Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie w dziedzinie inżynierii komórek macierzystych, takie jak to, w jaki sposób mikrośrodowisko komórkowe zmienia fenotypy i funkcje komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wiele sztucznie stworzonych środowisk dla komórek na jednej płytce, czego nie można było wykonać konwencjonalną metodą na płytce mikrokontaktowej, demonstrując tę procedurę będą technikami Koki Yoshimoto i Risako Sakai z naszego laboratorium. Po stworzeniu obrazów 3D masek dla matryc nano fiber i form ze struktur mikroprzepływowych zgodnie z protokołem tekstowym.

Użyj drukarki 3D, aby wydrukować maski i formę. Aby przygotować roztwory polimerowe do wirowania elektrycznego, rozcieńczyć 13 procent cieczy PMGI z tetrahydrofuranem do dziewięciu procent. Rozpuść 0,08 grama PS w stosunku objętościowym THF do dimetyloformamidu jeden do jednego i użyj płynnego regentu, aby doprowadzić objętość do końcowego jednego mililitra ośmioprocentowego roztworu PS na objętość.

Rozpuścić 0,1 grama GT w wodzie, kwasie kwaśnym i octanie etylu i użyć zmieszanego roztworu rozpuszczalnika, aby zwiększyć objętość do końcowego jednego mililitra 10% wagowo roztworu GT. Następnie, za pomocą rozpylarki magnetronowej, nałóż warstwę platyny o grubości pięciu nanometrów na polistyrenową płytę bazową, która służy jako katoda w układzie do przędzenia elektrycznego. Załaduj każdy roztwór polimeru do pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23.

Następnie zakotwiczyć strzykawki na pompie strzykawkowej w odległości 12 centymetrów od kolektora urządzenia do elektroprzędzenia. Podłączyć igłę strzykawki do źródła zasilania o wysokim napięciu i ustawić ją na 11 kilowoltów. Następnie ustaw szybkość pompowania na 20 mililitrów na godzinę i utrzymuj temperaturę i wilgotność odpowiednio na poziomie 30 stopni Celsjusza i mniej niż 30 procent objętości.

Teraz połóż maskę na płycie podstawy. Następnie przez otwory maski wytwórz nanowłókna na płycie podstawy o wyraźnej gęstości, zmieniając czas wirowania elektrycznego. Zdejmij maskę z płyty podstawy i powtórz wytwarzanie nanowłókien

Gdy matryca jest gotowa, umieść ją w eksykatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 16 godzin, aby odparować pozostały rozpuszczalnik. Aby usieciować nanowłókna GT, potraktuj je 0,2 molowym EDC i 0,2 molowym NHS w etanolu. I inkubować próbki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Aby wypłukać nanowłókna GT, użyj dwukrotnie 99,5 procent etanolu i wysusz próżniowo płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Aby wytworzyć struktury mikroprzepływowe, wymieszaj 2 gramy utwardzacza PDMS i 20 gramów zasady PDMS. Następnie wlej mieszaninę pre-PDMS do wyprodukowanej formy.

W eksykatorze odgazowuje się mieszaninę wstępnego PDMS przez 30 minut. Następnie utwardź mieszaninę pre PDMS w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Aby zmontować macierze Macme, oderwij utwardzoną strukturę PDMS od formy i użyj 70 procent etanolu do jej oczyszczenia.

Następnie wyładowujemy koronę atmosferyczną na spodniej stronie struktury PDMS. Szybko zmontuj strukturę PDMS za pomocą macierzy nanowłókien. Następnie piecz zestaw w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwa dni.

Za pomocą DPBS umyć H9HESC hodowane na 35 milimetrowym naczyniu. Następnie dodaj 0,5 mililitra rekombinowanej proteazy świetlnej trypsyny do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez minutę. Ostrożnie zassać mieszaninę proteazy supernatantu.

Natychmiast dodaj pożywkę HPSC i delikatnie dozuj pożywkę do powierzchni naczynia, aby zdysocjować komórki. Następnie przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwiruj probówkę 200 razy grawitacyjnie przez trzy minuty.

Odessać supernatant i zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym pożywce HPSC. Następnie odpipetować 12 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej komory mikroprzepływowej. Po fluorescencyjnym znakowaniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, oderwij strukturę mikroprzepływową PDMS od macierzy Macme.

Następnie usuń resztki PBMS z macierzy Macme, dodaj 90 procent glicerolu z PBS do wybarwionych komórek i nałóż szkiełko nakrywkowe. Na koniec ustaw płytkę do góry nogami na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Korzystaj z oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, aby uzyskać 12-bitowe kolorowe obrazy.

Pokazano tutaj obrazy immunofluorescencyjne H9HPSC hodowane przy wysokiej początkowej gęstości wysiewu na nanowłóknach żelatynowych i barwione 3 komórkowymi markerami fenotypowymi. Analizę SOM wykorzystano do przekształcenia wielowymiarowych zestawów danych wieloparametrycznych w niskowymiarowe mapy 2D w celu porównania jednorodności i heterogeniczności poziomów ekspresji dla czterech markerów fenotypowych w każdym zestawie danych, a dla węzłów SOM przeprowadzono nienadzorowane grupowanie hierarchiczne. Jak wskazano tutaj, wszystkie grupy wykazywały wyższą ekspresję OCT4 niż obserwowano na matrycy żelowej błony podstawnej lub MG. Grupa pierwsza wykazywała wysokie sygnały EdU, co wskazuje, że większość komórek aktywnie się proliferowała.

W związku z tym mikrośrodowiska w grupie pierwszej nadawały się do utrzymania HPSC, ponieważ niezróżnicowane HPSC rozprzestrzeniają się szybko, gdy fazy przerwy w cyklu komórkowym są skrócone. Grupa druga obejmowała komórki wysiane przy niewystarczającej gęstości początkowej oraz komórki wyhodowane na rusztowaniach 2D GT, które nie wspierały samoodnawiania HPSC. Na przykład sygnał EdU tej próbki został utracony, a poziom aneksyny V nieznacznie wzrósł, co wskazuje, że komórki utraciły swoją macierzystość i stopniowo stawały się apoptotyczne.

PMGI MidNF HighCD z grupy trzeciej, która reprezentuje mikrośrodowiska składające się z matryc nanowłókien PMGI, wykazała większe różnice w sygnałach OCT4 i EdU w porównaniu z innymi warunkami. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie komórek STEM do zbadania inżynierii tkankowej i zaawansowanych badań przesiewowych.