Name: Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę MACME do wytwarzania multipleksowanych sztucznych mikrośrodowisk komórkowych dla badań nad ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Technika ta umożliwia analizę wysokoprzepustową i optymalizację warunków hodowli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Prof. N. Nakatsuji z iCeMS, Uniwersytet w Kioto, za dostarczenie ludzkich komórek ES. Dziękujemy również prof. A. Maruyamie z Tokyo Institute of Technology za wsparcie w wykorzystaniu mikroskopu sił atomowych. Fundusze zostały hojnie zapewnione przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 i 24656502); Finansowanie zostało również zapewnione przez Organizację Rozwoju Nowej Energii i Technologii Przemysłowych (NEDO) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Terumo. WPI-iCeMS jest wspierany przez World Premier International Research Centre Initiative (WPI), Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT), Japonia. Część tych prac była wspierana przez Kyoto University Nanotechnology Hub oraz AIST Nano-Processing Facility w ramach projektu "Nanotechnology Platform Project" sponsorowanego przez MEXT z Japonii.

1. Produkcja tablicy MACME
Uwaga: Wszystkie materiały i wyposażenie są wymienione w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Przygotowanie masek do układu z nanowłókien i formy do struktury mikroprzepływowej
	<ol>
		<li>Twórz trójwymiarowe (3D) obrazy masek używanych do układów nanowłókien i form do struktur mikroprzepływowych za pomocą pakietów oprogramowania do grafiki komputerowej 3D (Tabela 1). 
		nuta: Obrazy 3D są odczytywane i drukowane przez drukarkę 3D. Wydrukowane maski i forma mają te same wymiary z obrazami 3D zdefiniowanymi za pomocą oprogramowania graficznego w kroku 1.1.1.</li>
		<li>Wydrukuj maski i formę na podstawie tych projektów za pomocą drukarki 3D. 
		nuta: W tym protokole użyto drukarki 3D przypominającej atrament z żywicą utwardzaną promieniami UV30. Rozdzielczość drukarki wynosiła 635 × 400 dpi i 15 μm odpowiednio w X, Y i Z, jednak rzeczywista rozdzielczość X, Y była około czterokrotnie niższa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie macierzy nanowłókien (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwory polimerowe do elektroprzędzenia.
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć 13% płyn PMGI z tetrahydrofuranem o stężeniu 9% (w/v)22.</li>
			<li>Rozpuść 0,08 g PS (średnia liczbowa masa cząsteczkowa (Mn): 130 000) w THF: dimetyloformamid (stosunek objętości 1:1) 21, i dodaj THF: dimetyloformamid, aby zwiększyć objętość do końcowego 1 ml (8% (w/v) roztworu PS).</li>
			<li>Rozpuść 0,1 g GT w wodzie: kwas octowy: octan etylu (stosunek objętości 1:1,6:2,1) i dodaj wodę:kwas octowy:octan etylu, aby zwiększyć objętość do końcowego 1 ml (10% (w/v) roztworu GT) zgodnie z opisem23,31.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Za pomocą rozpylarki magnetronowej nałóż cienką warstwę platyny o grubości 5 nm na płytkę bazową z polistyrenu (PS) (127,7 × 85,5 mm), która służy jako katoda w układzie do elektroprzędzenia.</li>
		<li>Załaduj każdy roztwór polimeru do strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę ze stali nierdzewnej 23 G.</li>
		<li>Umieścić i zakotwiczyć strzykawkę z igłą na pompie strzykawkowej w odległości 12 cm od kolektora urządzenia do elektroprzędzenia.</li>
		<li>Podłączyć igłę strzykawki do źródła zasilania pod wysokim napięciem i ustawić na 11 kV.</li>
		<li>Ustaw szybkość pompowania na 0,2 ml/h.</li>
		<li>Utrzymuj temperaturę i wilgotność na poziomie 30 °C i < 30% (v/v).</li>
		<li>Umieść maskę na płytce podstawowej przygotowanej w kroku 1.2.2.</li>
		<li>Wytwórz nanowłókna na płycie bazowej przez otwory maski o różnych gęstościach, zmieniając czas elektroprzędzenia (np. 20, 60, 90 i 180 s).</li>
		<li>Zdejmij maskę z płytki podstawy. 
		nuta. Etanol można rozpylić na elektroprzędzone nanowłókna GT przed zdjęciem maski, aby uniknąć odklejania się nanowłókien GT wraz z maską.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 1.2.4-1.2.10 aż do zakończenia wytwarzania matrycy z nanowłókien.</li>
		<li>Umieścić matrycę z nanowłókien w eksykatorze w temperaturze 25 °C na 16 godzin w celu odparowania pozostałego rozpuszczalnika.</li>
		<li>Usieciowane nanowłókna GT z 0,2 M chlorowodorkiem 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i 0,2 M N-hydroksysukcynimidu (NHS) w etanolu w temperaturze 25 °C przez 4 godziny <klasa sup="xref">23.</li>
		<li>Wypłucz nanowłókna GT dwukrotnie 99,5% (v/v) etanolem i wysusz próżniowo w temperaturze 25 °C przez 16 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie struktur mikroprzepływowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B)
	<ol>
		<li>Wymieszać 2 g utwardzacza PDMS i 20 g bazy PDMS (stosunek wagowy 1:10; Przed PDMS). 24</li>
		<li>Wlej mieszaninę pre-PDMS na formę wykonaną w kroku 1.2.</li>
		<li>Odgazować mieszaninę pre-PDMS w eksykatorze przez 30 minut.</li>
		<li>Mieszaninę pre-PDMS utwardzić w piecu w temperaturze 65 °C przez 16 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż tablic MACME (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B)
	<ol>
		<li>Oderwij strukturę PDMS utwardzoną w kroku 1.3.4 od formy i wyczyść 70% (v/v) etanolem.</li>
		<li>Leczenie atmosferycznego wyładowania koronowego na dolnej stronie struktury PDMS32. 
		nuta: W tym protokole korona jest wyładowywana na całej powierzchni warstwy 3 lub 4 razy za pomocą "poręcznego" aparatu do wyładowań koronowych. Obróbka plazmą tlenową została zastąpiona atmosferycznym wyładowaniem koronowym w celu zmiany przyczepności powierzchni.</li>
		<li>Szybko zmontuj strukturę PDMS za pomocą układu nanowłókien.</li>
		<li>Piec w piekarniku w temperaturze 65°C przez 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wczytywanie hESC do tablicy MACME
<ol>
	<li>W przypadku rutynowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H9 (hESC), należy utrzymywać komórki w wolnym od kseno, chemicznie zdefiniowanym pożywce hodowlanej w celu utrzymania hPSC33 uzupełniony inhibitorem 10 μM Y-27632 ROCK34 (nazwana pożywką hPSC) w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowych pokrytym macierzyą żelową błony podstawnej (MG).</li>
	<li>Pasaż komórek co 4 do 7 dni za pomocą rekombinowanej proteazy podobnej do trypsyny.</li>
	<li>Wysterylizuj macierz MACME 99,5% etanolem, ładując do komór na 10 minut, a następnie usuń etanol. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
	<li>Wprowadzić 12 μl MG, 10 μg/ml witronektyny (VN) i 0,1% (w/v) GT do komór hodowlanych kontrolnych i inkubować komory w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby pokryć je na powierzchni komory. 
	nuta: W tym protokole MG, VN i GT zostały wybrane jako białka referencyjne do adhezji i hodowli komórek. Ponieważ MG i VN są standardowymi matrycami hodowli komórkowych stosowanymi do utrzymania samoodnawiania się hPSC, stosuje się je jako kontrole pozytywne; jako kontrole ujemne zastosowano dwuwymiarową powłokę GT (2DGT) lub niepowłokową (NC).</li>
	<li>Wprowadzić wstępnie podgrzaną pożywkę hPSC do wszystkich komór matrycy MACME. Inkubować komory przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć H9 hESC wyhodowany na szalce o średnicy 35 mm za pomocą DPBS, dodać 0,5 ml rekombinowanej proteazy trypsynopodobnej do naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 minutę i ostrożnie odessać tylko supernatanty zmieszane z proteazą. 
	nuta: Na etapie aspiracji komórki nie są odłączane.</li>
	<li>Natychmiast dodaj pożywkę hPSC, delikatnie dozuj pożywkę do powierzchni naczynia kilkakrotnie, aby zdysocjować komórki i przenieś odłączone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 3 min. Odessać supernatant i zawiesić komórki w wstępnie podgrzanym podłożu hPSC.</li>
	<li>Wprowadzić 12 μl zawiesiny komórek (1,2 × 106 komórek/ml) do każdej komory mikroprzepływowej. 
	nuta: Wprowadzić komórki do jednej komory z drugiej za pomocą mikropipety. Ponieważ liczba komórek wysiewanych do komór jest proporcjonalna do gęstości kolumny nad dnem komory, początkowa gęstość wysiewu komórek może być kontrolowana, nawet jeśli użyto próbek z tej samej zawiesiny komórek. Upewnij się, że pipetowanie odbywa się delikatnie. Po załadowaniu usuń nadmiar podłoża z komór za pomocą patyczka z bawełnianą końcówką. Macierz MACME jest kompatybilna zarówno z powszechnie stosowanymi pipetami laboratoryjnymi, jak i automatycznymi systemami pipetowania i nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę hPSC co 12 godzin i posiew przez 4 dni. 
	nuta: Stałe objętości pożywki (1,6, 3,2 i 6,4 μl) są utrzymywane dzięki zastosowaniu komór o różnych rozmiarach. Hoduj komórki w warunkach statycznych, aby zminimalizować naprężenia ścinające, z wyjątkiem wymiany pożywki do hodowli komórkowych35,36.</li>
</ol>
3. Ilościowe profilowanie pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Barwienie komórek fluorescencyjnych na płytce 
	Uwaga: Aby przeanalizować zmiany fenotypowe samoodnawiających się hPSC, w protokole tym wybrano trzy kluczowe markery fenotypowe dla tego protokołu: OCT4, 5-etynylo-2'-deoksyurydynę (EdU) i Aneksynę V, aby zmierzyć odpowiednio stan pluripotencji, proliferacji i apoptozy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2b). 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) służy do identyfikacji jąder komórkowych. OCT4 jest jednym z krytycznych czynników transkrypcyjnych pluripotencji.
	<ol>
		<li>Inkubować hESC H9 w macierzach MACME w pożywce hPSC uzupełnionej 10 μM alkinem EdU w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Po przemyciu buforem wiążącym anekcynę (10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2), wybarwić komórki pomarańczowo-fluorescencyjnym barwnikiem sprzężonym z Aneksyną V w temperaturze 20 °C przez 15 min.</li>
		<li>Utrwalić komórki w PBS za pomocą 4% (v/v) paraformaldehydu w temperaturze 20 °C przez 15 minut, a następnie dwukrotnie przepłukać komórki PBS.</li>
		<li>Przepuszczalność komórek za pomocą PBS z 0,3% (v/v) Triton X-100 w temperaturze 20 °C przez 16 godzin 
		nuta: Paraformaldehyd osłabia wiązanie między plastikową płytą podstawy a strukturą mikroprzepływową PDMS. W związku z tym odłączenie warstwy PDMS od macierzy w kroku 3.2.1 można również wykonać zaraz po tym kroku.</li>
		<li>Inkubować komórki w buforze reakcyjnym na bazie Tris z azydkiem barwnika czerwonofluorescencyjnego w temperaturze 20 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Inkubować komórki w buforze blokującym (PBS z 5% (v/v) normalną surowicą kozią, 5% (v/v) normalną surowicą osła, 3% (w/v) albuminą surowicy bydlęcej, 0,1% (v/v) Tween-20 i 0,1% (w/v) N-dodecylo-β-D-maltozydem) w temperaturze 4 °C przez 16 godzin.</li>
		<li>Inkubować w PBS z 0,5% (v/v) roztworem Triton X-100 i ludzkim przeciwciałem OCT3/4 (mysią IgG) w temperaturze 4 °C przez 16 godzin.</li>
		<li>Inkubować w buforze blokującym z IgG (H+L) (H+L) znakowanymi barwnikiem zielono-fluorescencyjnym w temperaturze 37°C przez 60 minut.</li>
		<li>Inkubować w PBS z DAPI w temperaturze 20 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Zamień PBS-DAPI na PBS.</li>
		<li>Zachowaj macierz MACME w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4)
	<ol>
		<li>Oderwij strukturę mikroprzepływową PDMS od macierzy MACME.</li>
		<li>Usuń resztki PBS z macierzy MACME, nałóż 90% (v/v) glicerolu w PBS na komórki i umieść szkiełka nakrywkowe na wybarwionych komórkach.</li>
		<li>Ustaw płytkę do góry nogami na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Automatyczne uzyskiwanie 12-bitowych kolorowych obrazów przy użyciu wszystkich zmotoryzowanych komponentów (stolika, filtrów, migawki i systemów ostrości), które były sterowane przez oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego. 
		nuta. W tym protokole czasy ekspozycji są dostosowywane tak, aby osiągały wartości bliskie maksymalnym wartościom intensywności (najwyższa intensywność pikseli: 4096), ale bez nasycenia, dla każdego obrazu, DAPI, OCT4, Aneksyny V i EdU.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komputerowe przetwarzanie obrazu i kwantyfikacja sygnału fluorescencji (<silna klasa="xfig">Rysunek 5) 
	Uwaga: Poniższa analiza obrazu komórki jest wykonywana w oparciu o wcześniej opisaną metodę37.
	<ol>
		<li>Konwertuj kolorowe obrazy na skalę szarości.</li>
		<li>Oblicz pojedynczą wartość progową dla każdego obrazu DAPI za pomocą metody Otsu i sklasyfikuj piksele powyżej progu jako pierwszy plan i poniżej jako tło. Upewnij się, że wartość pierwszego planu odpowiada intensywności fluorescencji DAPI. 
		nuta: Proces analizy obrazu składa się z 5 kroków; identyfikacja obiektów pierwotnych na obrazach DAPI, identyfikacja obiektów wtórnych odpowiednio na obrazach OCT4, Aneksyny V i EdU oraz pomiar intensywności obiektu. Rysunek 3 przedstawia obrazy graficznego interfejsu użytkownika (GUI) dotyczące ustawień przetwarzania obrazu.</li>
		<li>Zmierz intensywność fluorescencji OCT4 i EdU na każdym obrazie.</li>
		<li>Zidentyfikować obszar zabarwiony załącznikiem V za pomocą metody propagacji i określić ilościowo intensywność fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3.4. Analiza statystyczna w celu wizualizacji poszczególnych fenotypów komórkowych w obrazowaniu pojedynczych komórek
	<ol>
		<li>Znormalizuj wejściowe intensywności fluorescencyjne każdego markera fenotypowego, centrując i skalując te zmienne, aby nadać im równą wagę.</li>
		<li>Wykonaj analizę mapy samoorganizującej się (SOM) przy użyciu środowiska programowego do obliczeń statystycznych i grafiki, zgodnie z opisem w poprzednich badaniach38,39.
		<ol>
			<li>Utwórz 25 węzłów SOM z charakterystycznymi czterema "wektorami książki kodowej" odpowiadającymi intensywnościom fluorescencji czterech markerów: DAPI, EdU, Annexin V i OCT4.</li>
			<li>Przypisz poszczególne komórki w każdym mikrośrodowisku do "zwycięskiego" (najbardziej podobnego) węzła i wykreśl jako częstość komórki, zgodnie z którą wektory książki kodowej zwycięskiego węzła są aktualizowane przy użyciu średniej ważonej, gdzie waga jest szybkością uczenia się (tutaj domyślnie 0,05). 
			nuta: Pomiń dane z komór zawierających mniej niż 1000 komórek, ponieważ zestawy danych zawierające kilka komórek nie dostarczyły statystycznie istotnych wyników SOM.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj nienadzorowane grupowanie hierarchiczne z wartościami węzła SOM, korzystając z metody średniego powiązania opartej na korelacji Pearsona przez oprogramowanie do grupowania40.</li>
		<li>Renderuj dane klastrowania w widokach dendrogramu i mapy cieplnej41.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Protokół ten przedstawia pierwszą metodę badań przesiewowych w celu ustanowienia solidnego systemu hodowli na potrzeby utrzymania kwalifikowanych komórek hPSC. Po pierwsze, opisaliśmy, jak przygotować platformę z różnymi sztucznymi ECM i gęstościami wysiewu komórek za pomocą urządzenia mikroprzepływowego zintegrowanego z układem nanowłókien, macierzą MACME. Po drugie, przeprowadzono ilościowe fenotypowanie pojedynczych komórek w oparciu o obrazy50 w celu oceny indywidualnych wyników i zachowań kom...

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC)1,2 samoodnawiają się bez ograniczeń i różnicują w różne linie tkankowe, co może zrewolucjonizować rozwój leków, terapie komórkowe, inżynierię tkankową i medycynę regeneracyjną3,4,5,6. Płytki do hodowli ogólnej i płytki do mikromiareczkowania nie są jednak zaprojektowane tak, aby umożliwić precyzyjną fizyczną i chemiczną manipulację komórkami na poziomie komórkowym w zakresie od nano- do mikrometrów, co jest krytycznym czynnikiem ekspansji komórkowej, samoodnowy i różnicowania. Aby rozwiązać ten problem, w badaniach zbadano rolę mikrośrodowisk komórkowych w regulowaniu decyzji dotyczących losu komórki i funkcji komórek4. W ostatnich latach przeprowadza się coraz więcej badań mających na celu rekonstrukcję mikrośrodowisk komórkowych in vitro7,8. Procesy nano- i mikroprodukcji stworzyły te mikrośrodowiska poprzez manipulację chemikaliami9,10,11,12,13,14,15,16,17 i fizyczny18,19,20 wskazówek środowiskowych. Do tej pory nie było doniesień pozwalających na systematyczne badanie mechanizmów leżących u podstaw chemicznych i fizycznych sygnałów środowiskowych wpływających na decyzje i funkcje dotyczące losu komórek w ramach jednej platformy.
Tutaj wprowadzamy strategię opartą na prostych zasadach projektowania, aby stworzyć solidną platformę przesiewową (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Po pierwsze, opisujemy procedurę rozwoju zintegrowanej platformy do tworzenia wszechstronnych, sztucznych mikrośrodowisk komórkowych przy użyciu macierzy nanowłókien i struktury mikroprzepływowej: tablicy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A i 2A). Układ nanowłókien ma 12 różnych mikrośrodowisk w różnych kombinacjach materiałów i gęstości nanowłókien. Do wytworzenia nanowłókien wykorzystano elektroprzędzenie. Materiały z nanowłókien, takie jak polistyren (PS)21, polimethylglutarimid (PMGI)22 i żelatyna (GT)23, zostały zaprojektowane w celu przetestowania ich właściwości chemicznych, które mogą wpływać na adhezję komórek i utrzymanie pluripotencji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Gęstości nanowłókien zmieniano poprzez zmianę czasu elektroprzędzenia, a wygenerowane nanowłókna zdefiniowano zgodnie z ich gęstościami (DNF, gdzie D = XLow/Niski/Średni/Wysoki). Struktura mikroprzepływowa składa się z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierającego 48 komór do hodowli komórkowych, które można umieścić wzdłuż standardowych wymiarów 96-dołkowej mikropłytki. PDMS jest biokompatybilnym i wymienialnym gazowo polimerem powszechnie używanym do produkcji urządzeń mikroprzepływowych24. Każdy kanał mikroprzepływowy został zaprojektowany tak, aby miał 700 μm szerokości i 8,4 mm długości i miał dwa wloty na krawędziach (Tabela 1). Komory miały różne wysokości (250, 500 i 1000 μm), aby manipulować początkowymi gęstościami wysiewu komórek (0,3, 0,6 i 1,2 × 105 komórek/cm2), co może korelować z przeżywalnością, proliferacją i różnicowaniem hPSCs25 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Liczba komórek wysianych w komorze jest proporcjonalna do gęstości kolumny nad dnem komory, a zatem początkowa gęstość wysiewu komórek była kontrolowana poprzez wprowadzenie tej samej zawiesiny komórek do komór hodowlanych o różnych wysokościach. Wszystkie kanały zostały zaprojektowane tak, aby ≥ 250 μm-high26, aby zminimalizować wpływ niskiego napięcia tlenowego27 i naprężenia ścinającego28 na komórkach. Wysokości kanałów 250, 500 i 1000 μm są tutaj skracane jako XCD z X = odpowiednio niskie, średnie i wysokie. Środowiska o wyraźnej gęstości nanowłókien i początkowej gęstości zasiewu komórek zostały skrócone do "gęstości Material_NF density_Cell" (np. GT_HighNF_HighCD: środowisko charakteryzujące się nanowłóknami GT o dużej gęstości i wysoką początkową gęstością wysiewu komórek).
Następnie opisujemy, jak przeprowadzać analizy pojedynczych komórek, aby systematycznie badać zachowanie komórek w odpowiedzi na czynniki środowiskowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Jako dowód słuszności koncepcji zidentyfikowaliśmy optymalne środowisko komórkowe dla samoodnawiania się hPSC, które jest kluczową funkcją dla utrzymania hPSC (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1B)29. Cytometria oparta na obrazie, a następnie analizy statystyczne, pozwalają na ilościową interpretację indywidualnych odpowiedzi fenotypowych komórek na środowisko komórkowe. Wśród różnych funkcji komórkowych, w artykule przedstawiono szczegółową procedurę identyfikacji optymalnych warunków utrzymania samoodnawiania się hPSC.

<table><tbody><tr><td>Polistyren (PS)</td><td>Sigma</td><td>#182435</td><td>Średnia Mw: 290 000, średnia Mn: 130 000</td></tr><tr><td>Polimetyloglutarymid (PMGI)</td><td>MicroChem</td><td>G113113</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna (GT)</td><td>Sigma</td><td>G2625</td><td>Ze skóry świni,</td></tr><tr><td>zestaw elastomerów silikonowych typu A Sylgard 184</td><td>Doe Corning Toray</td><td>#1064291</td><td>Utwardzacz PDMS i baza elastomeru silikonowego są elementami tego zestawu.</td></tr><tr><td>OpenSCAD</td><td></td><td></td><td>Jest to bezpłatne oprogramowanie do grafiki komputerowej 3D (http://www.openscad.org/) służące do projektowania formy urządzenia mikroprzepływowego.</td></tr><tr><td>AutoCAD 2014</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Jest to oprogramowanie do grafiki komputerowej 3D (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) służące do projektowania maski używanej do przygotowania matrycy z nanowłókien.</td></tr><tr><td>Drukarka 3D, AGILISTA-3000</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żywica utwardzana promieniami UV, AR-M2</td><td>Keyence</td><td></td><td>Jest to używane do drukowania 3D przez Agilista.</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>#338826</td><td>&ge; 99,99%</td></tr><tr><td>octan etylu</td><td>Sigma</td><td>#270989</td><td>Bezwodny, 99,8%</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF)</td><td>Sigma</td><td>#401757</td><td></td></tr><tr><td>MSP-30T</td><td>Urządzenie</td><td></td> próżniowe <td>Napylanie magnetronowe</td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#242811</td><td>Jest to polistyrenowa płytka bazowa, na której tworzony jest układ nanowłókien. Ten rozmiar płytki to zwykle 127,7 x 85,5 mm.</td></tr><tr><td>Pistoletowa maszyna do wyładowań koronowych</td><td>Shinko Electric & Oprzyrządowanie</td><td>CFG-500</td><td>To poręczne urządzenie służy do generowania korony w celu aktywacji dolnej powierzchni warstwy PDMS w kroku 1.5 "Montaż macierzy MACME" w protokole.</td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>igła ze stali nierdzewnej (rozmiar 23)</td><td>Nipro</td><td>#2166</td><td>Średnica zewnętrzna i długość wynoszą odpowiednio 0,6 i 32 mm.</td></tr><tr><td>Zasilacz wysokonapięciowy</td><td>TechDempaz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid, chlorowodorek</td><td>Dojindo</td><td>W001</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksysukcynimid</td><td>Sigma</td><td>#56480</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualified Matrix</td><td>Corning</td><td>#354277</td><td>Białko to jest określane w protokole jako matryca żelowa błony podstawnej.</td></tr><tr><td>CellAdhere Vitronectin, Człowiek, Roztwór</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07004</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#05940</td><td>Pożywka hodowlana bez karmy, bez ksenotypów do utrzymania ludzkich komórek ES i iPS</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>#253-00513</td><td></td></tr><tr><td>Enzym TrypLE Express (1X), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#12605028</td><td>Jest to rekombinowana proteaza podobna do trypsyny do dysocjacji przylegających komórek ssaków.</td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania Click-iT EdU z Alexa Fluor 647 Azides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10086</td><td>Fluorescencyjne znakowanie proliferujących komórek w barwieniu fluorescencyjnym na płytce przeprowadzono zgodnie z instrukcją obsługi tego zestawu.</td></tr><tr><td>Aneksyna V, koniugat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13203</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Przeciwciało (C-10)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5279</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse IgG H& L (DyLight 488)</td><td>abcam</td><td>ab96875</td><td>Jest to przeciwciało drugorzędowe stosowane w barwieniu komórek fluorescencyjnych na płytce.</td></tr><tr><td>ECLIPSE Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Jest to odwrócony mikroskop fluorescencyjny wyposażony w obiektyw CFI Plan Fluor 4&times;/0,13 N.A. (Nikon), kamerę CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), lampę rtęciową (Intensilight, Nikon), stolik automatyczny XYZ (stolik z napędem Ti-S-ER z enkoderami, Nikon) oraz kostki filtrujące dla czterech kanałów fluorescencyjnych (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)</td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>Nikon</td><td></td><td>Jest to oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego służące do automatycznej akwizycji obrazu.</td></tr><tr><td>CellProfiler, wersja 2.1.0</td><td></td><td></td><td>Jest to bezpłatne, otwarte oprogramowanie do analizy obrazu komórki (http://cellprofiler.org/).</td></tr><tr><td>Analiza R</td><td></td><td></td><td>SOM jest wykonywana przez pakiet kohonen tego oprogramowania. Jest to dostępne bezpłatnie (https://www.r-project.org/).</td></tr><tr><td>Klaster 3.0</td><td></td><td></td><td>Jest to oprogramowanie klastrowe typu open source (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Za pomocą tego oprogramowania wykonywane jest nienadzorowane grupowanie hierarchiczne.</td></tr><tr><td>Java TreeView</td><td></td><td></td><td>To oprogramowanie typu open source (http://jtreeview.sourceforge.net/) służy do wizualizacji danych klastrowych w postaci mapy cieplnej i dendrogramu.</td></tr><tr><td>H9 ludzka embrionalna komórka macierzysta</td><td>Bank komórek macierzystych WiCell</td><td>WA09</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Mikrośrodowiska komórkowe składają się z różnych sygnałów, takich jak czynniki wzrostu, matryce zewnątrzkomórkowe i interakcje międzykomórkowe. Te sygnały są dobrze zaaranżowane i mają kluczowe znaczenie w regulacji funkcji komórek w żywym systemie. Chociaż wielu badaczy próbowało zbadać korelację między czynnikami środowiskowymi a pożądanymi funkcjami komórkowymi, wiele pozostaje niewiadomych. Wynika to w dużej mierze z braku odpowiedniej metodologii naśladowania takich sygnałów środowiskowych in vitro i jednoczesnego testowania różnych sygnałów środowiskowych na komórkach. W tym miejscu przedstawiamy zintegrowaną platformę kanałów mikroprzepływowych i matrycę nanowłókien, a następnie analizę pojedynczych komórek o wysokiej zawartości, w celu zbadania fenotypów komórek macierzystych zmienionych przez różne czynniki środowiskowe. Aby zademonstrować zastosowanie tej platformy, badanie koncentruje się na fenotypach samoodnawiających się ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). W tym miejscu przedstawiamy procedury przygotowania macierzy nanowłókien oraz strukturę mikroprzepływową w procesie wytwarzania macierzy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME). Ponadto opisano ogólne etapy profilowania pojedynczych komórek, barwienia komórek wieloma markerami fluorescencyjnymi, wielokrotnego obrazowania fluorescencyjnego i analiz statystycznych.

Układy MACME: Projektowanie i wykonanie: W połączeniu z technologią nanowłókien wykorzystaliśmy mikrofluidalne techniki hodowli i przesiewania komórek, zastosowane wcześniej do identyfikacji optymalnych warunków dla samoodnawiania lub różnicowania hPSC35,36 (Rycina 1). Rozwiązanie to jest bardzo odpowiednie do tworzenia solidnych, wysokoprzepustowych testów komórkowych, ponieważ komor...

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie w dziedzinie inżynierii komórek macierzystych, takie jak to, w jaki sposób mikrośrodowisko komórkowe zmienia fenotypy i funkcje komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wiele sztucznie stworzonych środowisk dla komórek na jednej płytce, czego nie można było wykonać konwencjonalną metodą na płytce mikrokontaktowej, demonstrując tę procedurę będą technikami Koki Yoshimoto i Risako Sakai z naszego laboratorium. Po stworzeniu obrazów 3D masek dla matryc nano fiber i form ze struktur mikroprzepływowych zgodnie z protokołem tekstowym.Użyj drukarki 3D, aby wydrukować maski i formę. Aby przygotować roztwory polimerowe do wirowania elektrycznego, rozcieńczyć 13 procent cieczy PMGI z tetrahydrofuranem do dziewięciu procent. Rozpuść 0,08 grama PS w stosunku objętościowym THF do dimetyloformamidu jeden do jednego i użyj płynnego regentu, aby doprowadzić objętość do końcowego jednego mililitra ośmioprocentowego roztworu PS na objętość.Rozpuścić 0,1 grama GT w wodzie, kwasie kwaśnym i octanie etylu i użyć zmieszanego roztworu rozpuszczalnika, aby zwiększyć objętość do końcowego jednego mililitra 10% wagowo roztworu GT. Następnie, za pomocą rozpylarki magnetronowej, nałóż warstwę platyny o grubości pięciu nanometrów na polistyrenową płytę bazową, która służy jako katoda w układzie do przędzenia elektrycznego. Załaduj każdy roztwór polimeru do pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23.Następnie zakotwiczyć strzykawki na pompie strzykawkowej w odległości 12 centymetrów od kolektora urządzenia do elektroprzędzenia. Podłączyć igłę strzykawki do źródła zasilania o wysokim napięciu i ustawić ją na 11 kilowoltów. Następnie ustaw szybkość pompowania na 20 mililitrów na godzinę i utrzymuj temperaturę i wilgotność odpowiednio na poziomie 30 stopni Celsjusza i mniej niż 30 procent objętości.Teraz połóż maskę na płycie podstawy. Następnie przez otwory maski wytwórz nanowłókna na płycie podstawy o wyraźnej gęstości, zmieniając czas wirowania elektrycznego. Zdejmij maskę z płyty podstawy i powtórz wytwarzanie nanowłókien.Gdy matryca jest gotowa, umieść ją w eksykatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 16 godzin, aby odparować pozostały rozpuszczalnik. Aby usieciować nanowłókna GT, potraktuj je 0,2 molowym EDC i 0,2 molowym NHS w etanolu. I inkubować próbki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez cztery godziny.Aby wypłukać nanowłókna GT, użyj dwukrotnie 99,5 procent etanolu i wysusz próżniowo płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Aby wytworzyć struktury mikroprzepływowe, wymieszaj 2 gramy utwardzacza PDMS i 20 gramów zasady PDMS. Następnie wlej mieszaninę pre-PDMS do wyprodukowanej formy.W eksykatorze odgazowuje się mieszaninę wstępnego PDMS przez 30 minut. Następnie utwardź mieszaninę pre PDMS w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Aby zmontować macierze Macme, oderwij utwardzoną strukturę PDMS od formy i użyj 70 procent etanolu do jej oczyszczenia.Następnie wyładowujemy koronę atmosferyczną na spodniej stronie struktury PDMS. Szybko zmontuj strukturę PDMS za pomocą macierzy nanowłókien. Następnie piecz zestaw w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwa dni.Za pomocą DPBS umyć H9HESC hodowane na 35 milimetrowym naczyniu. Następnie dodaj 0,5 mililitra rekombinowanej proteazy świetlnej trypsyny do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez minutę. Ostrożnie zassać mieszaninę proteazy supernatantu.Natychmiast dodaj pożywkę HPSC i delikatnie dozuj pożywkę do powierzchni naczynia, aby zdysocjować komórki. Następnie przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwiruj probówkę 200 razy grawitacyjnie przez trzy minuty.Odessać supernatant i zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym pożywce HPSC. Następnie odpipetować 12 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej komory mikroprzepływowej. Po fluorescencyjnym znakowaniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, oderwij strukturę mikroprzepływową PDMS od macierzy Macme.Następnie usuń resztki PBMS z macierzy Macme, dodaj 90 procent glicerolu z PBS do wybarwionych komórek i nałóż szkiełko nakrywkowe. Na koniec ustaw płytkę do góry nogami na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Korzystaj z oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, aby uzyskać 12-bitowe kolorowe obrazy.Pokazano tutaj obrazy immunofluorescencyjne H9HPSC hodowane przy wysokiej początkowej gęstości wysiewu na nanowłóknach żelatynowych i barwione 3 komórkowymi markerami fenotypowymi. Analizę SOM wykorzystano do przekształcenia wielowymiarowych zestawów danych wieloparametrycznych w niskowymiarowe mapy 2D w celu porównania jednorodności i heterogeniczności poziomów ekspresji dla czterech markerów fenotypowych w każdym zestawie danych, a dla węzłów SOM przeprowadzono nienadzorowane grupowanie hierarchiczne. Jak wskazano tutaj, wszystkie grupy wykazywały wyższą ekspresję OCT4 niż obserwowano na matrycy żelowej błony podstawnej lub MG. Grupa pierwsza wykazywała wysokie sygnały EdU, co wskazuje, że większość komórek aktywnie się proliferowała.W związku z tym mikrośrodowiska w grupie pierwszej nadawały się do utrzymania HPSC, ponieważ niezróżnicowane HPSC rozprzestrzeniają się szybko, gdy fazy przerwy w cyklu komórkowym są skrócone. Grupa druga obejmowała komórki wysiane przy niewystarczającej gęstości początkowej oraz komórki wyhodowane na rusztowaniach 2D GT, które nie wspierały samoodnawiania HPSC. Na przykład sygnał EdU tej próbki został utracony, a poziom aneksyny V nieznacznie wzrósł, co wskazuje, że komórki utraciły swoją macierzystość i stopniowo stawały się apoptotyczne.PMGI MidNF HighCD z grupy trzeciej, która reprezentuje mikrośrodowiska składające się z matryc nanowłókien PMGI, wykazała większe różnice w sygnałach OCT4 i EdU w porównaniu z innymi warunkami. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie komórek STEM do zbadania inżynierii tkankowej i zaawansowanych badań przesiewowych.

fabrication-multiplexed-artificial-cellular-microenvironment

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Opisano kombinatoryczną metodę przesiewania funkcjonalnego służącą do pogłębienia wiedzy na temat wpływu składu molekularnego mikrośrodowisk na funkcje komórkowe. Metoda ta wykorzystuje istniejące technologie oparte na mikromacierzych do generowania macierzy zdefiniowanych kombinatorycznych mikrośrodowisk, które umożliwiają adhezję komórek oraz analizę funkcjonalną.

Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

Ten manuskrypt opisuje protokół do budowy in vitro modułowych sieci składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnie połączonych obwodów neuronalnych. Maska polimerowa służy do modelowania warstwy białka w celu promowania adhezji komórkowej nad substratem hodowlanym. Platerowane neurony rosną na pokrytych obszarach, tworząc spontaniczne połączenia i wykazując aktywność elektrofizjologiczną.

Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Celem przedstawionej tutaj metody jest pokazanie, jak mikromacierze mikrośrodowiskowe (MEMA) mogą być wytwarzane i wykorzystywane do badania wpływu tysięcy prostych mikrośrodowisk kombinatorycznych na fenotyp hodowanych komórek.

Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Poznaj metodę MACME do wytwarzania multipleksowanych sztucznych mikrośrodowisk komórkowych dla badań nad ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Technika ta umożliwia analizę wysokoprzepustową i optymalizację warunków hodowli.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Przeglądaj więcej filmów