Bezznacznikowa detekcja pojedynczych cząsteczek za pomocą mikrotoroidalnych rezonatorów optycznych
December 29th, 2015
Opracowaliśmy bezznacznikowy system biodetekcji oparty na technologii rezonatora optycznego, znanej jako Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER), który jest w stanie wykrywać pojedyncze cząsteczki w roztworze. Tutaj opisano i przedstawiono procedury stojące za tą pracą.
Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie pojedynczych cząsteczek i ultra małych nanocząstek bez użycia znaczników przy użyciu techniki opartej na technologii rezonatora optycznego i blokowaniu częstotliwości. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinach biochemicznych, takich jak fałdowanie białek i kinetyka wiązania. Główną zaletą tej techniki jest to, że cząsteczka docelowa nie musi być znakowana, aby ją wykryć.
Przygotowanie do tej techniki polega na sprzężeniu mikro chipa OID ze światłowodem. Najpierw zaopatrz się w mikro chip OID. Jest to krzemowy chip o wymiarach około 6,5 milimetra na 5,5 milimetra z wytworzonym na nim mikro OID.
Podobnie jak na tym obrazie, mikro OID ma główną średnicę od 80 do 100 mikrometrów i mniejszą średnicę dwóch mikrometrów. Na razie odłóż chip na bok i przygotuj światłowód, aby połączyć chip. Pracuj ze światłowodem jednomodowym na szpuli i rozwiń około metra światłowodu.
Zaopatrz się w ściągacze izolacji i mniej więcej w środku odwijania włókna. Użyj ich, aby usunąć 2,5-centymetrowy odcinek powłoki polimerowej z włókna. Ten pozbawiony obszar jest obszarem sprzęgającym światłowodu.
Po usunięciu włókna użyj niestrzępiącej się chusteczki i alkoholu izopropanolowego, aby oczyścić usunięty obszar. Następnie użyj uchwytu na włókno z zaciskami magnetycznymi, aby przytrzymać oczyszczoną część na miejscu. W następnym kroku ustaw silniki krokowe tak, aby ciągnęły włókno w przeciwnych kierunkach.
Ustaw uchwyt światłowodu tak, aby umożliwić przymocowanie silników krokowych do światłowodu po obu stronach odizolowanego obszaru. Ponadto przymocuj laser do jednego końca światłowodu, aby służył jako źródło światła. Uruchom silniki krokowe poruszające się w przeciwnych kierunkach, aby rozciągnąć włókno i użyj palnika wodorowego, aby stopić odizolowaną część włókna.
Stale monitoruj światło rozproszone bocznie od światłowodu. wskazuje, że przepuszczalność światła przez włókno ulega wahaniom i potrzebne jest większe rozcieńczenie. Gdy mruganie ustanie, przestań się nagrzewać i ciągnąć światłowód, który będzie cienki do około 500 nanometrów.
Po rozcieńczeniu światłowodu odłącz źródło światła i wyjmij włókno oraz jego magnetyczny uchwyt zaciskowy z upartych silników. Następnie przenieś światłowód do pneumatycznie izolowanej ławki wyposażonej w stolik pozycjonujący. Umieść włókno w magnetycznym uchwycie zaciskowym na bloku nośnym przed chipem próbki.
Stopień pozycjonowania to trzyosiowy nano stopień pozycjonowania na szczycie trójosiowego mikrometru. Oprócz etapu pozycjonowania nano dostępne są kolumny obrazowania z góry i z boku, które pomagają w wyrównaniu. Kontynuuj pracę z włóknem, upewniając się, że jego odizolowana część znajduje się w pobliżu etapu pozycjonowania.
Przygotuj się do wprowadzenia wolnego końca włókien do systemu pomiarowego. Po rozcięciu wolnego końca włóż go do gołego adaptera światłowodowego. Użyj adaptera, aby podłączyć światłowód do wejścia automatycznie zbalansowanego odbiornika fotograficznego podłączonego do oscyloskopu.
Teraz skup się na drugim końcu włókna. Najpierw podłącz ten koniec do sprzęgacza optycznego. Następnie połącz światłowód z wyjściem polaryzatora liniowego, który ma dane wejściowe z rozdzielacza wiązki 50 50 i dostrajalnego lasera diodowego ATT.
Poniżej znajduje się schemat połączeń wykonanych do tego momentu. Należy pamiętać, że drugie wyjście rozdzielacza wiązki przechodzi przez wbudowany polaryzator i jest używane jako odniesienie dla automatycznie zbalansowanego odbiornika zdjęć. Następnym krokiem jest przygotowanie się do montażu chipa micro OID za pomocą uchwytu na próbki ze stali nierdzewnej.
Użyj taśmy dwustronnej, aby przymocować chip do uchwytu próbki. Następnie umieść mikrochip na uchwycie na próbkę. Teraz zamontuj uchwyt na próbkę z chipem na górze stolika do pozycjonowania nano.
Tutaj uchwyt i chip są na miejscu na stoliku pozycjonującym za pomocą trzech mikrometrów Xs. Zgrubne położenie, chip próbki w stosunku do włókna. Oto chip i światłowód po zakończeniu pozycjonowania kursu.
Następnie dalej wyreguluj pozycjoner i użyj kolumn obrazowania, aby wyrównać chip równolegle do światłowodu W przypadku mikro OID z długością fali lasera światłowodu, obraz ten przedstawia światłowód i mikrot. Po precyzyjnym kroku pozycjonowania, okrągła naklejka w pobliżu środka pola view jest pomocą w pozycjonowaniu. Teraz przejdź do poszukiwania długości fali rezonansowej mikro.
Wygeneruj trójkątny sygnał napięciowy o kształcie fali, aby regulować długość fali lasera na około 635 nanometrach plus minus 2,5 nanometra. Teraz przeskanuj długości fal w poszukiwaniu rezonansu. Obserwuj transmisję przez światłowód na oscyloskopie.
Należy zauważyć, że przy długości fali rezonansowej transmisja spada. W tym momencie pracuj nad dostosowaniem polaryzacji światła laserowego. Dostosuj wbudowane kontrolery polaryzacji, aby zoptymalizować polaryzację światła laserowego w światłowodzie.
View wyjście odbiornika fotograficznego za pomocą oscyloskopu i dostosuj polaryzację, aż zmierzone zanurzenie transmisji będzie najwęższe. Po zoptymalizowaniu polaryzacji skonstruuj komorę na próbkę. Na etapie próbki.
Komora składa się ze szklanego szkiełka nakrywkowego epoksydowego do kawałka mikroskopu. Zjeżdżalnia. Suwak działa jak przekładka, dzięki czemu szkiełko nakrywkowe zwisa z wióra i włókna. Ułóż jednomililitrową pompę strzykawkową i rurkę, aby wprowadzać próbki eksperymentalne do komory w tempie jednego mililitra na minutę.
Następnie uzyskaj jednomililitrową próbkę o zrównoważonej temperaturze pokojowej, aby załadować ją do pompy. W tym przypadku jest to roztwór z pięcioma nanometrowymi kulkami krzemionkowymi. Po załadowaniu obserwuj komorę na próbkę i wstrzyknij próbkę Zatrzymując się po napełnieniu komory, wstrzykiwanie próbki zostało zatrzymane w tej komorze, która jest wypełniona roztworem zawierającym pięć nanometrowych kulek krzemionkowych.
Po odczekaniu 30 sekund, aby zminimalizować efekt wibracji, poszukaj długości fali rezonansowej mikro. Ponownie obserwuj zanurzenie i transmisję przez światłowód w rezonansie za pomocą oscyloskopu. Jest to schemat układu eksperymentalnego w tym momencie, w tym proporcjonalnej pochodnej całkowej lub regulatora PID.
Integrator i roztrząsanie. Uruchom kontroler w trybie automatycznej blokady z blokowaniem górnej części szczytu. Ustaw częstotliwość roztrząsania na dwa kiloherce i ustaw amplitudę oscylacji długości fali na 19 femtometrów.
Po empirycznym znalezieniu ustawień PID automatycznie zablokuj długość fali lasera do długości fali rezonansowej mikrooidu. Zbieraj dane, rejestrując dane wyjściowe sterownika sprzężenia zwrotnego. Oto reprezentatywne ślady przesunięcia rezonansu w femtometrach w funkcji czasu w sekundach wytworzone za pomocą protokołu wykorzystującego trzy różne cząstki wiążące w kolejności wielkości.
Cząstki są egzosomami lub nanopęcherzykami. Pięć nanometrowych kulek krzemionkowych i dwie cząsteczki ludzkiej interleukiny. Zwróć uwagę na różne skale zarówno pionowych, jak i poziomych zdarzeń AE w każdym zestawie danych.
Obserwowanie różnych skal w danych dla różnych rozmiarów cząstek wskazuje, że technika została wykonana prawidłowo. Kiedy cząstka wiąże się z oidem, długość fali rezonansowej OID wzrasta, powodując wzrost śladu. Kiedy cząstka się rozwiązuje, długość fali rezonansowej zmniejsza się, co prowadzi do zejścia w dół.
Wysokość każdego kroku długości fali zależy od wielkości cząstki i jej położenia na mikrooidzie. Skale czasowe są określane przez dynamikę OID cząstek Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około trzech godzin, jeśli zostanie wykonana poprawnie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wszystko było tak czyste i wolne od kurzu, jak to tylko możliwe.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia system biosensorowy bez etykiet wykorzystujący technologię Częstotliwościowego Blokowania Optycznego Rezonatora Ewanescencyjnego (FLOWER) do wykrywania pojedynczych cząsteczek w roztworze. Opisana metoda umożliwia wykrywanie ultra-małych nanocząstek bez konieczności stosowania etykiet, co odpowiada na istotne pytania w badaniach biochemicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Nanotechnologia
- Sensoryczne wykrywanie optyczne
Tło
- Wykrywanie pojedynczych cząsteczek jest kluczowe dla zrozumienia procesów biochemicznych.
- Tradycyjne metody często wymagają etykietowania, co może zmieniać zachowanie cząsteczek.
- Technologia rezonatora optycznego oferuje nowatorskie podejście do biosensorów.
- Blokowanie częstotliwości zwiększa czułość i specyficzność wykrywania.
Cel badania
- Opracowanie metody wykrywania pojedynczych cząsteczek bez etykiet.
- Poprawa rozumienia kinetyki fałdowania i wiązania białek.
- Dostarczenie niezawodnej techniki do analizy biochemicznej.
Stosowane metody
- Wykorzystanie mikro chipu OID połączonego z światłowodem.
- Blokowanie częstotliwości w celu zwiększenia zdolności wykrywczych.
- Wykrywanie bez etykiet celowych cząsteczek.
- Ustawienie eksperymentalne obejmujące produkcję krzemu mikro OID.
Główne wyniki
- Sukces w wykrywaniu pojedynczych cząsteczek w roztworze.
- Demonstracja zalet biosensorów bez etykiet.
- Wgląd w zachowanie ultra-małych nanocząstek.
- Potencjalne zastosowania w różnych dziedzinach biochemii.
Wnioski
- System FLOWER reprezentuje znaczący postęp w technologii biosensorów.
- Wykrywanie bez etykiet otwiera nowe kierunki badań w biochemii.
- Ta metoda może ułatwić dalsze badania nad interakcjami molekularnymi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators addresses a critical bottleneck in early discovery by enabling direct, non-perturbative measurement of molecular interactions. This capability enhances predictive confidence in target validation and mechanistic studies, supporting risk-adjusted portfolio decisions. The FLOWER technique's sensitivity and label-free operation position it as a reusable platform for high-value R&D inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of molecular binding and folding without label-induced artifacts.
- Supports mechanistic de-risking by providing real-time, quantitative detection of single molecule events.
- Improves predictive confidence in target engagement and pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, label-free assay systems for downstream compound screening.
- Delivers quantitative, reproducible readouts suitable for standardization across discovery teams.
- Enables rapid assessment of molecular interactions for screening readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting detection of disease-relevant biomolecules.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling sensitive, label-free detection in complex matrices.
- Reduces biological risk in preclinical advancement through robust, artifact-free measurement.
Pipeline & Workflow Integration
The FLOWER method integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting hypothesis testing and mechanistic validation before preclinical transition.
- Discovery Biology: Advances hypothesis-driven research by enabling direct measurement of molecular events.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative outputs for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates high signal-to-noise resonance shift data for comparative analysis of binding events.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity across discovery and preclinical phases.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, label-free detection platform adaptable to diverse molecular targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes detection workflows and enhances reproducibility across R&D teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical resonator setup and precision alignment.
- Demands access to specialized instrumentation, including microtoroid chips and frequency locking controllers.
- Necessitates rigorous cleanliness and dust control to maintain sensitivity.
- May require adaptation for different molecular targets or sample matrices.
- Operational throughput and scalability depend on technical proficiency and infrastructure.
