz kontrolnych przy użyciu przeciwciał anty-ESPP przeciwko końcowi C oraz surowicy.Początkowo w późniejszych punktach czasowych przeważała prekursorowa forma białka o masie około 135 kilodaltonów, zawierająca kowalencyjnie połączone domeny pasażerską i beta. Poziom PRO ESPP spadał, a wolna domena beta zaczęła przeważać w miarę jak domena pasażerska była translokowana przez błonę zewnętrzną i oddzielana od domeny beta w wyniku cięcia proteolitycznego. Próbki naświetlone promieniami UV wykazywały jednak wyraźnie pasma o wyższej masie cząsteczkowej, których nie było w próbkach kontrolnych.Prążki te są wynikiem sieciowania PRO ESPP z białkami oddziałującymi; na podstawie mobilności tych polipeptydów oszacowano wielkości białek oddziałujących, aby sprawdzić, czy mogą one odpowiadać znanym czynnikom montażowym białek błony zewnętrznej. Wykonano dodatkowe immunoprecypitacje z użyciem przeciwciał anty-cera skierowanych przeciwko domniemanym partnerom oddziałującym. Polipeptyd o przybliżonej masie 150 kilodaltonów, który zaobserwowano w przypadku wbudowania BPA zarówno w resztę 1113, jak i 1214, mógł zostać immunoprecypitowany za pomocą antyserum przeciwko periplazmatycznej chaperoninie skip o masie 17 kilodaltonów.Ponadto stwierdzono, że większe polipeptydy, zaobserwowane w przypadku wbudowania BPA tylko w jednej z dwóch pozycji, mogły zostać poddane immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciał przeciwko podjednostkom kompleksu BAM, odpowiednio BAM B i BAM D. Po przeprowadzeniu tej procedury produkty sieciowania można oczyścić, a następnie zastosować inne metody, w tym spektrometrię mas, aby pomóc w identyfikacji czynników oddziałujących z badanym białkiem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak skutecznie połączyć znakowanie metodą „pulse-chase” z miejscowo specyficznym fotosieciowaniem w celu zbadania dynamiki oddziaływań badanego białka z innymi cząsteczkami wewnątrz żywej komórki.

monitoring-assembly-secreted-bacterial-virulence-factor-using-site

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Monitorowanie składania bakteriologicznego czynnika chorobotwórczego przy użyciu specyficznego dla miejsca łączenia krzyżowego

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Opisano podejście biochemiczne do identyfikacji in vivo interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych. Metoda łączy w sobie sieciowanie białek, oczyszczanie powinowactwa i spektrometrię mas i można ją dostosować do prawie każdego typu komórki lub organizmu. Dzięki takiemu podejściu możliwa staje się nawet identyfikacja przejściowych IPP.

Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Translokacja efektorowa do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu III jest powszechną strategią wirulencji wśród bakterii Gram-ujemnych. Zastosowano test oparty na fuzji efektorowej beta-laktamazy do ilościowej analizy translokacji. W komórkach zakażonych Yersinia konwersja reportera FRET przez beta-laktamazę jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Badanie interakcji między patogenami bakteryjnymi a ich gospodarzami jest ważnym obszarem badań biologicznych. W tym miejscu opisujemy niezbędne techniki pomiaru translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania genu siRNA przy użyciu substratu BlaM.

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)...

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Poznaj metodę sieciowania specyficznego dla miejsca z radiomarkowaniem puls-chase do badania dynamicznych interakcji białkowych w żywych komórkach E. coli. Technika ta pozwala monitorować tworzenie się czynników wirulencji bakteryjnych w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Przeglądaj więcej filmów