Name: Wykorzystanie wielokompartmentowego dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu do badań hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę pomiaru konwersji hiperpolaryzowanego pirogronianu do mleczanu przy użyciu rezonansu magnetycznego w kontrolowanym środowisku fantomu. Technika ta umożliwia badanie procesów metabolicznych istotnych dla diagnostyki nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RP140021-P5), nagrodę Julia Jones Matthews Cancer Research Scholar CPRIT Research Award (RP140106, CMW) oraz National Institutes of Health (P30-CA016672).

UWAGA: (Phantom Design) Dwie komory o pojemności 3 ml zostały wykonane z Ultema i wyposażone w rurki PEEK (1,5875 mm średnicy zewnętrznej i 0,762 mm średnicy) do wtrysku i wydechu. Komory umieszczono w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej wodą (ryc. 1). Aby uniknąć pustek sygnałowych tworzonych przez pęcherzyki, komory i przewody zostały wstępnie wypełnione wodą dejonizowaną (dH2O).
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotować 1 l roztworu buforowego (81,3 mM Tris pH 7,6, 203,3 mM NaCl). Odważyć 11,38 g wstępnie ustawionych kryształów Trizma o pH 7,6 i 11,88 g NaCl i rozpuścić w 1 l dH2O.</li>
	<li>Przygotuj 50 mM roztwór NADH. Odważyć 17,8 mg dinukleotydu β-nikotynamidoadeninowego (NADH), zredukowanej soli dipotasowej i rozpuścić w 280 μl roztworu buforowego, który został przygotowany w kroku pierwszym.</li>
	<li>Przygotować roztwór enzymatyczny o stężeniu 250 j./ml. Odważyć 78,75 jednostek aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i rozpuścić w buforze o stężeniu 315 μl z kroku pierwszego.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę kwasu pirogronowego. Odważyć 21,4 mg rodnika trytylowego Ox063 i rozpuścić w 1,26 g (~1 ml) [1-13C] kwasu pirogronowego.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do usuwania (40 mM Tris pH 7,6, 40 mM NaOH, 0,27 mM EDTA i 50 mM NaCl). Odważyć 5,96 g wstępnie ustawionych kryształów Trizma o pH 7,6, 1,6 g NaOH, 0,1 g odwodnionej soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 2,9 g NaCl i rozpuścić w 1 l dH2O.</li>
	<li>Przygotować roztwór gadoteridolu w stosunku 1:10 (50 mM). Zmieszać 1 μl gadoteridolu z 9 μl dH2O. Przygotowanie 8 M [13C] mocznika. Odważyć 1,465 5 [13C] mocznika i rozpuścić w 3 ml dH2O.</li>
</ol>
2. Przygotowanie hiperspolaryzowanego pirogronianu
<ol>
	<li>W kubku na próbkę do systemu dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) odpipetować 0,3 μl roztworu gadoteridolu i 13 mg (~10 μl) roztworu kwasu pirogronowego.</li>
	<li>Krótko wymieszać tę mieszaninę w kubku na próbkę za pomocą końcówki pipety.</li>
	<li>Wstaw próbkę do systemu DNP.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że drzwi do systemu DNP są zamknięte. Rozpocznij proces wstawiania próbki, klikając przycisk wstawiania próbki w konsoli systemowej DNP. W kreatorze próbek wybierz normalną próbkę i naciśnij przycisk dalej.</li>
		<li>Trzymając kubek na próbkę w pozycji pionowej, delikatnie umieść pręt wprowadzający na górze kubka na próbkę. Po wyświetleniu monitu otwórz system DNP i włóż kubek do wkładki o zmiennej temperaturze (VTI) za pomocą pręta wprowadzającego.</li>
		<li>Pociągnąć za tłok znajdujący się na końcu pręta wprowadzającego próbkę, aby uwolnić próbkę o zmiennym wskaźniku temperatury. Wyjmij pręt wprowadzający próbkę z systemu i kliknij przycisk Dalej na konsoli systemowej DNP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainicjuj polaryzację.
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk rozpoczęcia polaryzacji na konsoli systemu DNP. W oprogramowaniu RINMR wpisz . HYPERSENSENMR w celu uruchomienia oprogramowania do monitorowania polaryzacji. Ustaw konfigurację kompilacji na 1 i naciśnij enter. Następnie kliknij solidną budowę.</li>
		<li>Ustaw lokalizację i nazwę pliku zapisu. Wybierz profil dla 13-C z rozwijanej zakładki w konsoli systemowej DNP i kliknij Dalej. Zaznacz pole wyboru do pobierania próbek podczas narastania, ustaw czas próbkowania na 300 sekund i kliknij przycisk Zakończ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odmierzyć 3,85 g (~ 4 ml) roztworu do rozpuszczania objętościowo za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml lub wagowo za pomocą wagi.</li>
</ol>
3. Przygotowanie fantomu enzymu
<ol>
	<li>Napełnij probówkę do mikrowirówki ~3 ml [13C] roztworu mocznika i umieść ją w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Napełnić probówkę wirówkową o pojemności 50 ml dH2O.</li>
	<li>Wstępnie napełnić dwie komory enzymatyczne i przewodydH2O, wstrzykując ~3 mldH2Odo przewodów iniekcyjnych fantomu, uważając, aby wypłukać wszelkie powstałe pęcherzyki.</li>
	<li>Umieść fantom na środku magnesu z łatwym dostępem do przewodów wtryskowych. Upewnij się, że jest jakiś pojemnik do złapania płynu, który będzie odprowadzał się do przewodu wydechowego.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę enzymów o wysokiej aktywności (17,14 mM NADH, 44,57 U/ml LDH). Zmieszać 240 μl roztworu NADH, 125 μl roztworu LDH i 335 μl buforu i przechowywać w strzykawce o pojemności 3 ml, którą można podłączyć do przewodu iniekcyjnego. 
	UWAGA: Po połączeniu z 500 μl 40 mM pirogronianu z systemu DNP, końcowa objętość fantomu wyniesie 1,2 ml przy stężeniach 16,7 mM pirogronianu, 10 mM NADH i 26 U/L LDH w roztworze buforowanym tris o pH ~ 7,5.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę enzymów o niskiej aktywności (17,14 mM NADH 26,79 U/ml LDH) Wymieszać 240 μl roztworu NADH, 75 μl roztworu LDH i 385 μl buforu i przechowywać w oddzielnej strzykawce o pojemności 3 ml, którą można podłączyć do przewodu iniekcyjnego. 
	UWAGA: Po połączeniu z 500 μl 40 mM pirogronianu z systemu DNP końcowa objętość fantomu wyniesie 1,2 ml przy stężeniach 16,7 mM pirogronianu, 10 mM NADH i 15,625 U/L LDH w roztworze buforowym tris o pH ~ 7,5.</li>
</ol>
4. Uruchom dowolne skanowanie kontroli jakości (QA) i pozycjonowania
<ol>
	<li>Pozycjonowanie początkowe.
	<ol>
		<li>Załaduj nowy skan pozycjonowania lampy błyskowej w trybie pracy [1H] Tryb głośności TX/RX. Zmień ustawienia wymiarów na 2: Narzędzie do sterowania spektrometrem -> Edytuj GS -> Ustaw wymiary -> 2. Naciśnij GSP na sterowaniu spektrometrem i przesuwaj fantom, aż zostanie wyśrodkowany w magnesie. Naciśnij STOP, a następnie naciśnij GOP na sterowaniu spektrometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skanowanie pilotażowe.
	<ol>
		<li>Załaduj nowy skan pozycjonowania TriPiolt w trybie pracy [1H] Tryb głośności TX/RX. Pozycja plasterka: Kontrola skanowania -> narzędzie Slice- > przesuwać plasterki (przytrzymaj M, kliknij i przeciągnij; wybierz plasterek, aby przesunąć za pomocą suwaka pakietu plasterków).</li>
		<li>Cewka Wobble 1H: Narzędzie sterujące spektrometrem - > Acq -> Wobble. Dostrój i dopasuj cewkę 1H za magnesem i naciśnij STOP. Przytrzymując Shift, naciśnij sygnalizację świetlną w oknie sterowania skanowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ustawienia skanowania obrazowania spektralnego Radial Echo Planar Spectral
<ol>
	<li>Załaduj nowy skan spektroskopii echo radialnego (radEPSI) w trybie pracy [13C] Tryb głośności TX/RX. Ustaw plasterek: narzędzie Cięcie na plasterki w kontrolce skanowania i przesuwaj plasterki (przytrzymaj M, kliknij i przeciągnij; wybierz plasterek, aby przesunąć za pomocą suwaka pakietu plasterków).</li>
	<li>Zawiot cewkę 13C, klikając Narzędzie do sterowania spektrometrem - > Acq -> Wobble. Ustaw wzmocnienie odbiornika na 1,000-2,000 na spektrometrze.</li>
	<li>Wykonaj końcowe sprawdzenie systemu. W zależności od sekwencji, obserwuj sygnał węgla 13 z komory mocznikowej w protokole zwiadowczym. 
	UWAGA: Gwarantuje to, że system jest prawidłowo skonfigurowany przed rozpoczęciem procesu nieodwracalnego rozpuszczania.</li>
</ol>
6. Uruchom rozwiązanie
<ol>
	<li>Gdy pirogronian osiągnie polaryzację >90% (~ 1 godz.), roztwory i fantom są gotowe, a skanowanie jest skonfigurowane, kliknij przycisk uruchom rozpuszczanie na konsoli systemowej DNP.</li>
	<li>Po wyświetleniu monitu przesuń patyczek do rozpuszczania do pozycji roboczej i wstrzyknij pożywkę do rozpuszczania. Zamknij system DNP i kliknij przycisk Gotowe w konsoli systemu DNP. Po wyświetleniu monitu przesuń drążek do rozpuszczania z powrotem do pozycji spoczynkowej, a następnie kliknij przycisk Zakończ.</li>
	<li>Gdy system DNP dostarczy hiperspolaryzowany pirogronian (~ 2 min po rozpoczęciu ogrzewania), należy pobrać 500 μl roztworu pirogronianu do każdej strzykawki z roztworem o wysokim i niskim stężeniu enzymów. Powoli (~10 sekund) wstrzyknąć każdą strzykawkę do przewodu iniekcyjnego. 
	UWAGA: Skanowanie można było rozpocząć przed wstrzyknięciem lub w dowolnym momencie do 3 minut po wstrzyknięciu, w zależności od zastosowanego protokołu skanowania.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie obrazu
UWAGA: Ten fantom został zaprojektowany do użytku z wieloma strategiami obrazowania. Zobacz rysunek 2, jako przykład tego, jak obrazy rad-EPSI zostały przetworzone za pomocą Matlaba.
<ol>
	<li>Załaduj nieprzetworzone dane z pliku fid. Przekształć dane, aby dopasować je do liczby projekcji, odczytywać punkty, echa i uwzględniać dane przechowywane jako pary rzeczywiste i wyimaginowane. Oddziel parzyste i nieparzyste punkty echa.</li>
	<li>Fourier przekształca parzyste lub nieparzyste echa wzdłuż wymiarów echa. Wizualnie zidentyfikuj pasma częstotliwości dla pirogronianu i mleczanu. Dla uproszczenia przyjęto bezwzględną wartość widma.</li>
	<li>Oddziel każde pasmo metabolitu i przekształć Fouriera wzdłuż kierunku kodowania częstotliwości, aby uzyskać izolowane sinogramy dla każdego metabolitu. Odwrócony radon przekształca oddzielne sinogramy w celu uzyskania obrazu mleczanu lub pirogronianu.</li>
</ol>

<ol><li>Merritt, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+allows+a+direct+measure+of+flux+through+a+single+enzyme-catalyzed+step+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America+104%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104. 104, 19773-19777 (2007).</li>
<li>Rodrigues, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+tumor+glycolysis+using+hyperpolarized+13C-labeled+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of tumor glycolysis using hyperpolarized 13C-labeled glucose.</a> Nature medicine. 20, 93-97 (2014).</li>
<li>Day, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+tumor+response+to+treatment+using+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+imaging+and+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy.</a> Nature medicine. 13, 1382-1387 (2007).</li>
<li>Keshari, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+13C+dehydroascorbate+as+an+endogenous+redox+sensor+for+in+vivo+metabolic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized 13C dehydroascorbate as an endogenous redox sensor for in vivo metabolic imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18606-18611 (2011).</li>
<li>Gallagher, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+pH+in+vivo+using+hyperpolarized+13C-labelled+bicarbonate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled bicarbonate.</a> Nature. 453, 940-943 (2008).</li>
<li>Larson, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+tumor+hyperpolarized+%5B1-13C%5D-pyruvate+dynamics+using+time-resolved+multiband+RF+excitation+echo-planar+MRSI%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+resonance+in+medicine+%3A+official+journal+of+the+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine+%2F+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Investigation of tumor hyperpolarized [1-13C]-pyruvate dynamics using time-resolved multiband RF excitation echo-planar MRSI.</a> Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine. 63, 582-591 (2010).</li>
<li>Cunningham, C. H., Dominguez Viqueira, W., Hurd, R. E., Chen, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+correction+method+for+improved+spatial+correlation+of+hyperpolarized+13C+metabolites+and+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+biomedicine%22%5BJournal%5D)">Frequency correction method for improved spatial correlation of hyperpolarized 13C metabolites and anatomy.</a> NMR in biomedicine. 27, 212-218 (2014).</li>
<li>Larson, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+dynamic+3D+MR+spectroscopic+imaging+with+compressed+sensing+and+multiband+excitation+pulses+for+hyperpolarized+13C+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+resonance+in+medicine+%3A+official+journal+of+the+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine+%2F+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fast dynamic 3D MR spectroscopic imaging with compressed sensing and multiband excitation pulses for hyperpolarized 13C studies.</a> Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine. 65, 610-619 (2011).</li>
<li>Mayer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+subsecond+spiral+chemical+shift+imaging+to+real-time+multislice+metabolic+imaging+of+the+rat+in+vivo+after+injection+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+resonance+in+medicine+%3A+official+journal+of+the+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine+%2F+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Application of subsecond spiral chemical shift imaging to real-time multislice metabolic imaging of the rat in vivo after injection of hyperpolarized 13C1-pyruvate.</a> Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine. 62, 557-564 (2009).</li>
<li>Walker, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Catalyzing+Phantom+for+Reproducible+Dynamic+Conversion+of+Hyperpolarized+%5B1-C-13%5D-Pyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A Catalyzing Phantom for Reproducible Dynamic Conversion of Hyperpolarized [1-C-13]-Pyruvate.</a> PloS one. 8, e71274(2013).</li>
<li>Levin, Y. S., Mayer, D., Yen, Y. F., Hurd, R. E., Spielman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+fast+spiral+chemical+shift+imaging+using+least+squares+reconstruction%3A+application+for+hyperpolarized+%2813%29C+metabolic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+resonance+in+medicine+%3A+official+journal+of+the+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine+%2F+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization of fast spiral chemical shift imaging using least squares reconstruction: application for hyperpolarized (13)C metabolic imaging.</a> Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine. 58, 245-252 (2007).</li>
<li>von Morze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiagent+hyperpolarized+%2813%29C+perfusion+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+resonance+in+medicine+%3A+official+journal+of+the+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine+%2F+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiagent hyperpolarized (13)C perfusion imaging.</a> Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine. 72, 1599-1609 (2014).</li>
<li>Sogaard, L. V., Schilling, F., Janich, M. A., Menzel, M. I., Ardenkjaer-Larsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+apparent+diffusion+coefficients+of+hyperpolarized+%281%29%283%29C-labeled+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+biomedicine%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of apparent diffusion coefficients of hyperpolarized (1)(3)C-labeled metabolites.</a> NMR in biomedicine. 27, 561-569 (2014).</li>
<li>Patrick, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+transgene+expression+using+hyperpolarized+13C+urea+and+diffusion-weighted+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+resonance+in+medicine+%3A+official+journal+of+the+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine+%2F+Society+of+Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Detection of transgene expression using hyperpolarized 13C urea and diffusion-weighted magnetic resonance spectroscopy.</a> Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine. 73, 1401-1406 (2015).</li>
</ol>

Publikacja tego artykułu wideo jest wspierana przez korporację Bruker.

Obrazowanie hiperspolaryzowanych metabolitów w czasie rzeczywistym wiąże się z wieloma unikalnymi wyzwaniami związanymi z projektowaniem sekwencji, walidacją i kontrolą jakości. Zdolność do rozwiązania problemu niejednorodności czasoprzestrzennej i spektralnej oferuje znaczny potencjał kliniczny, ale wyklucza metody kontroli jakości i walidacji związane z konwencjonalnym rezonansem magnetycznym. Złożone sekwencje obrazowania lub algorytmy rekonstrukcji mogą mieć subtelne zależności, które utrudniają ich scharakteryzowani...

Kliniczny wpływ hiperpolaryzowanego rezonansu magnetycznego (MRI) 13związków znakowanych metodą C jest krytycznie zależny od jego zdolności do pomiaru współczynników konwersji chemicznej za pomocą spektroskopii rezonansu magnetycznego w czasie rzeczywistym i obrazowania spektroskopowego1-5. Podczas opracowywania i weryfikacji sekwencji dynamiczna konwersja chemiczna jest na ogół osiągana za pomocą modeli in vivo lub in vitro 6-9, które oferują ograniczoną kontrolę i odtwarzalność. W celu zapewnienia solidnych testów i zapewnienia jakości preferowany byłby bardziej kontrolowany system, który zachowuje konwersję chemiczną typową dla tego pomiaru. Przedstawiamy metodę osiągnięcia tej konwersji w powtarzalny sposób przy użyciu dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu.
Większość badań z hiperpolaryzowanymi środkami 13C skupia się na obrazowaniu hiperspolaryzowanych substratów w funkcjonującym środowisku biologicznym. Jest to oczywisty wybór, jeśli celem jest badanie procesów biologicznych lub określenie potencjalnego wpływu na opiekę kliniczną. Jeśli jednak pożądane jest scharakteryzowanie jakiegoś systemu pomiarowego lub algorytmu przetwarzania danych, modele biologiczne mają liczne wady, takie jak nieodłączna zmienność przestrzenna i czasowa10. Jednak konwencjonalne fantomy statyczne nie mają konwersji chemicznej, która napędza główne zainteresowanie kliniczne MRI hiperspolaryzowanych substratów i nie mogą być używane do charakteryzowania wykrywania współczynników konwersji lub innych parametrów dynamicznych11. Korzystając z pojedynczego systemu enzymatycznego, możemy zapewnić kontrolowaną i powtarzalną konwersję chemiczną, umożliwiając rygorystyczne badanie dynamicznych strategii obrazowania.
Ten system jest skierowany do badaczy, którzy opracowują strategie obrazowania dla hiperspolaryzowanych substratów i chcą scharakteryzować wydajność do porównania z alternatywnymi podejściami. Jeśli pomiary statyczne są pożądanym punktem końcowym, wówczas wystarczą statyczne fantomy metabolitów 13z wykrywaniem C11. Z drugiej strony, jeśli bardziej złożona charakterystyka biologiczna ma kluczowe znaczenie dla metody (dostarczanie, gęstość komórkowa itp.), wówczas potrzebne będą rzeczywiste modele biologiczne12-14. System ten idealnie nadaje się do oceny strategii obrazowania, które mają na celu zapewnienie ilościowej miary pozornych współczynników konwersji chemicznej.

<table><tbody><tr><td>BioSpect 7T</td><td>Bruker</td><td>BioSpec 70/30 USR</td><td>7 Tesla Przedkliniczny skaner MRI</td></tr><tr><td>HyperSense</td><td>Oxford Instruments</td><td>Hypersense DNP Polaryzator Dynamiczny</td><td>polaryzator jądrowy do agentów MRI</td></tr><tr><td>1-13C-Kwas pirogronowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>677175</td><td>Carbon 13 klarowany czysty kwas pirogronowy</td></tr><tr><td>Trityl</td><td>Radical GE Healthcare</td><td>OX063</td><td>Wolny rodnik stosowany w dynamicznej polaryzacji jądrowej</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td></tr><tr><td>LDH</td><td>Worthingthon</td><td>LS002755</td><td>Dehydrogenaza mleczanowa z mięśni królika</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4505</td><td>&beta;-dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowana sól dipotasowa</td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7943</td><td>Trizma Wstępnie ustawione kryształy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie wielokompartmentowego dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu do badań hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Obrazowanie hiperspolaryzowanych substratów za pomocą rezonansu magnetycznego jest bardzo obiecujące klinicznie dla oceny krytycznych procesów biochemicznych w czasie rzeczywistym. Ze względu na fundamentalne ograniczenia narzucone przez stan hiperpolaryzacyjny, powszechnie stosuje się egzotyczne techniki obrazowania i rekonstrukcji. Niezwykle potrzebny jest praktyczny system do charakteryzowania dynamicznych, wielospektralnych metod obrazowania. Taki system musi w sposób powtarzalny odzwierciedlać odpowiednią dynamikę chemiczną tkanek normalnych i patologicznych. Najczęściej stosowanym do tej pory substratem jest hiperspolaryzowany [1-13C]-pirogronian do oceny metabolizmu nowotworów. Opisujemy system fantomowy oparty na enzymach, który pośredniczy w przemianie pirogronianu w mleczan. Reakcja jest inicjowana przez wstrzyknięcie czynnika hiperpolaryzowanego do wielu komór wewnątrz fantomu, z których każda zawiera różne stężenia odczynników kontrolujących szybkość reakcji. Konieczne jest zastosowanie wielu przedziałów, aby sekwencje obrazowania wiernie oddawały przestrzenną i metaboliczną heterogeniczność tkanki. System ten pomoże w rozwoju i walidacji zaawansowanych strategii obrazowania, zapewniając dynamikę chemiczną, która nie jest dostępna w przypadku konwencjonalnych fantomów, a także kontrolę i odtwarzalność, które nie są możliwe in vivo.

Dwuwymiarowe obrazy selektywne dla warstwy pozyskano przy użyciu sekwencji snapshot radEPSI. Obrazy metabolitów zrekonstruowano metodą filtrowanej projekcji wstecznej. Obrazy metabolitów były dobrze dopasowane do obrazów protonowych, co przedstawiono na Rysunku 2. W tym układzie sygnał hiperpolaryzowanego mleczanu może być generowany wyłącznie w wyniku enzymatycznej konwersji hiperpolaryzowanego pirogronianu. Na Rysunku 4 dolna komora, z wyższym stężeniem...

Wielokompartmentowy dynamiczny fantom jest używany do symulacji niektórych interesujących biologicznych badań metabolicznych przy użyciu hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego.

Wykorzystanie wielokompartmentowego dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu do badań hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar konwersji hiperpolaryzowanego pirogronianu do mleczanu za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym lub MRI w kontrolowanym środowisku fantomowym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie hiperpolaryzowanego MRI, takie jak zdolność systemu do wykrywania konwersji chemicznej pirogronianu za pomocą rezonansu magnetycznego. Główną zaletą tej techniki jest to, że konwersja chemiczna pirogronianu przebiega podobnie do metabolizmu in vivo, ale jest bardziej kontrolowalna i powtarzalna niż w systemach żywych.Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę nowotworów, ponieważ środowisko fantomu symuluje zwiększoną konwersję pirogronianu do mleczanu, która jest powszechna w większości nowotworów. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat raka, można ją również zastosować w innym obrazowaniu metabolicznym, np. w badaniu metabolizmu serca. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na krótkie ograniczenia czasowe właściwe dla mediów hiperpolaryzowanych.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy rozpuszczania i wyrzucania są trudne do opanowania, gdyż muszą przebiegać szybko i być wykonywane precyzyjnie. Do kubka z próbką do systemu dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) pipetujemy 0,3 µL roztworu gadoteridolu oraz 13 mg roztworu kwasu pirogronowego. Mieszaninę w kubku z próbką krótko mieszamy końcówką pipety.Rozpocznij proces wprowadzania próbki, klikając przycisk insert sample na konsoli systemu DNP. W kreatorze próbek wybierz normal sample i kliknij next. Trzymając naczynko z próbką w pionie, ostrożnie umieść pręt wprowadzający nad górną krawędzią naczynka.Po wyświetleniu odpowiedniego komunikatu uruchom system DNP i włóż naczynie do wkładu o zmiennej temperaturze za pomocą pręta wprowadzającego. Pociągnij tłok na końcu pręta wprowadzającego próbkę, aby zwolnić próbkę do wkładu o zmiennej temperaturze. Wyjmij pręt wprowadzający próbkę z systemu i kliknij przycisk „dalej” na konsoli systemu DNP.Następnie rozpocznij polaryzację, klikając przycisk polarise sample na konsoli systemu DNP. W oprogramowaniu RINMR wpisz HYPERSENSENMR w programie do monitorowania polaryzacji. Ustaw konfigurację build up na jeden i naciśnij enter.Następnie kliknij solid build up. Po ustawieniu lokalizacji i nazwy pliku zapisu wybierz profil dla węgla 13 z rozwijanej karty w konsoli systemu DNP. Kliknij next.Zaznacz pole, aby włączyć pobieranie próbek podczas etapu stabilizacji. Ustaw czas pobierania próbek na 300 sekund i kliknij przycisk zakończenia. Na koniec odmierz 3,85 grama medium do rozpuszczania, albo objętościowo za pomocą strzykawki o pojemności pięciu mililitrów, albo wagowo przy użyciu wagi.Umieść fantom w centrum magnesu, zapewniając łatwy dostęp do linii wtryskowych. Upewnij się, że znajduje się pojemnik na ciecz, która będzie odprowadzana do linii wydechowej. Przygotuj mieszaninę enzymów o wysokiej aktywności, mieszając 240 µL roztworu NADH, 125 µL roztworu LDH oraz 335 µL buforu.Przechowuj roztwór w strzykawce o pojemności 3 ml, którą można podłączyć do linii wtryskowej. Następnie przygotuj mieszaninę enzymów o niskiej aktywności, łącząc ze sobą 240 µL roztworu NADH, 75 µL roztworu LDH oraz 385 µL buforu. Przechowuj tę mieszaninę w oddzielnej strzykawce o pojemności 3 ml, którą można podłączyć do linii wtryskowej.Aby przeprowadzić wstępne pozycjonowanie, załaduj nowy skan lokalizacyjny. Wykonaj korektę położenia cewki protonowej, wybierając Acq/Reco. Wyświetl i otwórz platformę regulacyjną.Na panelu regulacji wybierz Wobble Adjust i kliknij open. Ustaw szerokość sweep na 10 MHz i kliknij set up. Po chwili w oknie akwizycji powinno pojawić się strojenie i dopasowanie cewek protonowych.Wykonaj wobble cewki węglowej, zmieniając element cewki na 13C lub element dwa i ustawiając szerokość sweep na 5 MHz. Po chwili w oknie akwizycji powinno pojawić się strojenie i dopasowanie cewek węglowych; jeśli są odpowiednio nastrojone, naciśnij stop. Aby powrócić do sterowania skanowaniem, naciśnij apply, następnie back, a na koniec naciśnij continue, aby rozpocząć skanowanie.Kluczowe jest, aby skan w tym kroku został w pełni skonfigurowany przed rozpoczęciem procesu rozpuszczania. Po rozpoczęciu rozpuszczania nie powinno się go przerywać i pozostanie bardzo mało czasu na dostrojenie parametrów sekwencji przed dostarczeniem hiperpolaryzowanego pirogronianu. Wczytaj nowy skan obrazowania spektroskopowego w technice echo-planar (radio echo planar spectroscopic imaging).Ustaw grubość warstwy na 30 milimetrów, aby objęła ona całą komorę reakcyjną. Ustaw tryb pracy na węgiel 13, wybierając kartę systemową i zmieniając tryb pracy na 13C transmit receive. Po osiągnięciu przez pirogronian polaryzacji powyżej 90%, roztwory i fantom są gotowe, a skanowanie zostało skonfigurowane.Kliknij przycisk uruchamiania rozpuszczania (run dissolution) na konsoli systemu DNP. Po pojawieniu się monitu przesuń pręt do rozpuszczania do pozycji roboczej i wstrzyknij medium do rozpuszczania. Zamknij system DNP i kliknij przycisk zakończenia (finished) na konsoli systemu DNP.Ważne jest, aby wstrzykiwanie pirogronianu i enzymu odbywało się płynnie. Zapewni to właściwe wymieszanie mieszaniny enzymatycznej i jej dostarczenie do komory fantomu przed zakończeniem konwersji chemicznej. Gdy system DNP dostarcza hiperpolaryzowany aspirat pirogronianu, 500 µL roztworu pirogronianu zostaje wprowadzonych do każdej z strzykawek z roztworem o wysokim i niskim stężeniu enzymu.Powoli wstrzyknij zawartość każdej strzykawki do linii wtryskowej. Skanowanie można rozpocząć przed wtryskiem lub bezpośrednio po nim, w zależności od stosowanego protokołu skanowania. Po zakończeniu procesu rozpuszczania, zgodnie z komunikatem, przesuń pręt do rozpuszczania z powrotem do pozycji spoczynkowej, a następnie kliknij przycisk zakończenia.Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki sekwencji obrazowania spektralnego radio echo planar. Obraz pirogronianu wykazuje silny sygnał pirogronianu w obu komorach. Obraz mleczanu wykazuje słabszy sygnał mleczanu, który jednak nadal jest zlokalizowany w komorach.Stosunek sygnału hiperpolaryzowanego mleczanu i pirogronianu może być wykorzystany do oszacowania aktywności enzymatycznej w każdej komorze. Stosunki sygnałów w każdej komorze odpowiadają obecnej aktywności enzymu. Po opanowaniu techniki ta może zostać wykonana w ciągu jednej godziny.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować mieszaninę fantoma oraz sekwencję obrazowania przed rozpoczęciem procesu rozpuszczania. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne związki hiperpolaryzowane oraz enzymy w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, jak skutecznie dana sekwencja może obrazować inne reakcje chemiczne. Technika ta utorowuje drogę badaczom w dziedzinie hiperpolaryzowanego MRI do eksploracji wydajności sekwencji z wykorzystaniem powtarzalnych fantomów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować mieszaninę enzymatyczną w celu ułatwienia konwersji hiperpolaryzowanego pirogronianu do mleczanu oraz jak polaryzować pirogronian wzbogacony w węgiel 13 do celów obrazowania. Należy pamiętać, że praca z silnymi polami magnetycznymi może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak kontrolowany dostęp do pomieszczenia skanera.

use-multi-compartment-dynamic-single-enzyme-phantom-for-studies

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Opisano proces wytwarzania hiperpolaryzowanego ksenonu za pomocą optycznego pompowania wymiany spinowej (SEOP). Metoda ta pozwala na ok. 10000-krotne zwiększenie polaryzacji spinu jądrowego Xe-129 i znajduje zastosowanie w spektroskopii oraz obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego jąder. Przedstawiono przykłady eksperymentów w fazie gazowej oraz w stanie roztworu.

Hiperpolaryzowany ksenon w zastosowaniach NMR i MRI

Choroby nerwowo-mięśniowe często wykazują zróżnicowaną czasowo, przestrzennie niejednorodną i wieloaspektową patologię. Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie tej patologii za pomocą nieinwazyjnych metod obrazowania metodą rezonansu magnetycznego.

Ilościowy rezonans magnetyczny w chorobach mięśni szkieletowych

Zwiększenie czułości zapewniane przez dynamiczną polaryzację jądrową (DNP) umożliwia śledzenie procesów metabolicznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR i MRI. Omówiono charakterystykę i wydajność dedykowanego zestawu DNP do rozpuszczania, przeznaczonego do badania reakcji enzymatycznych.

Oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR

Nowa metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR), rapid scan EPR (RS-EPR), została zademonstrowana do przestrzennego obrazowania spektralnego 2D, która jest lepsza od tradycyjnej techniki ciągłej fali (CW) i otwiera nowe możliwości obrazowania in vivo. Wyniki są demonstrowane na częstotliwości 250 MHz, ale technika ta ma zastosowanie na dowolnej częstotliwości.

Szybki skan elektronowy rezonansu paramagnetycznego otwiera nowe możliwości obrazowania fizjologicznie ważnych parametrów in vivo

Dynamiczna polaryzacja jądrowa z późniejszym rozpuszczaniem próbki umożliwiła badania metabolizmu w systemach biologicznych w czasie rzeczywistym. Hiperspolaryzowany [1-13C]pirogronian zastosowano do badania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w linii komórkowej raka gruczołu krokowego in vitro.

Hiperspolaryzowana spektroskopia i obrazowanie metabolicznego rezonansu magnetycznego 13C

Celem tej pracy jest opisanie protokołu tworzenia praktycznego fantomu tłusto-wodnego, który można dostosować do produkcji fantomów o różnej zawartości tłuszczu i objętości.

Fantomy tłuszczowo-wodne do walidacji obrazowania metodą rezonansu magnetycznego: elastyczny i skalowalny protokół

Prezentujemy protokół do pomiaru zależności pola magnetycznego od czasu relaksacji spinowo-sieciowej 13związków wzbogaconych w C, hiperpolaryzowanych za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej, przy użyciu szybkiej relaksometrii z cyklem pola. W szczególności wykazaliśmy to za pomocą pirogronianu [1-13C], ale protokół można rozszerzyć na inne hiperspolaryzowane substraty.

Pomiar zależności pola magnetycznego od relaksacji sieci spinowej hiperspolaryzowanego [1-13C]pirogronianu

Opisujemy eksperymentalny układ do podawania hiperspolaryzowanych metabolitów znakowanych 13znakowanymi C w trybie ciągłej perfuzji do izolowanego perfundowanego serca myszy. Dedykowane podejście do akwizycji 13C-NMR umożliwiło ilościowe określenie aktywności enzymów metabolicznych w czasie rzeczywistym, a wieloparametryczna analiza 31P-NMR umożliwiła określenie zawartości ATP i pH w tkankach.

Badanie metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej [1-13C] pirogronianu i spektroskopii 13C/31P NMR

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania wysokiej jakości hiperpolaryzowanych obrazów rezonansu magnetycznego ksenonu-129, obejmujący sprzęt, oprogramowanie, akwizycję danych, wybór sekwencji, zarządzanie danymi, wykorzystanie przestrzeni k i analizę szumów.

Rozwiązywanie problemów i zapewnienie jakości w hiperspolaryzowanym ksenonowym rezonansie magnetycznym: narzędzia do pozyskiwania wysokiej jakości obrazów

Protokół ten integruje niestandardowy system bioreaktora z hiperspolaryzowaną spektroskopią NMR ¹³C w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, poprawiając odtwarzalność i dokładność kinetyczną w badaniach metabolicznych i badaniach przesiewowych leków.

Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego 13C NMR

Poznaj metodę pomiaru konwersji hiperpolaryzowanego pirogronianu do mleczanu przy użyciu rezonansu magnetycznego w kontrolowanym środowisku fantomu. Technika ta umożliwia badanie procesów metabolicznych istotnych dla diagnostyki nowotworów.

Wykorzystanie wielokompartmentowego dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu do badań hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie wielokompartmentowego dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu do badań hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego

Przeglądaj więcej filmów