Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest elektrowirowanie trójwymiarowego rusztowania fazowego, co pozwala na kokulturację w pełni zróżnicowanych dorosłych komórek ludzkich w celu replikacji naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej, którą te komórki napotykają w C dwa. Osiąga się to poprzez pierwsze elektroprzędzenie, losowo ułożone rusztowanie z mikrofibry. Drugim krokiem jest uformowanie dwufazowego rusztowania poprzez elektroprzędzenie losowo wyrównanej warstwy nanowłókien bezpośrednio na rusztowanie z mikrofibry.

Następnie oddzielne wyrównane rusztowanie z nanowłókien jest przędzone elektro. Ostatnim krokiem jest obsianie każdego rusztowania odpowiednim typem komórek i wspólna hodowla rusztowań w obfitym systemie bioreaktorów jako pojedynczy konstrukt. Ostatecznie interakcje wielokomórkowe można analizować poprzez pomiar uwalniania mediatorów i barwienia immunologicznego.

Konstrukt. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak membrany transformowane 2D, jest to, że rusztowania elektryczne zapewniają włókniste środowisko 3D, które można dostosować w celu zapewnienia fizjologicznie istotnej morfologii. Jest to bardziej porowata struktura i pozwala na hodowlę rdzeniową wielu typów komórek.

Metoda ta zapewnia stabilną platformę wykorzystującą kohortowe, chore lub zdrowe komórki ludzkie jako model in vitro. Pomoże to zmniejszyć naszą zależność od modeli zwierzęcych, które mają ograniczone znaczenie dla chorób u ludzi, oraz zmniejszy liczbę zwierząt wykorzystywanych w eksperymentach. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w choroby takie jak astma i POChP, może być również stosowana w innych systemach, takich jak badanie chorób zapalnych jelit lub opracowanie modelu skóry do testów chemicznych.

Na początek przygotuj trzy różne 10-mililitrowe roztwory PET, rozpuszczając 8%10% i 30% PET w mieszaninach jeden do jednego chlorometanu i kwasu trójchlorooctowego. Mieszaj roztwory przez noc w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić PET następnego dnia. Przenieść roztwory PET do strzykawek i przymocować igłę o rozmiarze 23 do strzykawki zawierającej 8% mieszaninę, a igły o rozmiarze 18 do pozostałych dwóch strzykawek zawierających 10% i 30% roztwory PET.

Przygotuj rusztowanie z mikrofibry. Najpierw załaduj strzykawkę zawierającą 30% roztwór PET do pompy strzykawkowej z końcówką igły na dole. Umieść manl 15 centymetrów od końcówki igły i upewnij się, że igła jest skierowana na środek bębna.

Podłącz dodatni przewód zasilania elektrycznego do końcówki igły za pomocą metalowego zacisku krokodylkowego i uziemij manl, podłączając przewód uziemiający do gniazda bananowego. Włącz silnik i ustaw prędkość obrotową na 60 obr./min. Włącz pompę strzykawkową, aby zapewnić natężenie przepływu 2,0 mililitra na godzinę.

Podczas tworzenia rusztowań z mikrofibry. Pozwól pompie pracować, aż roztwór zostanie wyciśnięty z końcówki igły, aby zalać system poprzez usunięcie powietrza z igły. Następnie zatrzymać pompę na pompie strzykawkowej.

Ustaw całkowitą objętość roztworu do wydalenia na dwa mililitry i uruchom pompę. Następnie przyłóż potencjał 14 kilowoltów między igłą a trzpieniem elektrowirowania przez jedną godzinę, aż dwa mililitry 30% roztworu PET zostaną elektroprzędzone z rusztowaniem z mikrofibry nadal na trzpieniu, wyłączając potencjał napięcia. Zdjąć zacisk krokodylkowy i zastąpić strzykawkę zawierającą 30% roztwór PET strzykawką zawierającą 8% roztwór PET.

Następnie ponownie podłącz zacisk krokodylkowy do igły o rozmiarze 23. Zmień natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,5 mililitra na godzinę i zalej igłę, uruchamiając pompę strzykawkową, aż roztwór wypłynie z końcówki. Gdy trzpień nadal obraca się z prędkością 60 obr./min, zastosuj potencjał 14 kilowoltów między końcówką igły a trzpieniem i ustaw całkowitą objętość do wytłoczenia przez pompę strzykawkową na dwa mililitry.

Wiruj elektrycznie przez cztery godziny, aż dwa mililitry 8% roztworu PET zostaną elektro odwirowane. Po zakończeniu wirowania elektrycznego wyłącz zasilanie i silnik obracający trzpień. Przetnij rusztowanie dwufazowe ostrzem wzdłuż szerokości trzpienia, aby uzyskać arkusz rusztowania 2D o rozmiarze powierzchni trzpienia.

Aby przygotować wyrównane rusztowania PET, załaduj strzykawkę zawierającą 10% roztwór PET do pompy strzykawkowej tak, aby końcówka igły znajdowała się na dole. Następnie podłącz zacisk krokodylkowy do igły. Ustaw natężenie przepływu na 0,5 mililitra na godzinę i zalej igłę roztworem PET.

Następnie włącz silnik i ustaw prędkość wirowania trzpienia na 2000 obr./min. Następnie włączyć pompę strzykawkową. Ustaw napięcie zasilania na 14 kilowoltów i włącz zasilanie elektrowirowanie na cztery godziny, aż dwa mililitry roztworu zostaną elektro odwirowane.

Po zakończeniu wirowania elektrycznego wyłącz zasilanie i silnik. Wytnij rusztowanie ostrzem wzdłuż szerokości trzpienia, aby uzyskać wyrównany arkusz rusztowania 2D. Przechowuj rusztowania elektro w folii aluminiowej, aby zmniejszyć ładunek elektrostatyczny.

Użyj pisaka do biopsji o średnicy 0,8 milimetra, aby wyciąć krążki dwufazowych lub wyrównanych rusztowań z arkuszy SPU. Następnie przyklej dwufazową tarczę rusztowania do uszczelki za pomocą nietoksycznego kleju akwariowego. Umieść uszczelki i rusztowania w 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.

Sterylizuj uszczelki i rusztowania za pomocą promieniowania ultrafioletowego I przez 30 minut z każdej strony rusztowań. Następnie następnego dnia zanurz się w 20% roztworze antybiotykowym przeciwgrzybiczym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rusztowania należy myć kilkakrotnie preparatem PP S3 i przechowywać rusztowania w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu ich użycia.

Przenieś dwufazowe rusztowania z PBS na świeżą płytkę 12-dołkową i podgrzej je w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FCS przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń pożywkę uzupełnioną DMEM i umieść fazę mikrofibry rusztowań, aplikuj nasiona 15 000 komórek MRC pięciu fibroblastów w 30 mikrolitrach pożywki uzupełnionej DMEM na każdym rusztowaniu, aby pomóc fibroblastom wniknąć do rusztowania. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej i mieszaj rusztowania z prędkością 100 obr./min przez dwie godziny.

Następnie dodaj dwa mililitry pożywki z dodatkiem DMEM do każdego rusztowania i inkubuj rusztowania przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia usuń pożywkę ze studzienek i odwróć rusztowania tak, aby faza nanowłókien rusztowań była skierowana wierzchołkowo. Następnie wysiewaj 30 000 Cali trzy komórki nabłonkowe w 30 mikrolitrach pożywki D-M-E-M-F 12 uzupełnionej 10% FCS na fazę nanowłókien rusztowania.

Inkubować rusztowanie przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, a następnie zanurzyć rusztowania w mieszaninie 70 30 D-M-E-M-F 12 i pożywki uzupełnionej DMEM i kontynuować inkubację statyczną przez dodatkowe 12 godzin w celu hodowli dróg oddechowych. Komórki mięśni gładkich po pierwsze, przenieś wyrównane rusztowania z PBS na świeżą 12-dołkową płytkę i ogrzej je, a następnie pożywkę uzupełnianą DMEM przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń pożywkę z dodatkiem DMEM i dodaj 25 000 komórek mięśni gładkich dróg oddechowych w 30 mikrolitrach pożywki z dodatkiem DMEM do każdego rusztowania i inkubuj je przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po przymocowaniu zanurz rusztowania w pożywkach uzupełnionych DMEM. Włóż je z powrotem do inkubatora i pozostaw na noc przed założeniem hodowli tri w bioreaktorze. Następnego dnia umieść dwufazowe rusztowanie nasienne w komorze bioreaktora z fazą nabłonkową skierowaną do góry do komory.

Następnie umieść wyrównane rusztowanie pod rusztowaniem dwufazowym tak, aby przylegało do fazy mikrofibry rusztowania dwufazowego. Zamknij ze sobą dwie komory bioreaktora. Następnie zmontuj dwa obwody przepływu perfuzyjnego w inkubatorze, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym i po tygodniu pompuj media wokół dwóch obwodów z prędkością około 0,1 mililitra na minutę za pomocą pompy perystaltycznej.

Usuń pożywkę z komory wierzchołkowej i hodowli. Komórki nabłonkowe na granicy faz powietrza i cieczy przez dodatkowy tydzień przed analizą po dwóch tygodniach w bioreaktorze, pokazane tutaj rusztowanie tri culture zostało zamocowane i podzielone na sekcje, aby pokazać, że jądra komórkowe rozmieszczone we wszystkich trzech warstwach konstruktu jądra komórkowe zostały wybarwione DPI i wydają się niebieskie, podczas gdy materiał rusztowania wydaje się szary. Oto obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego mikrofibry z nanowłókien przędzonych elektronami i wyrównanych rusztowań, które zostały przygotowane do wysiewu odpowiednio komórek nabłonka, fibroblastów i komórek mięśni gładkich.

Wszystkie trzy typy komórek wykazały wzrost żywotności, gdy były hodowane na indywidualnych rusztowaniach przez okres dwóch tygodni. Każdy z nich kontynuował również ekspresję białek specyficznych dla typu komórki po dwutygodniowym okresie hodowli. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o zbadaniu natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej, którą próbujesz odtworzyć za pomocą włókien elektro.

Komórki A będą zachowywać się inaczej podczas dołączania do różnych topografii 3D. Na przykład komórki nabłonkowe będą tworzyć funkcjonalną barierę tylko wtedy, gdy będą hodowane na nanowłóknach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbudować wielowarstwowy system współhodowli, który można wykorzystać do badania interakcji międzykomórkowych w dynamicznym środowisku hodowli.

Nie zapominaj, że ważne jest, aby dostosować parametry wirowania elektrycznego, takie jak natężenie przepływu i napięcie, do systemu polimerów i rozpuszczalników, którego zamierzasz użyć podczas wykonywania tej procedury. Ma to kluczowe znaczenie dla wytworzenia pożądanych włókien. Ponadto należy pamiętać, aby zdecydować się na wirowanie wentylowanego okapu lub szafki, aby umożliwić prawidłowe wydobycie rozpuszczalników.