Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego
September 7th, 2018
Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.
Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie w dziedzinie inżynierii komórek macierzystych, takie jak to, w jaki sposób mikrośrodowisko komórkowe zmienia fenotypy i funkcje komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wiele sztucznie stworzonych środowisk dla komórek na jednej płytce, czego nie można było wykonać konwencjonalną metodą na płytce mikrokontaktowej, demonstrując tę procedurę będą technikami Koki Yoshimoto i Risako Sakai z naszego laboratorium. Po stworzeniu obrazów 3D masek dla matryc nano fiber i form ze struktur mikroprzepływowych zgodnie z protokołem tekstowym.
Użyj drukarki 3D, aby wydrukować maski i formę. Aby przygotować roztwory polimerowe do wirowania elektrycznego, rozcieńczyć 13 procent cieczy PMGI z tetrahydrofuranem do dziewięciu procent. Rozpuść 0,08 grama PS w stosunku objętościowym THF do dimetyloformamidu jeden do jednego i użyj płynnego regentu, aby doprowadzić objętość do końcowego jednego mililitra ośmioprocentowego roztworu PS na objętość.
Rozpuścić 0,1 grama GT w wodzie, kwasie kwaśnym i octanie etylu i użyć zmieszanego roztworu rozpuszczalnika, aby zwiększyć objętość do końcowego jednego mililitra 10% wagowo roztworu GT. Następnie, za pomocą rozpylarki magnetronowej, nałóż warstwę platyny o grubości pięciu nanometrów na polistyrenową płytę bazową, która służy jako katoda w układzie do przędzenia elektrycznego. Załaduj każdy roztwór polimeru do pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23.
Następnie zakotwiczyć strzykawki na pompie strzykawkowej w odległości 12 centymetrów od kolektora urządzenia do elektroprzędzenia. Podłączyć igłę strzykawki do źródła zasilania o wysokim napięciu i ustawić ją na 11 kilowoltów. Następnie ustaw szybkość pompowania na 20 mililitrów na godzinę i utrzymuj temperaturę i wilgotność odpowiednio na poziomie 30 stopni Celsjusza i mniej niż 30 procent objętości.
Teraz połóż maskę na płycie podstawy. Następnie przez otwory maski wytwórz nanowłókna na płycie podstawy o wyraźnej gęstości, zmieniając czas wirowania elektrycznego. Zdejmij maskę z płyty podstawy i powtórz wytwarzanie nanowłókien
.Gdy matryca jest gotowa, umieść ją w eksykatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 16 godzin, aby odparować pozostały rozpuszczalnik. Aby usieciować nanowłókna GT, potraktuj je 0,2 molowym EDC i 0,2 molowym NHS w etanolu. I inkubować próbki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez cztery godziny.
Aby wypłukać nanowłókna GT, użyj dwukrotnie 99,5 procent etanolu i wysusz próżniowo płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Aby wytworzyć struktury mikroprzepływowe, wymieszaj 2 gramy utwardzacza PDMS i 20 gramów zasady PDMS. Następnie wlej mieszaninę pre-PDMS do wyprodukowanej formy.
W eksykatorze odgazowuje się mieszaninę wstępnego PDMS przez 30 minut. Następnie utwardź mieszaninę pre PDMS w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Aby zmontować macierze Macme, oderwij utwardzoną strukturę PDMS od formy i użyj 70 procent etanolu do jej oczyszczenia.
Następnie wyładowujemy koronę atmosferyczną na spodniej stronie struktury PDMS. Szybko zmontuj strukturę PDMS za pomocą macierzy nanowłókien. Następnie piecz zestaw w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwa dni.
Za pomocą DPBS umyć H9HESC hodowane na 35 milimetrowym naczyniu. Następnie dodaj 0,5 mililitra rekombinowanej proteazy świetlnej trypsyny do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez minutę. Ostrożnie zassać mieszaninę proteazy supernatantu.
Natychmiast dodaj pożywkę HPSC i delikatnie dozuj pożywkę do powierzchni naczynia, aby zdysocjować komórki. Następnie przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwiruj probówkę 200 razy grawitacyjnie przez trzy minuty.
Odessać supernatant i zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym pożywce HPSC. Następnie odpipetować 12 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej komory mikroprzepływowej. Po fluorescencyjnym znakowaniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, oderwij strukturę mikroprzepływową PDMS od macierzy Macme.
Następnie usuń resztki PBMS z macierzy Macme, dodaj 90 procent glicerolu z PBS do wybarwionych komórek i nałóż szkiełko nakrywkowe. Na koniec ustaw płytkę do góry nogami na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Korzystaj z oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, aby uzyskać 12-bitowe kolorowe obrazy.
Pokazano tutaj obrazy immunofluorescencyjne H9HPSC hodowane przy wysokiej początkowej gęstości wysiewu na nanowłóknach żelatynowych i barwione 3 komórkowymi markerami fenotypowymi. Analizę SOM wykorzystano do przekształcenia wielowymiarowych zestawów danych wieloparametrycznych w niskowymiarowe mapy 2D w celu porównania jednorodności i heterogeniczności poziomów ekspresji dla czterech markerów fenotypowych w każdym zestawie danych, a dla węzłów SOM przeprowadzono nienadzorowane grupowanie hierarchiczne. Jak wskazano tutaj, wszystkie grupy wykazywały wyższą ekspresję OCT4 niż obserwowano na matrycy żelowej błony podstawnej lub MG. Grupa pierwsza wykazywała wysokie sygnały EdU, co wskazuje, że większość komórek aktywnie się proliferowała.
W związku z tym mikrośrodowiska w grupie pierwszej nadawały się do utrzymania HPSC, ponieważ niezróżnicowane HPSC rozprzestrzeniają się szybko, gdy fazy przerwy w cyklu komórkowym są skrócone. Grupa druga obejmowała komórki wysiane przy niewystarczającej gęstości początkowej oraz komórki wyhodowane na rusztowaniach 2D GT, które nie wspierały samoodnawiania HPSC. Na przykład sygnał EdU tej próbki został utracony, a poziom aneksyny V nieznacznie wzrósł, co wskazuje, że komórki utraciły swoją macierzystość i stopniowo stawały się apoptotyczne.
PMGI MidNF HighCD z grupy trzeciej, która reprezentuje mikrośrodowiska składające się z matryc nanowłókien PMGI, wykazała większe różnice w sygnałach OCT4 i EdU w porównaniu z innymi warunkami. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie komórek STEM do zbadania inżynierii tkankowej i zaawansowanych badań przesiewowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodologię przygotowywania tablicy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME), umożliwiającą manipulację środowiskami komórkowymi o wysokiej wydajności. To podejście ma na celu zidentyfikowanie optymalnych warunków dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) poprzez pojedyncze profilowanie komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria komórek macierzystych
- Środowiska komórkowe
- Techniki o wysokiej wydajności
Tło
- Rozumienie, w jaki sposób środowiska komórkowe wpływają na fenotypy i funkcje komórek, jest kluczowe.
- Konwencjonalne metody ograniczają możliwość tworzenia wielu środowisk jednocześnie.
- Tablica MACME oferuje rozwiązanie tego ograniczenia.
- Ta technika została opracowana przez Koki Yoshimoto i Risako Sakai.
Cel badania
- Zbadać wpływ sztucznych środowisk na hPSC.
- Zgłębić zrozumienie zachowania komórek macierzystych w różnych warunkach.
- Ułatwić pojedyncze profilowanie komórek w sposób o wysokiej wydajności.
Stosowane metody
- Tworzenie 3D obrazów masek dla tablic nanowłókien i form z mikropłytek.
- Wykorzystanie drukarki 3D do produkcji masek i form.
- Przygotowanie roztworów polimerów do elektrowrzecia.
- Rozcieńczanie i rozpuszczanie określonych polimerów w celu osiągnięcia pożądanych stężeń.
Główne wyniki
- Tablica MACME pozwala na jednoczesne testowanie wielu środowisk.
- Wykazane zalety w porównaniu z konwencjonalnymi metodami mikrokontaktowymi.
- Ułatwia badania reakcji hPSC na różne fizyczne i chemiczne wskazówki.
- Zapewnia wgląd w optymalizację warunków dla zastosowań komórek macierzystych.
Wnioski
- Tablica MACME jest cennym narzędziem w badaniach nad komórkami macierzystymi.
- Umożliwia analizę o wysokiej wydajności środowisk komórkowych.
- Ta metoda może znacząco rozwinąć dziedzinę inżynierii komórek macierzystych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The MACME array addresses a critical gap in stem cell engineering by enabling simultaneous testing of multiple microenvironmental conditions on human pluripotent stem cells. This high-throughput capability supports predictive confidence in target validation and phenotypic screening by de-risking mechanistic ambiguity in early discovery. The platform enhances translational continuity from discovery through preclinical workflows by providing reproducible, quantitative single-cell data for go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking distinct microenvironmental cues to stem cell phenotypes such as self-renewal and proliferation.
- Operational Value: Enables biological de-risking through functional validation of nanotopographical and biochemical matrices in a multiplexed format.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying microenvironmental conditions that maintain OCT4 expression and reduce apoptotic markers like annexin V.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by standardizing stem cell culture across varied nanofiber densities and microfluidic chambers.
- Operational Value: Addresses assay reproducibility through controlled electrospinning parameters and cross-linking protocols that minimize batch-to-batch variability.
- Scalability: Highlights screening readiness via integration with high-content imaging and SOM analysis for unsupervised clustering of multiparametric phenotypic data.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by demonstrating how microenvironmental screening informs stem cell self-renewal pathways applicable to regenerative medicine.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling risk-adjusted advancement decisions based on EdU incorporation and OCT4 expression thresholds.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by using hierarchical clustering of SOM nodes to distinguish permissive versus non-permissive microenvironments for stem cell maintenance.
Pipeline & Workflow Integration
The MACME array fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing quantitative, single-cell resolution of stem cell responses to microenvironmental variables.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by isolating independent variables such as nanofiber composition and density to clarify pathway regulation in hPSCs.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible fabrication of microfluidic chambers and nanofiber arrays that enable reliable compound evaluation in multiplexed formats.
- Analytics: Highlights measurements such as OCT4, EdU, and annexin V fluorescence intensity as quantitative readouts that help teams compare conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking microenvironmental optimization to stem cell behavior predictive of tissue engraftment and differentiation potential.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique due to its modular design and compatibility with standard fluorescence microscopy and image analysis pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in stem cell fate determination.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of microenvironmental arrays for high-throughput phenotypic screening.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in regenerative medicine programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative thresholds of pluripotency and proliferation markers.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in electrospinning, microfluidics, and fluorescence microscopy for nanofiber array fabrication and single-cell analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including a 3D printer, magnetron sputterer, electrospinning setup, and inverted fluorescence microscope with 12-bit image acquisition.
- Cross-team standardization requirements between fabrication, cell culture, and imaging teams to ensure consistent microenvironmental conditions across replicates.
- Adaptation considerations across model systems such as adjusting polymer concentrations and cross-linking times for different stem cell lineages or differentiated progeny.
- Practical limitations supported by source material including the need for precise environmental control during electrospinning (30°C, <30% humidity) and thorough solvent evaporation to prevent cytotoxicity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:38
Nanofiber Array Preparation
3:06
Fabrication of Microfluidic Structures and Assembly of MACME Arrays
3:57
Loading hESCs into MACME Array and Image Acquisition
5:23
Results: Analysis of Multiplexed Artificial Cellular Microenvironments for Human Pluripotent Stem Cells
7:01
Conclusion
