Wykorzystanie wielokompartmentowego dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu do badań hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar konwersji hiperpolaryzowanego pirogronianu do mleczanu za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym lub MRI w kontrolowanym środowisku fantomowym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie hiperpolaryzowanego MRI, takie jak zdolność systemu do wykrywania konwersji chemicznej pirogronianu za pomocą rezonansu magnetycznego. Główną zaletą tej techniki jest to, że konwersja chemiczna pirogronianu przebiega podobnie do metabolizmu in vivo, ale jest bardziej kontrolowalna i powtarzalna niż w systemach żywych.

Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę nowotworów, ponieważ środowisko fantomu symuluje zwiększoną konwersję pirogronianu do mleczanu, która jest powszechna w większości nowotworów. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat raka, można ją również zastosować w innym obrazowaniu metabolicznym, np. w badaniu metabolizmu serca. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na krótkie ograniczenia czasowe właściwe dla mediów hiperpolaryzowanych.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy rozpuszczania i wyrzucania są trudne do opanowania, gdyż muszą przebiegać szybko i być wykonywane precyzyjnie. Do kubka z próbką do systemu dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) pipetujemy 0,3 µL roztworu gadoteridolu oraz 13 mg roztworu kwasu pirogronowego. Mieszaninę w kubku z próbką krótko mieszamy końcówką pipety.

Rozpocznij proces wprowadzania próbki, klikając przycisk insert sample na konsoli systemu DNP. W kreatorze próbek wybierz normal sample i kliknij next. Trzymając naczynko z próbką w pionie, ostrożnie umieść pręt wprowadzający nad górną krawędzią naczynka.

Po wyświetleniu odpowiedniego komunikatu uruchom system DNP i włóż naczynie do wkładu o zmiennej temperaturze za pomocą pręta wprowadzającego. Pociągnij tłok na końcu pręta wprowadzającego próbkę, aby zwolnić próbkę do wkładu o zmiennej temperaturze. Wyjmij pręt wprowadzający próbkę z systemu i kliknij przycisk „dalej” na konsoli systemu DNP.

Następnie rozpocznij polaryzację, klikając przycisk polarise sample na konsoli systemu DNP. W oprogramowaniu RINMR wpisz HYPERSENSENMR w programie do monitorowania polaryzacji. Ustaw konfigurację build up na jeden i naciśnij enter.

Następnie kliknij solid build up. Po ustawieniu lokalizacji i nazwy pliku zapisu wybierz profil dla węgla 13 z rozwijanej karty w konsoli systemu DNP. Kliknij next.

Zaznacz pole, aby włączyć pobieranie próbek podczas etapu stabilizacji. Ustaw czas pobierania próbek na 300 sekund i kliknij przycisk zakończenia. Na koniec odmierz 3,85 grama medium do rozpuszczania, albo objętościowo za pomocą strzykawki o pojemności pięciu mililitrów, albo wagowo przy użyciu wagi.

Umieść fantom w centrum magnesu, zapewniając łatwy dostęp do linii wtryskowych. Upewnij się, że znajduje się pojemnik na ciecz, która będzie odprowadzana do linii wydechowej. Przygotuj mieszaninę enzymów o wysokiej aktywności, mieszając 240 µL roztworu NADH, 125 µL roztworu LDH oraz 335 µL buforu.

Przechowuj roztwór w strzykawce o pojemności 3 ml, którą można podłączyć do linii wtryskowej. Następnie przygotuj mieszaninę enzymów o niskiej aktywności, łącząc ze sobą 240 µL roztworu NADH, 75 µL roztworu LDH oraz 385 µL buforu. Przechowuj tę mieszaninę w oddzielnej strzykawce o pojemności 3 ml, którą można podłączyć do linii wtryskowej.

Aby przeprowadzić wstępne pozycjonowanie, załaduj nowy skan lokalizacyjny. Wykonaj korektę położenia cewki protonowej, wybierając Acq/Reco. Wyświetl i otwórz platformę regulacyjną.

Na panelu regulacji wybierz Wobble Adjust i kliknij open. Ustaw szerokość sweep na 10 MHz i kliknij set up. Po chwili w oknie akwizycji powinno pojawić się strojenie i dopasowanie cewek protonowych.

Wykonaj wobble cewki węglowej, zmieniając element cewki na 13C lub element dwa i ustawiając szerokość sweep na 5 MHz. Po chwili w oknie akwizycji powinno pojawić się strojenie i dopasowanie cewek węglowych; jeśli są odpowiednio nastrojone, naciśnij stop. Aby powrócić do sterowania skanowaniem, naciśnij apply, następnie back, a na koniec naciśnij continue, aby rozpocząć skanowanie.

Kluczowe jest, aby skan w tym kroku został w pełni skonfigurowany przed rozpoczęciem procesu rozpuszczania. Po rozpoczęciu rozpuszczania nie powinno się go przerywać i pozostanie bardzo mało czasu na dostrojenie parametrów sekwencji przed dostarczeniem hiperpolaryzowanego pirogronianu. Wczytaj nowy skan obrazowania spektroskopowego w technice echo-planar (radio echo planar spectroscopic imaging).

Ustaw grubość warstwy na 30 milimetrów, aby objęła ona całą komorę reakcyjną. Ustaw tryb pracy na węgiel 13, wybierając kartę systemową i zmieniając tryb pracy na 13C transmit receive. Po osiągnięciu przez pirogronian polaryzacji powyżej 90%, roztwory i fantom są gotowe, a skanowanie zostało skonfigurowane.

Kliknij przycisk uruchamiania rozpuszczania (run dissolution) na konsoli systemu DNP. Po pojawieniu się monitu przesuń pręt do rozpuszczania do pozycji roboczej i wstrzyknij medium do rozpuszczania. Zamknij system DNP i kliknij przycisk zakończenia (finished) na konsoli systemu DNP.

Ważne jest, aby wstrzykiwanie pirogronianu i enzymu odbywało się płynnie. Zapewni to właściwe wymieszanie mieszaniny enzymatycznej i jej dostarczenie do komory fantomu przed zakończeniem konwersji chemicznej. Gdy system DNP dostarcza hiperpolaryzowany aspirat pirogronianu, 500 µL roztworu pirogronianu zostaje wprowadzonych do każdej z strzykawek z roztworem o wysokim i niskim stężeniu enzymu.

Powoli wstrzyknij zawartość każdej strzykawki do linii wtryskowej. Skanowanie można rozpocząć przed wtryskiem lub bezpośrednio po nim, w zależności od stosowanego protokołu skanowania. Po zakończeniu procesu rozpuszczania, zgodnie z komunikatem, przesuń pręt do rozpuszczania z powrotem do pozycji spoczynkowej, a następnie kliknij przycisk zakończenia.

Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki sekwencji obrazowania spektralnego radio echo planar. Obraz pirogronianu wykazuje silny sygnał pirogronianu w obu komorach. Obraz mleczanu wykazuje słabszy sygnał mleczanu, który jednak nadal jest zlokalizowany w komorach.

Stosunek sygnału hiperpolaryzowanego mleczanu i pirogronianu może być wykorzystany do oszacowania aktywności enzymatycznej w każdej komorze. Stosunki sygnałów w każdej komorze odpowiadają obecnej aktywności enzymu. Po opanowaniu techniki ta może zostać wykonana w ciągu jednej godziny.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować mieszaninę fantoma oraz sekwencję obrazowania przed rozpoczęciem procesu rozpuszczania. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne związki hiperpolaryzowane oraz enzymy w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, jak skutecznie dana sekwencja może obrazować inne reakcje chemiczne. Technika ta utorowuje drogę badaczom w dziedzinie hiperpolaryzowanego MRI do eksploracji wydajności sekwencji z wykorzystaniem powtarzalnych fantomów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować mieszaninę enzymatyczną w celu ułatwienia konwersji hiperpolaryzowanego pirogronianu do mleczanu oraz jak polaryzować pirogronian wzbogacony w węgiel 13 do celów obrazowania. Należy pamiętać, że praca z silnymi polami magnetycznymi może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak kontrolowany dostęp do pomieszczenia skanera.