Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie dynamiki interakcji białek białkowych wewnątrz żywej komórki. Osiąga się to poprzez pierwszą ekspresję interesującego białka w E. coli, włączenie analogu aminokwasu benzoilofenyloalaniny do białka w określonym miejscu i wykonanie znakowania radiowego w pogoni za impulsem w celu oznaczenia niewielkiej populacji synchronicznie zsyntetyzowanych cząsteczek białka. Jako drugi krok.

Podwielokrotności komórek zebranych w różnych punktach czasowych podczas pościgu są napromieniowywane, aby wywołać tworzenie wiązań kowalencyjnych między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a wszelkimi czynnikami, z którymi wchodzi ono w interakcję. Następnie białka są immunoprecypitowane specyficznymi przeciwciałami i rozpuszczane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS w celu zidentyfikowania czynników oddziałujących, uzyskuje się wyniki, które pokazują zmiany w interakcjach między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a innymi czynnikami wewnątrzkomórkowymi w czasie w oparciu o zmiany w ruchliwości elektroforetycznej produktów sieciowania. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak koimmunoprecypitacja lub sieciowanie chemiczne, jest jej zdolność do generowania czasowych informacji o interakcjach, które zachodzą między określoną resztą w białku będącym przedmiotem zainteresowania a innymi cząsteczkami.

Takie dane są szczególnie cenne podczas badania progresji białka przez wieloetapowy szlak składania i identyfikacji produktów pośrednich składania. Chociaż metoda ta została zoptymalizowana do stosowania w E. coli, może być również stosowana w innych systemach, w tym w innych bakteriach, drożdżach i komórkach ssaków. Szczegóły dotyczące przygotowania kultur można znaleźć w protokole tekstowym.

Krótko przygotuj pięć mililitrów pożywki M nine zawierającej 0,2% glicerolu, wszystkie aminokwasy el z wyjątkiem metioniny i cystyny oraz antybiotyków rozpocznij hodowle nocne, dodając E coli przekształcone plazmidem, który koduje interesujące białko z mutacją bursztynową i plazmidem, który koduje bursztynowy system supresyjny, inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W dniu eksperymentu dodać odpowiednią ilość komórek z hodowli nocnej do 250-mililitrowej kolby Erlenmeyera zawierającej 50 mililitrów pożywki M nine i antybiotyków, aby uzyskać gęstość optyczną 0,03 na poziomie 550 nanometrów. Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wstrząsającej łaźni wodnej.

Gdy kultury osiągną wczesną lub środkową fazę logarytmiczną, dodaj 50 mikrolitrów jednego molowca benzoilofenyloalaniny lub BPA do każdej kultury. Dodawaj BPA po jednej kropli na raz, obracając kolbę, aby uniknąć wytrącania się. Następnie dodaj wszelkie induktory, które są potrzebne do napędzania ekspresji bursztynowego mutanta.

Kontynuuj inkubację kultur w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 30 minut podczas 30-minutowego okresu indukcji. Oznacz sześć jednorazowych 15-mililitrowych probówek wirówkowych punktem czasowym i plus UV lub minus UV. Umieść oznaczone probówki na lodzie.

Umieść sześciodołkową płytkę do hodowli tkankowej na drugim wiadrze z lodem wypełnionym lodem. Włącz UV lamp pięć minut przed etykietowaniem radiowym. Następnie dodaj około dwóch mililitrów lodu do każdej probówki oznaczonej minus UV i do dwóch studzienek w płytce wielodołkowej.

Niezbędne jest napowietrzenie lodu bezpośrednio do rur i studzienek, aby natychmiast zatrzymać reakcje wewnątrzkomórkowe w każdym punkcie czasowym, a tym samym uzyskać dokładny obraz szlaku biochemicznego pod koniec 30-minutowego okresu indukcji. Przenieść 25 mililitrów kultury do wstępnie podgrzanej jednorazowej kolby Erlenmeyera o pojemności 125 mililitrów. Umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Etapy etykietowania impulsowego i naświetlania promieniami UV muszą być wykonywane w odpowiednim czasie i wymagają znacznej organizacji oraz zaawansowanego przygotowania. Dodaj 30 mikrokiurów na mililitr metioniny i cysteiny znakowanej S 35 do kultury i szybko zamieszaj, aby wymieszać na czas. Jedna minuta zero sekund.

Dodaj 250 mikrolitrów nieradioaktywnego 100-milimolowego roztworu cysteiny metioniny i szybko zamieszaj. Aby natychmiast wymieszać, odpipetuj cztery mililitry kultury do jednego z dołków schłodzonej płytki wielodołkowej, która zawiera lód, pipetą drugą czteromililitrową porcję do 15-mililitrowej probówki oznaczonej jako zero minut minus UV na raz. Dwie minuty zero sekund.

Odpipetować cztery mililitry kultury do drugiego dołka schłodzonej płytki wielodołkowej, która zawiera lód. Następnie odpipetować kolejną czteromililitrową porcję do 15-mililitrowej probówki oznaczonej jedną minutę minus UV bezpośrednio przed pięciominutowym punktem czasowym przy około dwóch mililitrach lodu do trzeciego dołka w płytce wielodołkowej w czasie sześciu minut zero sekund. Odpipetować cztery mililitry kultury do trzeciego dołka schłodzonej płytki wielodołkowej, która zawiera rurkę lodową.

Miałem kolejną czteromililitrową porcję do 15-mililitrowej probówki oznaczonej pięć minut minus uv. Umieścić pojemnik na lód z płytką wielodołkową pod podgrzaną lampą UV i naświetlać każdą próbkę indywidualnie przez cztery minuty. Przenieś komórki do schłodzonych 15-mililitrowych probówek oznaczonych zero minut plus UV, jedna minuta plus UV i tak dalej.

Następnie odwirować komórki w temperaturze 2 500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zawiesić każdą próbkę w 300 mikrolitrach M 9 pożywki lub PBS i 33 mikrolitrach 100% zimnego kwasu trichlorooctowego lub TCA w celu wytrącenia białek, odwirować osady TCA w mikro fuge z maksymalną prędkością przez 10 minut. Przed usunięciem satu dodać 50 mikrolitrów buforu do rozpuszczania do każdej próbki i podgrzewać z mieszaniem w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby rozpuścić wytrącone białko.

Po dodaniu jednego mililitra testu immunologicznego bufor do testów immunologicznych wykonuje standardowe precypitacje immunologiczne przy użyciu jednej piątej do połowy każdej próbki. Rozpuścić białka wytrącone immunologicznie za pomocą siarczanu ESAL sodu, elektroforezy w żelu poliakrylowym lub strony SDS. Na koniec wystawiono barwione i wysuszone żele na badanie przesiewowe fosfo przez noc i wykryto białka radioaktywne, w tym produkty sieciujące, za pomocą obrazowania fosfonowego Fotosieciowanie specyficzne dla miejsca zastosowano w celu identyfikacji białek, które oddziałują z ESPP podczas jego podróży do błony zewnętrznej.

W tym eksperymencie kodony alaninowe pH w resztach 1113 i 1214 domeny beta ESPP zastąpiono kodonami bursztynowymi. Struktura krystaliczna domeny beta ESPP pokazuje, że obie reszty znajdują się po plazmatycznej stronie beczki beta, oddalone od siebie o około 120 stopni. Dwa różne polipeptydy zostały immuno wytrącone zarówno z komórek napromieniowanych, jak i kontrolnych przez C-końcowy anty ESPP i surowicę.

Początkowo, w późniejszych punktach czasowych dominowała około 135-kilodaltonowa forma prekursorowa białka, która zawiera kowalencyjnie połączone domeny pasażerskie i beta. Poziom PRO ESPP spadł, a wolna domena beta zaczęła dominować, ponieważ domena pasażerska była trans zlokalizowana w poprzek błony zewnętrznej i oddzielona od domeny beta przez rozszczepienie proteolityczne. Próbki promieniujące promieniowaniem UV I miały jednak wyraźnie pasma o większej masie cząsteczkowej, których nie było w próbkach kontrolnych.

Pasma te wynikają z sieciowania PRO ESPP z oddziałującymi białkami w oparciu o ruchliwość tych polipeptydów, oszacowano rozmiary oddziałujących białek, aby sprawdzić, czy mogą one odpowiadać znanym czynnikom składania białek błony zewnętrznej. Przeprowadzono dodatkowe precypitacje immunologiczne za pomocą anty cera wygenerowanych przeciwko domniemanym partnerom oddziałującym. Około 150 kilodaltonowy polipeptyd, który zaobserwowano, gdy BPA został włączony do obu reszt 1113 i 1214, można było immunoprecyzować surowicą przeciwko 17-kilodaltonowemu przeskokowi plazmicznego białka opiekuńczego.

Ponadto stwierdziliśmy, że większe polipeptydy, które zaobserwowano, gdy BPA został włączony tylko w jednej z dwóch pozycji, mogły być immunoprecypitowane anty cera przeciwko podjednostkom kompleksu BAM, odpowiednio BAM B i BAM D. Po wykonaniu tej procedury produkty sieciowania można oczyścić i zastosować inne metody, w tym spektrometrię mas, aby pomóc zidentyfikować czynniki, które oddziałują z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie połączyć znakowanie impulsów z sieciowaniem zdjęć specyficznych dla danego miejsca w celu zbadania dynamiki interakcji białka, które jest przedmiotem zainteresowania, z innymi cząsteczkami wewnątrz żywej komórki.