Bezznacznikowa detekcja pojedynczych cząsteczek za pomocą mikrotoroidalnych rezonatorów optycznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrywanie pojedynczych cząsteczek i ultra małych nanocząstek bez użycia znaczników, z wykorzystaniem techniki opartej na technologii rezonatora optycznego i blokowaniu częstotliwości. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biochemicznych, takich jak zwijanie białek i kinetyka wiązania. Główną zaletą tej techniki jest to, że cząsteczka docelowa nie musi być znakowana w celu jej wykrycia.

Przygotowanie do tej techniki polega na połączeniu mikroczipu OID z włóknem optycznym. W pierwszej kolejności należy przygotować mikroczip OID. Jest to krzemowy czip o wymiarach około 6,5 mm na 5,5 mm z wykonanym na nim mikro OID.

Jak widać na tym obrazie, mikro OID ma średnicę główną od 80 do 100 mikrometrów oraz średnicę pomocniczą wynoszącą dwa mikrometry. Na razie odłóż chip na bok i przygotuj światłowód w celu sprzęgnięcia go z chipem. Pracuj ze światłowodem jednomodowym na szpuli i rozwiń około metra włókna.

Należy użyć ściągacza do izolacji i umieścić go mniej więcej w połowie rozwiniętego włókna. Za pomocą ściągacza należy usunąć odcinek powłoki polimerowej o długości 2,5 centymetra z włókna. Ten odsłonięty obszar stanowi region sprzęgający włókna.

Po odizolowaniu włókna należy oczyścić ten obszar za pomocą bezpyłowej ściereczki i alkoholu izopropylowego. Następnie użyj uchwytu do włókien z zaciskami magnetycznymi, aby unieruchomić oczyszczony odcinek. W kolejnym kroku należy przygotować silniki krokowe w taki sposób, aby rozciągały włókno w przeciwnych kierunkach.

Ustaw uchwyt do włókna tak, aby umożliwić przymocowanie silników krokowych do włókna po obu stronach obszaru z usuniętą izolacją. Dodatkowo podłącz laser do jednego końca włókna, aby służył jako źródło światła. Uruchom silniki krokowe, aby poruszały się w przeciwnych kierunkach w celu rozciągnięcia włókna, a następnie użyj palnika wodorowego, aby stopić pozbawioną izolacji część włókna.

stale monitoruj światło rozproszone bocznie z włókna. Migotanie wskazuje, że transmisja światła przez włókno ulega wahaniom i wymagane jest dalsze zwężenie. Gdy migotanie ustanie, należy zaprzestać podgrzewania i wyciągania włókna, którego średnica powinna wynieść około 500 nanometrów.

Po zwężeniu włókna odłącz źródło światła i zdejmij włókno wraz z jego magnetycznym uchwytem zaciskowym z silników krokowych. Następnie przenieś włókno na pneumatycznie izolowany stół wyposażony w stół pozycjonujący. Umieść włókno w magnetycznym uchwycie zaciskowym na bloku podpierającym przed chipem z próbką.

Stoły pozycjonujące to trójosiowe nano-stoły pozycjonujące osadzone na trójosiowych mikrometrach. Oprócz nano-stołów pozycjonujących zastosowano kolumny obrazujące z widokiem z góry i z boku, aby ułatwić wyrównanie. Kontynuuj pracę z włóknem, upewniając się, że jego odizolowany fragment znajduje się w pobliżu stołu pozycjonującego.

Przygotuj wolny koniec włókna do wprowadzenia do systemu pomiarowego. Po przecięciu wolnego końca, włóż je do adaptera do gołych włókien. Użyj adaptera, aby połączyć włókno z wejściem automatycznie balansowanego odbiornika fotoelektrycznego podłączonego do oscyloskopu.

Teraz należy skupić się na drugim końcu włókna. Najpierw przyłącz ten koniec do sprzęgacza optycznego. Następnie połącz włókno z wyjściem polaryzatora liniowego, który otrzymuje sygnał wejściowy z dzielnika wiązki 50:50 oraz strojącego lasera diodowego ATT.

Oto schemat połączeń wykonanych do tego momentu. Należy zauważyć, że drugie wyjście dzielnika wiązki przechodzi przez polaryzator liniowy i służy jako odniesienie dla automatycznie zbalansowanego odbiornika optycznego. Następnym krokiem jest przygotowanie do montażu mikrochipu OID przy użyciu uchwytu na próbki wykonanego ze stali nierdzewnej.

Użyj dwustronnej taśmy klejącej, aby przymocować chip do uchwytu na próbkę. Następnie umieść mikrochip na uchwycie na próbkę. Teraz zamontuj uchwyt na próbkę z chipem na stole nanopozycyjnym.

Tutaj uchwyt i chip znajdują się na stole pozycjonującym z mikrometem w trzech osiach X. Wykonaj wstępne pozycjonowanie chipu z próbką względem włókna. Tutaj przedstawiono chip i włókno po zakończeniu wstępnego pozycjonowania.

Następnie należy dalej wyregulować pozycjoner i użyć kolumn obrazujących, aby ustawić chip równolegle do światłowodu. Przy mikro OID o długości fali lasera światłowodu, obraz ten przedstawia światłowód i mikrotor. Po etapie precyzyjnego pozycjonowania okrągły naklejką w pobliżu centrum pola widzenia służy jako pomoc w pozycjonowaniu. Teraz przejdź do wyszukiwania długości fali rezonansowej mikrostruktury.

Wygeneruj sygnał napięcia o przebiegu trójkątnym, aby regulować długość fali lasera w zakresie około 635 nm ± 2,5 nm. Następnie wykonaj skanowanie długości fal w celu poszukiwania rezonansu. Obserwuj transmisję przez światłowód na oscyloskopie.

Należy zauważyć, że przy długości fali rezonansowej transmitancja spada. W tym momencie należy dostroić polaryzację światła laserowego. Dostosuj liniowe kontrolery polaryzacji, aby zoptymalizować polaryzację światła laserowego w światłowodzie.

Obserwuj sygnał z fotoprzyspiewacza za pomocą oscyloskopu i reguluj polaryzację, aż zmierzony spadek transmitancji stanie się jak najwęższy. Po zoptymalizowaniu polaryzacji zbuduj komorę próbki na stoliku z próbką.

Komora składa się z szkiełka nakrywkowego przyklejonego żywicą epoksydową do fragmentu przedmiotu szkiełka. Przedmiot szkiełka pełni rolę dystansera, umożliwiając wystawanie szkiełka nakrywkowego poza obszar chipa i włókna. Przygotuj pompę strzykawkową o pojemności 1 mL oraz przewody do wprowadzania próbek eksperymentalnych do komory z prędkością 1 mL na minutę.

Następnie przygotuj próbkę o objętości 1 ml wyrównaną do temperatury pokojowej, aby załadować ją do pompy. W tym przypadku jest to roztwór z nanokuleczkami krzemionkowymi o średnicy 5 nm. Po załadowaniu obserwuj komorę próbki i wstrzykuj próbkę. Po wypełnieniu komory proces wstrzykiwania próbki do tej komory, wypełnionej roztworem zawierającym nanokuleczki krzemionkowe o średnicy 5 nm, zostaje zakończony.

Po odczekaniu 30 sekund w celu zminimalizowania wpływu wibracji, należy wyszukać długość fali rezonansowej mikrorezonatora. Ponownie zaobserwuj spadek oraz transmisję przez światłowód w stanie rezonansu przy użyciu oscyloskopu. Jest to schemat układu eksperymentalnego na tym etapie, obejmujący regulator proporcjonalno-całkująco-różniczkujący, czyli kontroler PID.

Integrator i dither. Uruchom kontroler w trybie auto lock z blokowaniem na szczycie piku. Ustaw częstotliwość dither na 2 kHz oraz amplitudę oscylacji długości fali na 19 fm.

Po empirycznym ustaleniu ustawień PID automatycznie zablokuj długość fali lasera na długości fali rezonansowej mikro-oidu. Zbierz dane, rejestrując sygnał wyjściowy kontrolera sprzężenia zwrotnego. Poniżej przedstawiono reprezentatywne przebiegi przesunięcia rezonansowego w femtometrach w funkcji czasu w sekundach, uzyskane zgodnie z protokołem z użyciem trzech różnych cząstek wiążących, uszeregowanych według wielkości.

Cząsteczki to egzosomy lub nanopęcherzyki. Pięciometrowe kulki krzemionkowe oraz cząsteczki ludzkiej interleukiny 2. Należy zwrócić uwagę na różne skale osi pionowej i poziomej w każdym zbiorze danych.

Obserwacja różnych skal w danych dla różnych rozmiarów cząsteczek wskazuje na prawidłowe wykonanie techniki. Gdy cząsteczka wiąże się z OID, długość fali rezonansowej OID zwiększa się, co powoduje skok w górę na wykresie. Gdy cząsteczka odrywa się, długość fali rezonansowej zmniejsza się, prowadząc do skoku w dół.

Wysokość każdego stopnia długości fali jest określona przez rozmiar cząstki oraz jej położenie na mikro-OID. Skale czasowe są determinowane przez dynamikę OID cząstki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około trzy godziny, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procesu. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby dbać o maksymalną czystość i unikanie zanieczyszczeń kurzem.