Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest elektroprzędzenie trójwymiarowego rusztowania fazowego, umożliwiającego współhodowlę w pełni zróżnicowanych dorosłych ludzkich komórek w celu odtworzenia naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej, z którą komórki te stykają się w C two. Jest to realizowane poprzez elektroprzędzenie w pierwszym etapie rusztowania z włókien mikroowych o losowej orientacji. Drugim krokiem jest utworzenie rusztowania dwufazowego poprzez elektroprzędzenie warstwy nanowłókien o losowej orientacji bezpośrednio na rusztowaniu mikrowłóknistym.

Następnie przędzie się elektrostatycznie osobne rusztowanie z uporządkowanych nanowłókien. Ostatnim krokiem jest zasiedlenie każdego rusztowania odpowiednim typem komórek i współhodowla rusztowań w systemie bioreaktora perfuzyjnego jako pojedynczej konstrukcji. Ostatecznie interakcje wielokomórkowe można analizować poprzez pomiar uwalniania mediatorów oraz barwienie immunocytochemiczne.

Konstrukt. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transformowane membrany 2D, jest fakt, że rusztowania elektryczne zapewniają włókniste środowisko 3D, które można dostosować w celu uzyskania morfologii istotnej fizjologicznie. Jest to struktura bardziej porowata, która umożliwia współhodowlę wielu typów komórek.

Metoda ta zapewnia stabilną platformę z wykorzystaniem ludzkich komórek kohortowych, chorych lub zdrowych jako modelu in vitro. Pomoże to zmniejszyć zależność od modeli zwierzęcych, które mają ograniczenia w zakresie reprezentatywności dla ludzkich chorób, oraz ograniczyć liczbę zwierząt wykorzystywanych w eksperymentach. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat takich chorób jak astma i COPD, może być ona również zastosowana w innych układach, na przykład do badania zapalnych chorób jelit lub do opracowania modelu skóry do testów chemicznych.

W pierwszej kolejności należy przygotować trzy różne 10 mililitrowe roztwory PET, rozpuszczając 8%, 10% i 30% PET w mieszaninach chlormetanu i kwasu trichlorooctowego w stosunku jeden do jednego. Roztwory należy mieszać przez noc w temperaturze pokojowej, aby PET rozpuścił się do następnego dnia. Następnie roztwory PET należy przenieść do strzykawek, mocując igłę o rozmiarze 23 G do strzykawki z mieszaniną 8% oraz igły o rozmiarze 18 G do dwóch pozostałych strzykawek zawierających 10% i 30% roztworów PET.

Przygotuj rusztowanie z mikrowłókien. Najpierw umieść strzykawkę zawierającą 30% roztwór PET w pompie strzykawkowej, kierując igłę w dół. Ustaw bęben w odległości 15 centymetrów od końcówki igły i upewnij się, że igła jest skierowana w stronę środka bębna.

Podłącz dodatnią linię zasilania elektrycznego do końcówki igły za pomocą metalowego klipsa typu krokodyl, a następnie uziemij manl, podłączając linię uziemiającą do gniazda bananowego. Włącz silnik i ustaw prędkość manl na 60 RPMs. Włącz pompę strzykawkową, aby zapewnić szybkość przepływu 2.0 milliliters per hour.

Podczas tworzenia rusztowań z mikrowłókien należy pozwolić pompie na pracę do momentu wypłynięcia roztworu z końcówki igły, aby zapowietrzyć system poprzez usunięcie powietrza z igły. Następnie należy zatrzymać pompę strzykawkową.

Ustaw całkowitą objętość wypompowanego roztworu na 2 ml i uruchom pompę. Następnie przyłóż potencjał 14 kV między igłą a mandrelą i prowadź elektroprzędzenie przez jedną godzinę, aż do naniesienia 2 ml 30%PET. Gdy rusztowanie z mikrowłókien znajdzie się na mandrelzie, wyłącz napięcie. Zdejmij zacisk krokodylkowy i zastąp strzykawkę z roztworem 30%PET strzykawką zawierającą roztwór 8%PET.

Następnie ponownie podłącz zacisk krokodylkowy do igły o rozmiarze 23 G. Zmień szybkość przepływu pompy strzykawkowej na 0,5 milliliters per hour i odpowietrz igłę, uruchamiając pompę strzykawkową aż do momentu, gdy roztwór zacznie wypływać z końcówki. Przy mandrelu obracającym się nadal z prędkością 60 RPMs, przyłóż potencjał 14 kilovolt między końcówkę igły a mandrel i ustaw całkowitą objętość do wyciśnięcia przez pompę strzykawkową na dwa milliliters.

Prowadź elektroprzędzenie przez cztery godziny, aż zostanie uprzędzone 2 mL 8% roztworu PET. Po zakończeniu procesu elektroprzędzenia wyłącz zasilacz oraz silnik obracający mandrel. Odetnij dwufazowe rusztowanie za pomocą ostrza wzdłuż szerokości mandrela, aby uzyskać 2D arkusz rusztowania o powierzchni odpowiadającej powierzchni mandrela.

Aby przygotować wyrównane rusztowania z PET, należy umieścić strzykawkę zawierającą 10% roztwór PET w pompie strzykawkowej, kierując igłę w dół. Następnie należy podłączyć zacisk krokodylka do igły. Ustawić prędkość przepływu na 0,5 milliliters per hour i przepuścić roztwór PET przez igłę w celu jej odpowietrzenia.

Następnie włącz silnik i ustaw prędkość obrotową trzpienia na 2000 RPMs. Następnie włącz pompę strzykawkową. Ustaw napięcie zasilania na 14 kilovolts i włącz zasilacz, aby prowadzić elektroprzędzenie przez cztery godziny, aż do momentu elektroprzędzenia dwóch mililitrów roztworu.

Po zakończeniu procesu elektroprzędzenia wyłącz zasilacz oraz silnik. Odetnij rusztowanie ostrzem wzdłuż szerokości trzpienia, aby uzyskać wyrównaną dwuwymiarową arkusz rusztowania. Przechowuj elektroprzędzone rusztowania w folii aluminiowej, aby zmniejszyć ładunek elektrostatyczny.

Za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 0,8 mm wyciąć dyski z dwufazowych lub wyrównanych rusztowań z arkuszy SPU. Następnie przykleić dysk dwufazowego rusztowania do uszczelki, używając nietoksycznego kleju akwarystycznego. Umieścić uszczelki i rusztowania w 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.

Sterylizować uszczelki i rusztowania promieniowaniem ultrafioletowym typu I przez 30 minut z każdej strony rusztowań. Następnie namoczyć je przez noc w 20% roztworze antybiotyków i przeciwgrzybiczych w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyć rusztowania PBS trzy razy i przechowywać je w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia.

Przenieś rusztowania dwufazowe z PBS do nowej płytki 12-dołkowej i inkubuj je w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FCS przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń uzupełnioną pożywkę DMEM i na fazę mikrowłóknistą rusztowań nanieś 15 000 komórek fibroblastów MRC-5 w 30 µL uzupełnionej pożywki DMEM, aby wspomóc penetrację fibroblastów do wnętrza rusztowania. Umieść płytkę na wstrząsarce orbitalnej i agituj rusztowania z prędkością 100 RPM przez dwie godziny.

Następnie do każdego rusztowania dodaje się 2 mL pożywki DMEM z dodatkami i inkubuje rusztowania przez noc w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Następnego dnia usuwa się pożywkę z dołków i odwraca rusztowania tak, aby faza nanowłóknista była skierowana apikalnie. Następnie na fazę nanowłóknistą rusztowania wysiewa się 30 000 komórek nabłonkowych Cali 3 w 30 µL pożywki DMEM/F12 uzupełnionej o 10% FCS.

Inkubuj rusztowanie przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla, a następnie zanurz rusztowania w mieszaninie D-M-E-M-F 12 i DMEM w proporcji 70:30 z dodatkami i kontynuuj inkubację statyczną przez kolejne 12 godzin w celu hodowli komórek mięśni gładkich dróg oddechowych. W pierwszej kolejności przenieś uporządkowane rusztowania z PBS do nowej płytki 12-dołkowej i podgrzewaj je wraz z DMEM z dodatkami przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Usuń DMEM z dodatkami i dodaj 25 000 komórek mięśni gładkich dróg oddechowych w 30 µL DMEM z dodatkami do każdego rusztowania, a następnie inkubuj je przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.

Po przytwierdzeniu zanurz rusztowania w pożywce DMEM z dodatkami. Umieść je z powrotem w inkubatorze i pozostaw na noc przed przygotowaniem trikultury w bioreaktorze. Następnego dnia umieść dwufazowe zasiane rusztowanie w komorze bioreaktora, tak aby faza nabłonkowa była skierowana w górę komory.

Następnie umieść wyrównany rusztowanie pod rusztowaniem dwufazowym w taki sposób, aby znajdowało się ono w sąsiedztwie fazy mikrowłóknistej rusztowania dwufazowego. Zablokuj dwie komory bioreaktora. Następnie złóż dwa obwody przepływu perfuzyjnego wewnątrz inkubatora zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym i po tygodniu pompuj pożywkę w obu obwodach z prędkością około 0,1 mililitrów na minutę, używając pompy perystaltycznej.

Usuń medium z komory apikalnej i z hodowli. Komórki nabłonkowe pozostaw na granicy faz powietrze-ciecz na dodatkowy tydzień przed analizą; po dwóch tygodniach w bioreaktorze rusztowanie trójkulturowe pokazane tutaj zostało utrwalone i przekrojone, aby ukazać jądra komórkowe rozmieszczone we wszystkich trzech warstwach konstruktu; jądra komórkowe barwiono DPI i są one widoczne na niebiesko, podczas gdy materiał rusztowania ma kolor szary. Poniżej znajdują się obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla nanowłókien elektroprząśniętych, mikrowłókien oraz rusztowań wyrównanych, które przygotowano odpowiednio do zasiewu komórek nabłonkowych, fibroblastów i komórek mięśni gładkich.

Wszystkie trzy typy komórek wykazały zwiększenie żywotności podczas hodowli na ich indywidualnych rusztowaniach w okresie dwóch tygodni. Każdy z nich nadal exprimował białka specyficzne dla danego typu komórek po dwutygodniowym okresie hodowli. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zbadaniu rodzimej macierzy zewnątrzkomórkowej, którą stara się odtworzyć za pomocą włókien elektroprzędzionych.

Komórki zachowują się inaczej podczas przytwierdzania do różnych topografii 3D. Na przykład komórki nabłonkowe utworzą funkcjonalną barierę tylko wtedy, gdy będą hodowane na nanowłóknach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat budowy wielowarstwowego systemu kokultury, który może być wykorzystany do badania oddziaływań międzykomórkowych w dynamicznym środowisku hodowlanym.

Należy pamiętać, że ważne jest dostosowanie parametrów elektroprzędzenia, takich jak szybkość przepływu i napięcie, do polimeru oraz układu rozpuszczalników, których zamierzacie użyć podczas wykonywania tej procedury. Jest to kluczowe dla uzyskania pożądanych włókien. Ponadto należy pamiętać o przeprowadzaniu elektroprzędzenia w dygestorium lub wentylowanej szafie, aby umożliwić prawidłowe odsysanie rozpuszczalników.