Name: Bezznacznikowa detekcja pojedynczych cząsteczek za pomocą mikrotoroidalnych rezonatorów optycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj bezznacznikową detekcję pojedynczych cząsteczek za pomocą mikrotoroidalnych rezonatorów optycznych FLOWER. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki wiązań białek bez etykietowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez National Research Service Award (T32GM07616) od National Institute of General Medical Sciences.

1. Konfiguracja eksperymentalna i przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Wytwarzaj mikrotoroidy przy użyciu procedury litografii, trawienia i topienia, jak opisano wcześniej6. Wytwarzaj mikrotoroidy na wierzchu płytki krzemowej (chipa), które zwykle mają główną średnicę 80-100 μm i mniejszą średnicę 2 μm.</li>
	<li>Rozwiń około metra światłowodu jednomodowego (okładzina 125 μm, średnica pola 4,3 μm) ze szpuli światłowodu.</li>
	<li>W środku rozwiniętej części światłowodu usuń mały segment (2,5 cm) powłoki polimerowej wokół światłowodu za pomocą ściągaczy izolacji. Uwaga: Jest to część światłowodu, która zostanie użyta do ulotnego sprzężenia światła z mikrotoroidem.</li>
	<li>Wyczyść pozbawione włókien alkoholem izopropanolowym i niestrzępiącą się chusteczką.</li>
	<li>Przytrzymaj tę część włókna na miejscu za pomocą uchwytu na światłowód wykonanego z zacisków magnetycznych.</li>
	<li>Rozcieńczyć odizolowane włókno do ~500 nm poprzez topienie i ciągnięcie za pomocą palnika wodorowego i dwóch silników krokowych poruszających się w przeciwnych kierunkach z prędkością 60 μm/min. Umieść światłowód wewnątrz górnej części płomienia, która powinna mieć wysokość ~10 mm. Przestań ciągnąć światłowód, gdy transmisja przez światłowód przestanie się wahać, co można monitorować wizualnie (obserwując, jak światło rozproszone bocznie od światłowodu i wyłącza) lub podłączając światłowód do fotodiody, która jest przymocowana do oscyloskopu.</li>
	<li>Rozetnij jeden koniec światłowodu i włóż go do adaptera z gołym światłowodem. Umieść ten koniec światłowodu w wejściu fotoodbiornika.</li>
	<li>Światłowód łączy drugi koniec szpuli światłowodu z laserem za pomocą łącznika światłowodowego.</li>
	<li>Umieść chip mikrotoroidowy na uchwycie próbki (stal nierdzewna, 37.8 mm x 6.4 mm x 3.2 mm) za pomocą taśmy epoksydowej lub dwustronnej.</li>
	<li>Zamontuj uchwyt próbki na stoliku pozycjonującym, który składa się z 3-osiowego stolika do nanopozycjonowania (nanosześcianu) (patrz lista wyposażenia) na górze 3-osiowego mikrometru. Wykonuj wszystkie eksperymenty na pneumatycznie izolowanym stole optycznym, aby zminimalizować wibracje.</li>
	<li>Zgrubnie ustawić chip próbki za pomocą mikrometru 3-osiowego.</li>
	<li>Ustaw chip zawierający mikrotoroid równolegle do światłowodu za pomocą nanopozycjonera. Uwaga: Ustaw mikrotoroid w odległości jednej długości fali od światła wejściowego (~633 nm). Do wizualizacji tego procesu należy wykorzystać dwie kolumny obrazowania (tubus z soczewką obiektywu i kamerą, patrz lista wyposażenia) umieszczone na górze i z boku chipa.</li>
	<li>Zoptymalizuj polaryzację światła laserowego kierowanego przez światłowód za pomocą wbudowanego kontrolera polaryzacji (patrz lista wyposażenia) z pokrętłem do regulacji polaryzacji. Uwaga: Optymalna polaryzacja jest osiągana, gdy zmierzone zanurzenie w transmisji światłowodu wydaje się najwęższe. Obserwuj ten spadek na oscyloskopie (więcej szczegółów w kroku 2.2).</li>
	<li>Skonstruuj komorę na próbki, epoksydując szklane szkiełko nakrywkowe na stoliku próbki, używając szklanego szkiełka mikroskopowego jako elementu dystansowego. Uwaga: Obudowa z pleksiglasu zakrywająca całą instalację może być przydatna do minimalizacji prądów powietrza. Należy pozostawić mały otwór, aby umożliwić wpompowanie roztworu za pomocą rurki.</li>
	<li>Zrównoważyć termicznie zawiesiny cząstek lub jednocząsteczkowe roztwory wodne przez ≥ 1 godzinę w łaźni wodnej RT (~500 ml). Uwaga: Próbki rozcieńcza się do pożądanego stężenia w probówkach mikrowirówkowych przy użyciu odpowiednich określonych przez producenta, np. PBS lub HEPES. Jeżeli nie zostaną wykryte żadne zdarzenia wiązania, należy zwiększyć stężenie soli w buforze.</li>
	<li>Wirować cząstki zawierające roztwory (1 ml) krótko przez ~2 sek.</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwory zawierające cząstki do komory na próbkę z prędkością 1 ml/min za pomocą pompy strzykawkowej o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Po napełnieniu komory na próbkę wyłączyć pompę strzykawkową.</li>
	<li>Odczekaj 30 sekund przed zapisaniem danych, aby zminimalizować skutki drgań mechanicznych wynikających z przepływu płynu, które mogą wpływać na pomiar.</li>
</ol>
2. Blokowanie częstotliwości
<ol>
	<li>Ponownie sprzęgnij toroid ze światłowodem, przesuwając uchwyt próbki za pomocą nanopozycjonera, ponieważ sprzężenie zostanie zakłócone z powodu wtrysku płynu.</li>
	<li>Zlokalizuj długość fali rezonansowej mikrotoroidu, skanując sterowany komputerowo laser wejściowy przez różne długości fal. Wykonaj ten krok, wysyłając trójkątny sygnał napięcia falowego do elementu piezoelektrycznego w sterowniku lasera, który reguluje długość fali lasera. Wykonuj eksperymenty w świetle widzialnym (635 nm ± 2,5 nm), ponieważ absorpcja światła w wodzie o tej długości fali jest niska.</li>
	<li>Zmierz transmisję światła przez światłowód, podłączając wyjście światłowodu do automatycznie zbalansowanego fotoodbiornika. Podłącz wyjście fotoodbiornika do oscyloskopu za pomocą BNC. Obserwuj na oscyloskopie, że przy długości fali rezonansowej mikrotoroidu transmisja przez światłowód spada.</li>
	<li>Podłącz wyjście fotoodbiornika do głównego wejścia sterownika sprzężenia zwrotnego z blokadą częstotliwości (patrz lista wyposażenia) za pomocą.</li>
	<li>Uruchom regulator sprzężenia zwrotnego z blokadą częstotliwości w trybie automatycznej blokady, używając blokady górnej części szczytu z częstotliwością roztrząsania 2 kHz i amplitudą oscylacji długości fali 19 fm. Empirycznie ustaw ustawienia pochodnej proporcjonalnej całki w oknie oprogramowania, korzystając z reguł strojenia Zieglera-Nicholsa14. Uwaga: te wartości należy ustawić tylko raz na początku wszystkich eksperymentów.</li>
	<li>Automatycznie blokuj długość fali lasera do długości fali rezonansowej mikrotoroidu. Wykonaj ten krok po napełnieniu komory na próbkę. Uwaga: Jeśli przesunięcie długości fali jest zbyt duże, kontroler sprzężenia zwrotnego straci blokadę i automatycznie przełączy się w tryb skanowania w celu zlokalizowania lokalizacji długości fali rezonansowej. Dzieje się tak w przypadku przesunięć długości fal większych niż około jednej szerokości linii (co najmniej 600 fm dla wszystkich badanych tutaj systemów).</li>
	<li>Nagraj wyjście kontrolera sprzężenia zwrotnego przy 20 kHz za pomocą 24-bitowej karty akwizycji danych. Eksportuj dane jako plik tekstowy za pomocą oprogramowania do akwizycji danych.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie i analiza danych
<ol>
	<li>Fourier przekształca dane w MATLAB.</li>
	<li>Dolnoprzepustowość danych za pomocą filtra "brick-wall" z odcięciem przy 1 kHz, aby usunąć narzuconą częstotliwość ditheru 2 kHz (patrz zrzut ekranu 1 pliku kodu uzupełniającego).</li>
	<li>Obliczeniowo filtruj dane z wycięciem przy użyciu okna o rozmiarze 16 Hz. Uwaga: Ma to na celu usunięcie znanych źródeł szumów, w tym przypadku szumu linii elektronicznej 60 Hz i jego harmonicznych, a także 100 Hz (pochodzących ze sterownika lasera) i jego harmonicznych (patrz zrzut ekranu 1 pliku kodu uzupełniającego).</li>
	<li>Odwrotność Fouriera przekształca dane z powrotem w dziedzinę czasu.</li>
	<li>Mediana filtruje dane przy użyciu rozmiaru okna 1 001 próbek (patrz zrzut ekranu pliku kodu uzupełniającego 2).</li>
	<li>Zlokalizuj skokowe zmiany długości fali rezonansowej za pomocą algorytmu znajdowania kroku Kerssemakersa i wsp.Rozdział 15.</li>
	<li>Wygeneruj histogramy amplitudy każdego kroku wiązania.</li>
	<li>Oblicz wielkość cząstek za pomocą równania (1) (patrz Dyskusja).</li>
</ol>

<ol><li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li>
<li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li>
<li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnight%2C+A+%22Single+molecule+biology%22">Single molecule biology</a>. , Elsevier/Academic. (2009).</li>
<li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
<li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li>
<li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li>
<li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li>
<li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li>
<li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li>
<li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li>
<li>Åström, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%85str%C3%B6m%2C+KJ+%22Feedback+systems+%3A+an+introduction+for+scientists+and+engineers%22">Feedback systems : an introduction for scientists and engineers</a>. , Princeton University Press. (2008).</li>
<li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li>
<li>Su, T. -T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Label-free+detection+of+single+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%22">Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators</a>. , California Institute of Technology. (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wraz z wiązaniem cząsteczki długość fali rezonansowej (λ) toroidu zwiększa się. Jeśli cząsteczka odłączy się, długość fali rezonansowej odpowiednio maleje (zdarzenie skokowe w dół). Średnicę cząsteczki (d) można wyznaczyć za pomocą histogramów amplitudy każdego skoku długości fali. Wysokość każdego skoku długości fali różni się ze względu na różnice w rozmiarach związanej cząsteczki oraz miejsce na mikrotoroidzie, w którym cząsteczka się wiąże. Maksymalna zmiana długości fali rezonansowej (wysokość skok...

Eksperymenty z wykrywaniem pojedynczych cząsteczek są przydatne do zmniejszania ilości analitu używanego w biosensorach, do wczesnego wykrywania chorób i do badania podstawowych właściwości cząsteczek3. Takie eksperymenty są zwykle przeprowadzane przy użyciu znaczników, jednak nie zawsze jest możliwe uzyskanie znaczników dla określonego białka, zwiększa koszty, może zaburzać badane zdarzenia i może być niewygodne, szczególnie w przypadku eksperymentów w czasie rzeczywistym na miejscu lub diagnostyki w miejscu opieki nad pacjentem.
Obecnym złotym standardem dla biodetekcji bez znaczników jest powierzchniowy rezonans plazmonowy4, jednak komercyjne systemy powierzchniowego rezonansu plazmonowego zazwyczaj mają typową dolną granicę wykrywania rzędu nM. Ostatnio rezonatory optyczne stały się obiecującą technologią do bezznacznikowej biodetekcji pojedynczych cząsteczek5. Rezonatory optyczne działają w oparciu o długotrwałe (ns) uwięzienie światła6,7. Światło jest ulotnie sprzężone z tymi urządzeniami, zwykle za pomocą światłowodu. Gdy długość fali światła przechodzącego przez światłowód odpowiada długości fali rezonansowej rezonatora, światło efektywnie sprzęga się z rezonatorem. To sprzężone światło całkowicie wewnętrznie odbija się we wnęce rezonatora, generując ulotne pole w pobliżu obwodu rezonatora. Gdy cząstki wchodzą w pole ulotne i wiążą się z rezonatorem, długość fali rezonansowej rezonatora zmienia się proporcjonalnie do objętości cząstki8.
Jeśli chodzi o zdolność wykrywania, rezonatory mikrosferyczne były wcześniej używane do wykrywania pojedynczych cząsteczek wirusa grypy A (100 nm)9,10. Ostatnio plazmonicznie wzmocnione rezonatory optyczne mikrosfery zostały wykorzystane do wykrywania pojedynczych cząsteczek albuminy surowicy bydlęcej11 i 8-merowych oligonukleotydów12, jednak podejście to ogranicza obszar wychwytywania cząstek do 0,3μm2 na urządzenie. Bioczujniki o większym obszarze przechwytywania są idealne do maksymalizacji szansy na wykrycie cząstek. Obecne technologie biodetekcji oparte na rozwiązaniach, bez etykiet, z dużymi obszarami wychwytywania (> 100μm2) są ograniczone do wykrywania cząstek polistyrenu ≥ 25 nm.
Opracowaliśmy bezznacznikowy system biodetekcji oparty na technologii rezonatora optycznego, znanej jako Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER)13 (Rysunek 1), który jest zdolny do czasowego wykrywania pojedynczych cząsteczek w roztworze. FLOWER wykorzystuje długi czas życia fotonów mikrotoroidalnych rezonatorów optycznych w połączeniu z kontrolą sprzężenia zwrotnego z blokowaniem częstotliwości, zrównoważoną detekcją i filtrowaniem obliczeniowym do wykrywania małych cząstek aż do pojedynczych cząsteczek białka. Zastosowanie blokowania częstotliwości pozwala systemowi zawsze śledzić przesuwający się rezonans mikrotoroidu podczas wiązania cząstek, bez konieczności przemiatania lub skanowania długości fali lasera w dużych zakresach. Zasady FLOWER mogą być wykorzystane do zwiększenia możliwości wykrywania innych technik, w tym wzmacniania plazmonicznego. W dalszej części opisano procedury wykonywania FLOWER.

<table><tbody><tr><td>Przestrajalny laser diodowy</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler lasera</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler sprzężenia zwrotnego z blokadą częstotliwości</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>Automatycznie zbalansowany fotoodbiornik</td><td>Newport</td><td>Model 2007</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler polaryzacji in-line</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>24-bitowa karta akwizycji danych</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka interleukina-2</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki polistyrenowe 20 nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>Stół optyczny</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu do kolumny obrazowej</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna obrazowania (tubus adaptera)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD o wysokiej rozdzielczości do kolumny obrazowania</td><td>Edmund Industrial Optics</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

bezznacznikowa detekcja pojedynczych cząsteczek za pomocą mikrotoroidalnych rezonatorów optycznych

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Wykrywanie małych stężeń cząsteczek aż do limitu pojedynczej cząsteczki ma wpływ na takie obszary, jak wczesne wykrywanie chorób i podstawowe badania nad zachowaniem molekuł. Techniki wykrywania pojedynczych cząsteczek często wykorzystują etykiety, takie jak znaczniki fluorescencyjne lub kropki kwantowe, jednak znaczniki nie zawsze są dostępne, zwiększają koszty i złożoność oraz mogą zakłócać badane zdarzenia. Rezonatory optyczne okazały się obiecującym sposobem wykrywania pojedynczych cząsteczek bez użycia znaczników. Obecnie najmniejszą cząstką wykrytą przez niewzmocniony plazmonicznie system gołego rezonatora optycznego w roztworze jest kula z polistyrenu o długości fali25 nm 1. Opracowaliśmy technikę znaną jako Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER), która może przekroczyć ten limit i osiągnąć bezznacznikową detekcję pojedynczej cząsteczki w roztworze wodnym2. Ponieważ siła sygnału skaluje się wraz z ilością cząstek, nasze prace zapewniają > 100-krotną poprawę stosunku sygnału do szumu (SNR) w porównaniu z obecnym stanem techniki. Tutaj przedstawiono procedury stojące za FLOWER w celu zwiększenia jego wykorzystania w terenie.

Zdarzenia wiązania cząsteczek są wyraźnie widoczne jako skokowe zmiany długości fali rezonansowej mikrotoroidu w czasie (Rycina 2A). Wysokości tych skoków przedstawiono na histogramie na Rycynie 2B. Ryciny 2-4 pokazują reprezentatywne przebiegi dla wiązania odpowiednio egzosomów (nanopęcherzyków), kulek krzemionkowych o rozmiarze 5 nm oraz pojedynczych cząsteczek ludzkiej interleukiny-2. Fakt, że skala zdarzeń skokowych jest proporcjonalna do rozmiaru cząsteczek, świadcz...

Opracowaliśmy bezznacznikowy system biodetekcji oparty na technologii rezonatora optycznego, znanej jako Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER), który jest w stanie wykrywać pojedyncze cząsteczki w roztworze. Tutaj opisano i przedstawiono procedury stojące za tą pracą.

Bezznacznikowa detekcja pojedynczych cząsteczek za pomocą mikrotoroidalnych rezonatorów optycznych

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrywanie pojedynczych cząsteczek i ultra małych nanocząstek bez użycia znaczników, z wykorzystaniem techniki opartej na technologii rezonatora optycznego i blokowaniu częstotliwości. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biochemicznych, takich jak zwijanie białek i kinetyka wiązania. Główną zaletą tej techniki jest to, że cząsteczka docelowa nie musi być znakowana w celu jej wykrycia.Przygotowanie do tej techniki polega na połączeniu mikroczipu OID z włóknem optycznym. W pierwszej kolejności należy przygotować mikroczip OID. Jest to krzemowy czip o wymiarach około 6,5 mm na 5,5 mm z wykonanym na nim mikro OID.Jak widać na tym obrazie, mikro OID ma średnicę główną od 80 do 100 mikrometrów oraz średnicę pomocniczą wynoszącą dwa mikrometry. Na razie odłóż chip na bok i przygotuj światłowód w celu sprzęgnięcia go z chipem. Pracuj ze światłowodem jednomodowym na szpuli i rozwiń około metra włókna.Należy użyć ściągacza do izolacji i umieścić go mniej więcej w połowie rozwiniętego włókna. Za pomocą ściągacza należy usunąć odcinek powłoki polimerowej o długości 2,5 centymetra z włókna. Ten odsłonięty obszar stanowi region sprzęgający włókna.Po odizolowaniu włókna należy oczyścić ten obszar za pomocą bezpyłowej ściereczki i alkoholu izopropylowego. Następnie użyj uchwytu do włókien z zaciskami magnetycznymi, aby unieruchomić oczyszczony odcinek. W kolejnym kroku należy przygotować silniki krokowe w taki sposób, aby rozciągały włókno w przeciwnych kierunkach.Ustaw uchwyt do włókna tak, aby umożliwić przymocowanie silników krokowych do włókna po obu stronach obszaru z usuniętą izolacją. Dodatkowo podłącz laser do jednego końca włókna, aby służył jako źródło światła. Uruchom silniki krokowe, aby poruszały się w przeciwnych kierunkach w celu rozciągnięcia włókna, a następnie użyj palnika wodorowego, aby stopić pozbawioną izolacji część włókna. stale monitoruj światło rozproszone bocznie z włókna. Migotanie wskazuje, że transmisja światła przez włókno ulega wahaniom i wymagane jest dalsze zwężenie. Gdy migotanie ustanie, należy zaprzestać podgrzewania i wyciągania włókna, którego średnica powinna wynieść około 500 nanometrów.Po zwężeniu włókna odłącz źródło światła i zdejmij włókno wraz z jego magnetycznym uchwytem zaciskowym z silników krokowych. Następnie przenieś włókno na pneumatycznie izolowany stół wyposażony w stół pozycjonujący. Umieść włókno w magnetycznym uchwycie zaciskowym na bloku podpierającym przed chipem z próbką.Stoły pozycjonujące to trójosiowe nano-stoły pozycjonujące osadzone na trójosiowych mikrometrach. Oprócz nano-stołów pozycjonujących zastosowano kolumny obrazujące z widokiem z góry i z boku, aby ułatwić wyrównanie. Kontynuuj pracę z włóknem, upewniając się, że jego odizolowany fragment znajduje się w pobliżu stołu pozycjonującego.Przygotuj wolny koniec włókna do wprowadzenia do systemu pomiarowego. Po przecięciu wolnego końca, włóż je do adaptera do gołych włókien. Użyj adaptera, aby połączyć włókno z wejściem automatycznie balansowanego odbiornika fotoelektrycznego podłączonego do oscyloskopu.Teraz należy skupić się na drugim końcu włókna. Najpierw przyłącz ten koniec do sprzęgacza optycznego. Następnie połącz włókno z wyjściem polaryzatora liniowego, który otrzymuje sygnał wejściowy z dzielnika wiązki 50:50 oraz strojącego lasera diodowego ATT.Oto schemat połączeń wykonanych do tego momentu. Należy zauważyć, że drugie wyjście dzielnika wiązki przechodzi przez polaryzator liniowy i służy jako odniesienie dla automatycznie zbalansowanego odbiornika optycznego. Następnym krokiem jest przygotowanie do montażu mikrochipu OID przy użyciu uchwytu na próbki wykonanego ze stali nierdzewnej.Użyj dwustronnej taśmy klejącej, aby przymocować chip do uchwytu na próbkę. Następnie umieść mikrochip na uchwycie na próbkę. Teraz zamontuj uchwyt na próbkę z chipem na stole nanopozycyjnym.Tutaj uchwyt i chip znajdują się na stole pozycjonującym z mikrometem w trzech osiach X. Wykonaj wstępne pozycjonowanie chipu z próbką względem włókna. Tutaj przedstawiono chip i włókno po zakończeniu wstępnego pozycjonowania.Następnie należy dalej wyregulować pozycjoner i użyć kolumn obrazujących, aby ustawić chip równolegle do światłowodu. Przy mikro OID o długości fali lasera światłowodu, obraz ten przedstawia światłowód i mikrotor. Po etapie precyzyjnego pozycjonowania okrągły naklejką w pobliżu centrum pola widzenia służy jako pomoc w pozycjonowaniu. Teraz przejdź do wyszukiwania długości fali rezonansowej mikrostruktury.Wygeneruj sygnał napięcia o przebiegu trójkątnym, aby regulować długość fali lasera w zakresie około 635 nm ± 2,5 nm. Następnie wykonaj skanowanie długości fal w celu poszukiwania rezonansu. Obserwuj transmisję przez światłowód na oscyloskopie.Należy zauważyć, że przy długości fali rezonansowej transmitancja spada. W tym momencie należy dostroić polaryzację światła laserowego. Dostosuj liniowe kontrolery polaryzacji, aby zoptymalizować polaryzację światła laserowego w światłowodzie.Obserwuj sygnał z fotoprzyspiewacza za pomocą oscyloskopu i reguluj polaryzację, aż zmierzony spadek transmitancji stanie się jak najwęższy. Po zoptymalizowaniu polaryzacji zbuduj komorę próbki na stoliku z próbką.Komora składa się z szkiełka nakrywkowego przyklejonego żywicą epoksydową do fragmentu przedmiotu szkiełka. Przedmiot szkiełka pełni rolę dystansera, umożliwiając wystawanie szkiełka nakrywkowego poza obszar chipa i włókna. Przygotuj pompę strzykawkową o pojemności 1 mL oraz przewody do wprowadzania próbek eksperymentalnych do komory z prędkością 1 mL na minutę.Następnie przygotuj próbkę o objętości 1 ml wyrównaną do temperatury pokojowej, aby załadować ją do pompy. W tym przypadku jest to roztwór z nanokuleczkami krzemionkowymi o średnicy 5 nm. Po załadowaniu obserwuj komorę próbki i wstrzykuj próbkę. Po wypełnieniu komory proces wstrzykiwania próbki do tej komory, wypełnionej roztworem zawierającym nanokuleczki krzemionkowe o średnicy 5 nm, zostaje zakończony.Po odczekaniu 30 sekund w celu zminimalizowania wpływu wibracji, należy wyszukać długość fali rezonansowej mikrorezonatora. Ponownie zaobserwuj spadek oraz transmisję przez światłowód w stanie rezonansu przy użyciu oscyloskopu. Jest to schemat układu eksperymentalnego na tym etapie, obejmujący regulator proporcjonalno-całkująco-różniczkujący, czyli kontroler PID.Integrator i dither. Uruchom kontroler w trybie auto lock z blokowaniem na szczycie piku. Ustaw częstotliwość dither na 2 kHz oraz amplitudę oscylacji długości fali na 19 fm.Po empirycznym ustaleniu ustawień PID automatycznie zablokuj długość fali lasera na długości fali rezonansowej mikro-oidu. Zbierz dane, rejestrując sygnał wyjściowy kontrolera sprzężenia zwrotnego. Poniżej przedstawiono reprezentatywne przebiegi przesunięcia rezonansowego w femtometrach w funkcji czasu w sekundach, uzyskane zgodnie z protokołem z użyciem trzech różnych cząstek wiążących, uszeregowanych według wielkości.Cząsteczki to egzosomy lub nanopęcherzyki. Pięciometrowe kulki krzemionkowe oraz cząsteczki ludzkiej interleukiny 2. Należy zwrócić uwagę na różne skale osi pionowej i poziomej w każdym zbiorze danych.Obserwacja różnych skal w danych dla różnych rozmiarów cząsteczek wskazuje na prawidłowe wykonanie techniki. Gdy cząsteczka wiąże się z OID, długość fali rezonansowej OID zwiększa się, co powoduje skok w górę na wykresie. Gdy cząsteczka odrywa się, długość fali rezonansowej zmniejsza się, prowadząc do skoku w dół.Wysokość każdego stopnia długości fali jest określona przez rozmiar cząstki oraz jej położenie na mikro-OID. Skale czasowe są determinowane przez dynamikę OID cząstki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około trzy godziny, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procesu. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby dbać o maksymalną czystość i unikanie zanieczyszczeń kurzem.

label-free-single-molecule-detection-using-microtoroid-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Biosensory współpracują ze złożonymi środowiskami biologicznymi i przeprowadzają ukierunkowaną detekcję, łącząc wysokoczułe czujniki z wysoce specyficznymi sondami przytwierdzonymi do czujnika poprzez modyfikację powierzchni. W niniejszym materiale demonstrujemy funkcjonalizację powierzchni krzemionkowych czujników optycznych biotyną przy użyciu czynników sprzęgających na bazie silanów w celu stworzenia pomostu między czujnikiem a środowiskiem biologicznym.

Przyłączanie sond biologicznych do krzemionkowych biosensorów optycznych z użyciem silanowych środków sprzęgających

Opisujemy zastosowanie techniki przetapiania laserem dwutlenku węgla do wytwarzania krzemionkowych wnęk rezonansowych, w tym wolnostojących mikrosfer oraz mikrotoroidów na chipie. Metoda przetapiania usuwa niedoskonałości powierzchni, co pozwala na uzyskanie długiego czasu życia fotonów w obu typach urządzeń. Powstałe urządzenia charakteryzują się ultrawysokimi dobrociami, co umożliwia ich zastosowanie w szerokim zakresie, od telekomunikacji po biodetekcję.

Wytwarzanie krzemionkowych mikrorozwiązujących o ultrawysokim czynniku dobroci

Ten film pokazuje zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonów w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki. Wykorzystując układ mikroprzepływowy i plazmoniczny chip nanostrukturalny związany z peptydami, zmiany natężenia światła odbitego pod kątem rezonansu ujawniają interakcje z wydzielanymi białkami z pojedynczej komórki.

Zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki

Czujniki mikrownękowe z rdzeniem fluorescencyjnym wykorzystują powłokę z kropek kwantowych o wysokim indeksie w kanale mikrokapilar krzemionkowych. Zmiany współczynnika załamania światła płynów pompowanych do kanału kapilarnego powodują przesunięcia w widmie fluorescencji mikrownęki, które można wykorzystać do analizy ośrodka kanałowego.

Synteza i działanie mikrownęk z rdzeniem fluorescencyjnym w detekcji refraktometrycznej

Referencyjna technika interferometryczna, która ma na celu usuwanie niepożądanych zakłóceń laserowych dla nanodetekcji, jest wykorzystywana do sondowania mikrownęk czynnikowych o ultra wysokiej jakości. Instrukcje dotyczące montażu, konfiguracji i pozyskiwania danych są dostarczane wraz z procesem pomiaru w celu określenia współczynnika jakości gniazda.

Implementacja interferometru referencyjnego do nanodetekcji

Parametryczne wzbudzenia optomechaniczne zostały ostatnio eksperymentalnie zademonstrowane w mikroprzepływowych rezonatorach optomechanicznych za pomocą ciśnienia promieniowania optycznego i stymulowanego rozpraszania Brillouina. W artykule opisano wytwarzanie tych rezonatorów mikroprzepływowych wraz z metodologiami generowania i weryfikacji oscylacji optomechanicznych.

Produkcja i testowanie mikroprzepływowych oscylatorów optomechanicznych

Skalowalność i rozdzielczość konwencjonalnych technik manipulacji optycznej są ograniczone przez dyfrakcję. Obchodzimy granicę dyfrakcji i opisujemy metodę optycznego transportu nanocząstek przez chip za pomocą złotej powierzchni z wzorem ścieżki blisko rozmieszczonych rezonatorów plazmonicznych w kształcie litery C.

Produkcja i eksploatacja nanooptycznego przenośnika taśmowego

Wielokolorowa detekcja fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej zazwyczaj obejmuje nieporęczne i złożone systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym. Tutaj opisujemy kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej, który wykorzystuje szereg światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych zebranych przez pojedynczy fotodetektor.

Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

W tym artykule prześledzono cykl życia rezonatora membranowego z azotku krzemu, od projektu, przez produkcję, aż po charakterystykę.

Wytwarzanie i charakterystyka rezonatorów membranowych z azotku krzemu o wysokiej zawartości Q

Poznaj bezznacznikową detekcję pojedynczych cząsteczek za pomocą mikrotoroidalnych rezonatorów optycznych FLOWER. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki wiązań białek bez etykietowania.

Bezznacznikowa detekcja pojedynczych cząsteczek za pomocą mikrotoroidalnych rezonatorów optycznych

Przeglądaj więcej filmów