Name: Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A. Ta metoda umożliwia jednoczesną analizę specyficzności i wiązania receptorów w pojedynczym badaniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były częściowo wspierane przez Scripps Microarray Core Facility oraz kontrakt z Centers for Disease Control (J.C.P.). RPdV jest laureatem grantu Rubicon i VENI przyznawanego przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO). Konsorcjum na rzecz Glikemii Funkcjonalnej (http://www.functionalglycomics.org/) finansowane przez grant NIGMS GM62116 (J.C.P.) dostarczyło kilka glikanów użytych w tym badaniu. Jest to publikacja 29113 z The Scripps Research Institute.

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej. 
1. Budowa tablicy
<ol>
	<li>Przygotowanie glikanów i ustawienie płytki
	<ol>
		<li>Przygotuj zapas bufora drukowania. Najpierw przygotować 500 ml 150 mM roztworu podstawowego dwuzasadowego fosforanu sodu. Przygotować również 50 ml 150 mM roztworu podstawowego monozasadowego roztworu fosforanu sodu. W kolbie, używając mieszadła magnetycznego i pH-metru, powoli miareczkować dwuzasadowy roztwór fosforanu sodu roztworem jednozasadowym, aż do osiągnięcia pH 8,5. Dodaj Tween-20 do wartości 0,005%.</li>
		<li>Przygotuj próbki glikanów. Rozcieńczone glikany sprzężone z PAA (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) i 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Rysunek 1A)) należy rozcieńczyć do 100 μg/ml w buforze drukarskim z kroku 1.1.1. Glikany jednowartościowe, diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-(CH2)3NH2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ--(CH2)3NH2) i 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ--(CH2)3NH2)) do 100 μM w buforze drukowania od kroku 1.1.1. Na koniec przygotuj barwniki funkcjonalizowane aminami, które będą używane jako znaczniki siatki/światła do lądowania. Plamki markerów barwnikowych są drukowane z prędkością 1 μM. 
		UWAGA: W naszych wydrukach używany jest barwnik Atto488-NHS. Jednak każdy barwnik funkcjonalizowany aminami, możliwy do odczytania przez skaner do slajdów, jest odpowiedni do tego celu.</li>
		<li>Przenieś 10 μl każdej próbki glikanu na 384-dołkowe płytki do mikromiareczkowania, używane przez robota drukarskiego. Niewykorzystane glikany należy przechowywać w roztworze buforowym do drukowania w temperaturze -20 °C w szczelnie zamkniętych probówkach. Tansfer 10 μl markera barwnikowego do płyty drukarskiej.  </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drukowanie 
	UWAGA: Wszystkie czynności związane z dotykaniem lub przesuwaniem szkiełek należy wykonywać w rękawiczkach.
	<ol>
		<li>Umieść kołki macierzy w głowicy drukującej zgodnie z prawidłową konfiguracją układu. W tym układzie użyj jednego pinu, aby wydrukować wszystkie próbki i tablice. Wydrukuj glikany w blokach po sześć, pomijając jedną cechę (cecha jest definiowana jako pojedyncza plamka określonego związku), z każdej strony, tak aby plamki tej samej próbki nie były drukowane dokładnie obok siebie. 
		UWAGA: Użytkownik końcowy musi zdecydować o konfiguracji.  </li>
		<li>Wyjmij szkiełka z worków, otwórz pudełka i usuń wszelkie cząsteczki kurzu lub małe kawałki plastiku, które mogą znajdować się na ich powierzchni, wydmuchując azot o bardzo wysokiej czystości na każde szkiełko. Umieść żądaną liczbę szkiełek, powlekaną stroną do góry, na stoliku macierzowym.</li>
		<li>Zaprogramuj matrycę, użyj parametrów 27 punktów na wizytę na płycie źródłowej, używając 3 "pre-spotów" na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną, aby usunąć nadmiar płynu na końcówce kołków drukujących
		<ol>
			<li>Włącz MPU (główną jednostkę napędową) i jednostkę sterowania klimatyzacją. Otwórz oprogramowanie do analizy kafelkowej na komputerze.</li>
			<li>Wybierz układ do wydruku. Wybierz Opcje → Narzędzie Pin Tool, które ma być używane do drukowania narzędzia drukującego tablica 1 x 1 - 1 pojedynczy pin. Wybierz kartę Target (Cel) → Tool Array Definition (Definicja tablicy narzędzi) → opcji Print Pattern (Wzór drukowania) i dodaj wysokość (odległość między punktami), liczbę wierszy i kolumn, które mają pomieścić próbki do wydrukowania, oraz wzór drukowania próbek (dla tej tablicy używany jest wzór drukowania 8 x 8 o rastrze 340 μm dla łącznie 7 próbek).</li>
			<li>Wybierz opcję Target → Slide Layout (Układ slajdów docelowych) i zaprogramuj odległość między blokami, aby umożliwić drukowanie każdej replikowanej tablicy w 48-dołkowym (4 x 12) szablonie slajdów. Wybierz opcję Source (Źródło) i dodaj liczbę przetworników źródłowych (1 dla każdej próbki w przypadku korzystania z 1 pinu) (w przypadku tego wydruku zostanie użytych 7 przetworników źródłowych, aby pomieścić 6 dołków na próbki i 1 dołek markera barwnikowego). 
			UWAGA: Okno dialogowe źródła powinno zmienić kolor na ZIELONY, aby pokazać, że liczba wizyt źródła jest zgodna z próbkami, które mają zostać wydrukowane we wzorcu drukowania.</li>
			<li>Wybierz opcję Target → Adapter Plate and Slide Layout (Płyta adaptera docelowego i układ slajdów) i dostosuj numer slajdu (dla tego wydruku drukowanych jest jednocześnie 5 slajdów z 1 slajdem wstępnego punktowania).</li>
			<li>Zwolnij tacę, klikając przycisk T1, aby aktywować tacę i dodać żądaną liczbę szkiełek do tacy, zwracając szczególną uwagę na położenie szkiełka wstępnego (NIEBIESKIEGO) i "prawdziwych" slajdów.</li>
			<li>Umieść zwykłe szklane szkiełka na wszystkich pozostałych portach próżniowych, aby zablokować próżnię i kliknij OK, aby aktywować próżnię. Sprawdź, czy wszystkie szkiełka są przytrzymane na swoim miejscu, a następnie kliknij przycisk OK, aby przywrócić tacę do pozycji wyjściowej.</li>
			<li>Załaduj płytę drukarską do uchwytu płyty i upewnij się, że stojak jest prawidłowo ustawiony na miejscu. Kliknij przycisk GO (Przejdź) i poczekaj, aż proces drukowania będzie kontynuowany.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wydrukuj pozostałe 24 punkty w replikach po 6 punktów na macierz (4 tablice/wizytę źródłową).</li>
		<li>Załaduj płytki 384-dołkowe do drukarki i rozpocznij drukowanie. Utrzymuj wilgotność względną podczas drukowania w zakresie od 55 do 65%. Drukarka zatrzymuje się po wydrukowaniu 5 slajdów. 
		UWAGA: Podczas gdy mikromacierz w tym teście jest drukowana w określonym wzorze 8 x 8, różne roboty drukujące mikromacierze będą wymagały programowania specyficznego dla sprzętu, aby osiągnąć pożądany układ. To od użytkownika końcowego zależy, czy określi najbardziej odpowiedni wzór, biorąc pod uwagę specyfikacje jego urządzeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nawilżanie/Unieruchamianie 
	UWAGA: Po zakończeniu drukowania preparaty przechodzą etap tymczasowego unieruchomienia, zwany również nawilżaniem. Nawilżanie po wydrukowaniu pomaga ujednolicić mocowanie próbki poprzez ponowne zwilżenie miejsc i zapewnienie całkowitego zablokowania.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka w komorze o wilgotności 100% natychmiast po wydrukowaniu na okres 30 minut. Zbuduj komorę, kładąc bardzo mokre ręczniki papierowe płasko na dnie dużego szklanego naczynia, umieszczając szkiełka na jakimś stojaku, takim jak stojak na probówki, stroną do zadrukowania do góry i uszczelniając folią, aby zatrzymać wilgoć.</li>
		<li>Szkiełka numerować za pomocą pisaka do znakowania odpornego na działanie alkoholu/rozpuszczalników i przechowywać w pudełku do wysuszania. Osuszyć przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Numerowanie, blokowanie i przechowywanie
	<ol>
		<li>Przygotować bufor blokujący – 50 mM etanoloaminy w 50 mM buforze boranowym. Najpierw rozpuścić kwas borowy w ddH2O do końcowego stężenia 50 mM w kolbie zawierającej mieszadło magnetyczne. Energicznie mieszać roztwór na płycie mieszającej, aż do rozpuszczenia całego ciała stałego. Ciągle mieszając, dodać odpowiednią ilość etanoloaminy z 16,54 M roztworu podstawowego, aby osiągnąć pożądane stężenie 50 mM. Dodać stężony wodorotlenek sodu, aby dostosować do końcowego pH 9,2.</li>
		<li>Zanurz wydrukowane slajdy w roztworze bufora blokującego na 1 godzinę.</li>
		<li>Po upływie 1 godziny przepłukać szkiełka w ddH2O, aby usunąć nadmiar śladów buforu blokującego. Bufor blokujący należy zutylizować do odpowiedniego pojemnika na odpady.</li>
		<li>Przenieś szkiełka do uchwytów do barwienia szkła i odwiruj do sucha. Wysuszyć matryce, umieszczając je w wirówce wyposażonej w wahliwe uchwyty płytek, z prędkością 10 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Po wyschnięciu szkiełek można je natychmiast inkubować lub przechowywać. Warunki przechowywania to -20 °C w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie.  </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza białek wiążących glikany
<ol>
	<li>Przygotuj nawilżoną komorę, w której zmieszczą się matryce, które mają być hybrydyzowane. Prosta komora składa się z naczynia z Pyrexu, wyłożonego na dnie zwilżonymi ręcznikami papierowymi i stojakiem, na którym spoczywają zjeżdżalnie.</li>
	<li>Stosować biotynylowane lektyny SNA (aglutynina Sambuca nigra) i ECA (aglutynina Erythrina cristagalli) w stężeniu 10 μg/ml + 2 μg/ml barwnika Streptawidyna-555, w buforze sondującym (PBS + 0,01% Tween-20). W przypadku HA (A/Vietnam/1203/04 H5N1 i A/KY/07 H1N1, w tym przykładzie) należy użyć początkowego stężenia 20 μg/ml wstępnie skompleksowanego, jak opisano wcześniej 34. Krótko mówiąc, przygotuj mieszaninę HA:Mouse-α-Strep:Goat-α-Mouse-Alexa647 w buforze blokującym (PBS + 3%BSA + 0,01% Tween-20), w stosunku molowym 4:2:1. 
	UWAGA: Matryca jest badana lektynami w celu upewnienia się, że glikany są unieruchomione i wykrywalne (Rysunek 1B).</li>
	<li>Przenieść roztwór mieszaniny białka i przeciwciała wiążący glikany o objętości 20 μl na płytkę 384-dołkową i inkubować na lodzie przez 30 minut. Próbki lektyny i kwasu hialuronowego rozcieńczyć seryjnie w stosunku 1:1 w odpowiednim buforze 8 razy, mieszając 10 μl próbki z 10 μl buforu.</li>
	<li>Pobrać pipetą 8 μl próbki na powierzchnię mikrostudzienki i inkubować w szczelnie zamkniętej komorze nawilżania (100% wilgotności względnej) przez 90 minut.</li>
	<li>Myć szkiełka pojedynczo, trzymając za krawędzie i zanurzając je czterokrotnie w mieszaninie PBS i 0,05% Tween, następnie cztery razy w PBS, a na koniec cztery razy w dejonizowanymH2O. Stosując ten sam protokół suszenia, który opisano w kroku blokowania, wirować matryce do suszenia w wirówce przez 5 minut przy 10 x g.</li>
</ol>
3. Skanowanie i analiza danych 
UWAGA: Mikromacierze glikanowe mogą być skanowane z różnymi ustawieniami, w zależności od producenta skanera mikromatrycowego. Zmieniając moc i rozdzielczość lasera, przyrząd może wytworzyć obraz z jak największą liczbą sygnałów w swoim zakresie dynamicznym (ilustracja 1C).
<ol>
	<li>Użyj skanera do szkiełek fluorescencyjnych i zeskanuj matryce natychmiast po inkubacji z białkami wiążącymi glikany. Zwróć uwagę, aby upewnić się, że szkiełko jest prawidłowo włożone do przyrządu skanującego.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do skanowania. Kliknij start, aby otworzyć program. Połącz ze skanerem: Skaner → Połącz lub zielony przycisk w menu panelu nawigacyjnego skanera.</li>
		<li>Otwórz drzwiczki automatycznego podajnika skanera. Umieść suwaki w szczelinach w autoloaderze w określonej kolejności. Zamknij klapki automatycznej ładowarki. Kliknij "czytnik treści" w panelu nawigacyjnym Narzędzia, aby automatycznie wykryć slajdy w skanerze.</li>
		<li>Ustaw parametr skanowania: Skaner → Parametry skanowania odpowiednie dla eksperymentu (np. wysoka moc lasera 635, zysk detekcji 50%). Skanuj slajdy: Skaner → skanowanie. Wybierz ścieżkę, tworząc folder, w którym zostaną zapisane skanowane obrazy i nazwij poszczególne skany. Zrób to przed właściwym skanowaniem. Powtórz te czynności dla każdego slajdu z osobna. Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć skanowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj oprogramowania skanera, aby skonfigurować instrument i zeskanować slajdy. Ustaw skaner tak, aby iteracyjnie skanował przy niskiej mocy lasera (5 mW) ze zwiększającymi się ustawieniami wzmocnienia o 25%, 50% i 75%. 
	UWAGA: Ustawienia można testować i optymalizować, ale należy pamiętać, że każde skanowanie może obniżyć moc fluorescencji barwników z powodu fotowybielania.
	<ol>
		<li>Otwarte oprogramowanie do akwizycji i analizy danych, takie jak oprogramowanie Mapix. Kliknij start, aby otworzyć program. Otwórz skanowany obraz: Plik → otwórz obraz. Otwórz plik GAL: Przeanalizuj → otwórz siatkę i wybierz odpowiedni plik GAL.</li>
		<li>Wejdź w tryb bloków: Obraz → trybie bloków, aby przesunąć siatkę. Użyj znaczników siatki, aby ustawić siatkę w odpowiednim miejscu na slajdzie. W razie potrzeby dostosuj poszczególne bloki, aby dopasować je do drukowanej tablicy.</li>
		<li>Wejdź w tryb spotów: Obraz → trybie spotów, aby dostosować lokalizację i rozmiar poszczególnych punktów w bloku. Gdy wszystkie bloki i punkty zostaną wyregulowane i umieszczone na miejscu, zmierz intensywność sygnału, analizując → obliczenia fotometryczne. Zapisz plik wyjściowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania slajdów obrazy są analizowane pod kątem sygnałów wiążących za pomocą zainstalowanego programu do przetwarzania obrazów (rysunek 1D-G). W celu analizy obrazu załaduj plik GAL (Array List) na zeskanowany obraz TIFF. 
	UWAGA: Plik GAL zawiera zarówno wzorzec układu punktu, jak i tożsamości każdej lokalizacji punktu. Pliki GAL dla macierzy są tworzone przez oprogramowanie drukarki przy użyciu pliku tekstowego rozdzielanego tabulatorami, który zawiera tożsamość próbek i ich lokalizację na 384-dołkowej płycie źródłowej.</li>
	<li>Użyj znacznika siatki/świateł lądowania wydrukowanych na mikrotablicach, aby prawidłowo umieścić siatkę GAL. Poszczególne miejsca mogą wymagać indywidualnego przesuwania, ale dobrze wydrukowana tablica zazwyczaj pozwala na łatwe umieszczanie bloków w siatce. Po umieszczeniu siatki zbierz intensywności plamki za pomocą oprogramowania i zapisz je jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami (.txt).  
	<ol>
		<li>Za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych otwórz plik wyjściowy ze skanera. Otwórz odpowiedni plik makra z lokalizacji folderu. Kliknij przycisk Wyświetl → Makro → UruchomMakro. 
		UWAGA: Wstępnie napisany skopiuje surowe dane wyjściowe, usunie niepotrzebne wiersze i kolumny, posortuje dane według próbki, obliczy średni średni sygnał minus wartości tła i wykreśli wynikowe wartości w arkuszu kalkulacyjnym zawierającym wykresy dla każdej z sześciu próbek testowanych na tablicy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tumpey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-amino+acid+change+in+the+hemagglutinin+of+the+1918+influenza+virus+abolishes+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission.</a> Science. 315 (5812), 655-659 (2007).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+balance+of+the+hemagglutinin+and+neuraminidase+activities+accompanies+the+emergence+of+the+2009+H1N1+influenza+pandemic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic.</a> J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).</li>
<li>Bouvier, N. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">The biology of influenza viruses.</a> Vaccine. 26, Suppl 4. D49-D53 (2008).</li>
<li>Freidl, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+at+the+animal-human+interface%3A+a+review+of+the+literature+for+virological+evidence+of+human+infection+with+swine+or+avian+influenza+viruses+other+than+A%28H5N1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1).</a> Euro Surveill. 19 (18), (2014).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+recognition+of+avian-like+receptors+in+human+influenza+A+H7N9+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses.</a> Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).</li>
<li>Paulson, J. C., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H5N1+receptor+specificity+as+a+factor+in+pandemic+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk.</a> Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).</li>
<li>Tzarum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+receptor+binding+of+the+hemagglutinin+from+a+human+H6N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human-Infecting+H10N8+Influenza+Virus+Retains+a+Strong+Preference+for+Avian-type+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).</li>
<li>Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+cell-surface+receptor+determinants+of+antigenically+similar+influenza+virus+hemagglutinins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins.</a> J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).</li>
<li>Gambaryan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+receptor-binding+phenotypes+of+influenza+virus+isolates+from+different+hosts+using+synthetic+sialylglycopolymers%3A+non-egg-adapted+human+H1+and+H3+influenza+A+and+influenza+B+viruses+share+a+common+high+binding+affinity+for+6%27-sialyl%28N-acetyllactosamine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine).</a> Virology. 232 (2), 345-350 (1997).</li>
<li>Rogers, G. N., D'Souza, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+properties+of+human+and+animal+H1+influenza+virus+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates.</a> Virology. 173 (1), 317-322 (1989).</li>
<li>Rogers, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+amino+acid+substitutions+in+influenza+haemagglutinin+change+receptor+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity.</a> Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).</li>
<li>Paulson, J. C., Rogers, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resialylated+erythrocytes+for+assessment+of+the+specificity+of+sialyloligosaccharide+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins.</a> Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).</li>
<li>Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+specific+myxovirus+receptors+to+asialoerythrocytes+by+incorporation+of+sialic+acid+with+pure+sialyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases.</a> J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).</li>
<li>Chutinimitkul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+attachment+pattern+and+replication+efficiency+of+H5N1+influenza+A+viruses+with+altered+receptor+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity.</a> J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).</li>
<li>Glaser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+1918+influenza+virus+hemagglutinin+changes+receptor+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity.</a> J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).</li>
<li>Herfst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+transmission+of+influenza+A%2FH5N1+virus+between+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets.</a> Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).</li>
<li>Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+receptor-binding+specificity+of+recent+human+influenza+A+viruses+%28H3N2%29%3A+a+single+amino+acid+change+in+hemagglutinin+altered+its+recognition+of+sialyloligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides.</a> Virology. 278 (2), 587-596 (2000).</li>
<li>Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+assay+for+influenza+virus+receptor-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity.</a> J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).</li>
<li>Totani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+and+application+of+glycopolymers+containing+multivalent+sialyloligosaccharides+with+a+poly%28L-glutamic+acid%29+backbone+for+inhibition+of+infection+by+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses.</a> Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).</li>
<li>Gambaryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+specificity+of+influenza+viruses+from+birds+and+mammals%3A+new+data+on+involvement+of+the+inner+fragments+of+the+carbohydrate+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain.</a> Virology. 334 (2), 276-283 (2005).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+specificity+of+influenza+A+viruses+correlates+with+the+agglutination+of+erythrocytes+from+different+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species.</a> Virology. 227 (2), 493-499 (1997).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+human-type+receptor+binding+specificity+by+new+H5N1+influenza+virus+sublineages+during+their+emergence+in+birds+in+Egypt%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt.</a> PLoS Pathog. 7 (5), e1002068(2011).</li>
<li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+topology+determines+human+adaptation+of+avian+H5N1+virus+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin.</a> Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).</li>
<li>Childs, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-binding+specificity+of+pandemic+influenza+A+%28H1N1%29+2009+virus+determined+by+carbohydrate+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).</li>
<li>Nycholat, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Sialylated+Poly-N-acetyllactosamine+Chains+on+N-+and+O-Linked+Glycans+by+Human+and+Avian+Influenza+A+Virus+Hemagglutinins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).</li>
<li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li>
<li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sialylated+glycan+microarray+reveals+novel+interactions+of+modified+sialic+acids+with+proteins+and+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).</li>
<li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+H3N2+Influenza+Viruses+Isolated+from+1968+To+2012+Show+Varying+Preference+for+Receptor+Substructures+with+No+Apparent+Consequences+for+Disease+or+Spread%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li>
<li>Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarray+technologies%3A+tools+to+survey+host+specificity+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).</li>
<li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+hemagglutinin+protein+of+the+new+pandemic+H1N1+influenza+virus%3A+maintaining+optimal+receptor+binding+by+compensatory+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions.</a> J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+receptor+binding+preferences+of+recombinant+human+A%28H3N2%29+virus+hemagglutinins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins.</a> Virology. 477, 18-31 (2015).</li>
<li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influenza+A+virus+hemagglutinin+glycosylation+state+affects+receptor-binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity.</a> Virology. 403 (1), 17-25 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Ocena swoistości receptora IAV jest ważnym krokiem w analizie potencjału pandemicznego ptasich wirusów. Rozpoznawanie kwasu sjalowego przez wirusa jest związane z kilkoma właściwościami biologicznymi, takimi jak wiązanie się z komórką i uwalnianie z niej. Wiedza o tym, jakie mutacje aminokwasów są niezbędne, aby ptasie wirusy mogły wiązać α2-6 i przekroczyć barierę gatunkową, umożliwia przygotowanie się na pandemię. W celu określenia swoistości receptora stosuje się kilka testów; Jednak wszystkie mają swoje wady, w tym t...

Dzikie ptactwo wodne jest naturalnym rezerwuarem dla IAV, ale IAV jest w stanie przekroczyć barierę gatunkową dla drobiu i ssaków, w tym ludzi. Ptasie wirusy inwazyjne rozpoznają kwasy sjalowe sprzężone z α2-3 (receptory typu ptasiego), podczas gdy ludzkie wirusy wiążą kwasy sjalowe sprzężone z α2-6 (receptory typu ludzkiego). Aby móc skutecznie replikować się i przenosić między ludźmi, ptasi wirus IAV musi wiązać się z receptorami typu ludzkiego 1.
IAV są podzielone na podstawie serologii, która charakteryzuje antygenowość ich otoczek hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA). HA wiąże się z kwasami sjalowymi, podczas gdy NA jest enzymem niszczącym receptory na drugim końcu cyklu życiowego wirusa i rozszczepia kwas sjalowy 2. Wszystkie wirusy zakażające ludzi, w tym H1N1, H2N2 i H3N2, mają ptasie pochodzenie 3. W ciągu ostatnich dwóch dekad doszło do kilku krzyżówek ptaków z ludźmi, z których najbardziej znane są H5N1, H7N7 i H7N9; jednak inne podtypy zakażały ludzi bardziej sporadycznie (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Na szczęście wydaje się, że żaden z tych wirusów nie był w stanie w pełni przystosować się do receptorów kwasu sjalowego 5-8 związanych z α2-6 typu ludzkiego. Adaptacja ptasich lub innych odzwierzęcych wirusów do replikacji i przenoszenia w organizmie ludzkiego gospodarza może mieć katastrofalny wpływ na zdrowie ludzi. W związku z tym wcześniejsza wiedza na temat tego, w jaki sposób wirusy te ewoluują, aby wiązać receptory typu ludzkiego, pomoże w ogólnoświatowym nadzorze nad pojawiającymi się wirusami grypy.
Określenie preferencji receptora zostało po raz pierwszy wyjaśnione przy użyciu erytrocytów różnych gatunków i pozostaje ulubionym testem wśród badaczy grypy 9-12. Wykazanie, że ptasie wirusy rozpoznają kwas sjalowy α2-3, a ludzkie wirusy α2-6 sprzężony z kwasem sjalowym, pierwotnie opierało się na teście wykorzystującym hemaglutynację erytrocytów zmodyfikowanych enzymatycznie tak, aby zawierały każde z wiązań 13,14. Chociaż odczytem jest hemaglutynacja, standardowy test dla wirusologów, podstawowe struktury glikanów nie są zdefiniowane, a jedynie wiązanie końcowe. Dodatkowo, ograniczona dostępność sjalilotransferaz, stosowanych do re-sialyacji komórek, ograniczyła zastosowanie tego testu 15-18. Następnie wprowadzono inne metody określania preferencji wiązania receptorów przy użyciu sjalylowanych struktur glikanowych połączonych ze strukturami poliakrylamidu (PAA) lub poliglutaminianu (PGA) w testach na płytkach 19,20. Możliwe jest kilka wariantów powlekania glikanów lub wirusów na płytkach do mikromiareczkowania, z których każda daje solidny, wiarygodny i bardzo czuły test ELISA 21-23. Alternatywnie, glikany związane z biotyną mogą zastąpić PAA/PGA i mogą być sprzężone z płytkami pokrytymi streptawidyną 2,24. Chociaż niektóre specyficzne surowice mogą być wymagane, testy ELISA są standardowe, a kilka glikanów związanych z PAA jest łatwo dostępnych komercyjnie i niekomercyjnie (Consortium for Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Technologie mikromacierzy glikanów okazały się nieocenionym narzędziem do określania specyficzności receptorów, ponieważ wykrywa się wiele różnych glikanów, a wiązanie z szeroką gamą różnych struktur można ocenić w ramach jednego testu 25-29. Wiązanie IAV z tymi strukturami zapewnia lepsze zrozumienie struktur glikanów, które IAV preferencyjnie rozpoznaje 30-33. Mikromacierze glikanów wymagają niewielkiej objętości próbki do przeprowadzenia testu wiązania i wykorzystują tylko niewielkie ilości glikanu na plamkę (2 nl). Jednak macierze te są zwykle używane tylko do oceny swoistości receptorów glikanów. Analiza wielu wirusów lub białek hemaglutyniny w różnych zakresach stężeń może być zaporowa ze względu na wymaganą liczbę preparatów. Co więcej, do tej pory nie opracowano testu względnej awidności przy użyciu technik macierzy glikanowej.
Aby połączyć niskie wymagania dotyczące próbek zapewniane przez techniki mikromacierzy glikanowych i czułość glikanów połączonych z PAA w testach opartych na ELISA, staraliśmy się opracować wielodołkową matrycę glikanów, która pozwoliłaby na analizę o wysokiej przepustowości z podobną lub lepszą rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnego testu opartego na ELISA. Jednocześnie zależało nam na zminimalizowaniu ilości spożywanych środków biologicznych i reporterowych. Ostatecznym rezultatem jest zminiaturyzowany test awidności, opracowany specjalnie do monitorowania swoistości IAV i ma również zastosowanie do oceny innych białek wiążących glikany. Za pomocą szklanego szkiełka podzielonego na 48 mikrodołków za pomocą maski teflonowej, wykrywa się 6 różnych glikanów w 6 powtórzeniach na studzienkę. Platforma mikromacierzy zapewnia te same trendy w wiązaniu receptorów, co w formacie makro ELISA, z kilkoma zaletami. Obejmują one (I) drukowanie związku w 6 powtórzeniach, przy użyciu minimalnej próbki, w porównaniu z powlekaniem kilku rzędów na płytce, przy użyciu 100 μl na studzienkę; (II) wiele różnych związków analizowanych jednocześnie w jednym odwiercie, w tym kontrole; (III) ogromny spadek objętości inkubacji oraz; (IV) większy zakres dynamiki przy użyciu odczytu fluorescencyjnego. Można obliczyć, że pojedyncze szkiełko jest równoważne 18 płytkom 96-dołkowym.
Z poniższym protokołem, każde laboratorium zdolne do wytwarzania i analizowania mikrotablic powinno być w stanie wyprodukować ten zminiaturyzowany format ELISA.

<table><tbody><tr><td>NEXTERION&reg; Slajd H MPX-48&nbsp;</td><td>Prowadnice Schott</td><td>1091525</td><td>Microwell</td></tr><tr><td>ProScanArray Plus&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>wycofał</td><td>skaner konfokalny</td></tr><tr><td>Skaner Innoscan 1100AL/Oprogramowanie Mapix</td><td>Innopsys-konfokalny</td><td></td> <td>skaner mikromatrycowy</td></tr><tr><td>MicroGrid II&nbsp;</td><td>Drukarka mikroprocesorowa</td> <td>Digilab-SNA</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Vector Labs</td><td>B-1305&nbsp;</td><td>Lektyna roślinna</td></tr><tr><td>ECA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1145&nbsp;</td><td>Lektyna roślinna</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw paciorkowca</td><td>IBA</td><td>2-1509-001&nbsp;</td><td>Korpus Anitbody do wiązania HA</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa-647</td><td>Life</td><td>A-21235</td><td>Anitbody do wiązania HA</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287&nbsp;</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>dwuzasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td>składnik buforowy do drukowania</td></tr><tr><td>monozasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma</td><td>229903&nbsp;</td><td>Komponent bufora wydruku</td></tr><tr><td>roztwór poli-l-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P8920&nbsp;</td><td>Komponent szkiełka wstępnego</td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td>składnik szkiełka wstępnego</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>493546</td><td>składnik szkiełka wstępnego</td></tr> sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanem Corning</td><td></td><td>46-013-CM</td><td>bufor do inkubacji/mycia</td></tr><tr><td>szpilki SMP4B Przypinka</td><td>drukarska</td><td>Telechem</td><td>SMP4B</td></tr><tr><td>Sprężony azot (klasa 5)</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td>ogólne narzędzie do odkurzania/suszenia</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>Odczynnik blokujący szkiełko</td></tr><tr><td>etanoloamina</td><td>Sigma</td><td>E9508-500ML</td><td>Odczynnik blokujący szkiełko</td></tr><tr><td>Atto 488</td><td>AttoTec</td><td>AD 488-91</td><td>Znacznik siatki na tablicy</td></tr><tr><td>PAA-LNLN</td><td>Konsorcjum ds. Glikomiki Funkcjonalnej</td><td>PA368</td><td>Glikany plamiste</td></tr><tr><td>PAA-3SLNLN</td><td>Konsorcjum ds. Glikomika Funkcjonalna</td><td>PA362</td><td>Glikany Plamiste</td></tr><tr><td>PAA-6SLNLN</td><td>Konsorcjum Glikomiki Funkcjonalnej</td><td>PA343</td><td>Glikany Plamiste</td></tr><tr><td></td><td>Konsorcjum LNLN Glikomiki Funkcjonalnej</td><td>Te98</td><td>Glikany Plamiste</td></tr><tr><td>3SLNLN</td><td>Konsorcjum Glikomiki Funkcjonalnej</td><td>Te175</td><td>Glikany Plamiste</td></tr><tr><td>6SLNLN</td><td>Konsorcjum Glikomiksu Funkcjonalnego</td><td>Te176</td><td>Glikany plamiste</td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka do mikromiareczkowania</td><td>Matrix TechCorp</td><td>4361</td><td>Płyta drukarska</td></tr><tr><td>Marker laboratoryjny VWR</td><td>VWR</td><td>52877-150</td><td>Numeracja slajdów</td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia szkiełek</td><td>Wheaton Sigma</td><td>Z103969-1EA</td><td>Blokowanie i suszenie</td></tr></tbody></table>

zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy a

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Hemaglutyniny wirusa grypy A (IAV) rozpoznają kwasy sjalowe na powierzchni komórki jako funkcjonalne receptory, które dostają się do komórek. Dzikie ptactwo wodne jest naturalnym rezerwuarem IAV, ale IAV może przekroczyć barierę gatunkową dla drobiu, trzody chlewnej, koni i ludzi. Ptasie wirusy rozpoznają kwas sjalowy przyłączony do przedostatniej galaktozy za pomocą wiązania α2-3 (receptory typu ptasiego), podczas gdy wirusy ludzkie preferencyjnie rozpoznają kwas sjalowy z wiązaniem α2-6 (receptory typu ludzkiego). Aby monitorować, czy ptasie wirusy przystosowują się do receptorów typu ludzkiego, można zastosować kilka metod. Mikromacierze glikanów z różnymi bibliotekami syntetycznych sialozydów są coraz częściej wykorzystywane do oceny swoistości receptorowej. Jednak ta technika nie jest używana do pomiaru awidności. Pomiar awidności jest zwykle osiągany poprzez ocenę wiązania seryjnie rozcieńczonej hemaglutyniny lub wirusa z glikanami zaadsorbowanymi na konwencjonalnych 96-dołkowych płytkach polipropylenowych. W tym teście glikany z kwasami sjalowymi α2-3 lub α2-6 są sprzężone z biotyną i adsorbowane na płytkach streptawidyny lub są sprzężone z poliakrylamidem (PAA), który bezpośrednio adsorbuje się na tworzywie sztucznym. Znacznie zminiaturyzowaliśmy ten test, bezpośrednio drukując sialozydy związane z PAA i ich niezwiązane z PAA odpowiedniki na szkiełkach mikrodołkowych. Ta konfiguracja, z 48 matrycami na jednym szkiełku, umożliwia jednoczesne oznaczanie 6 białek wiążących glikany w 8 rozcieńczeniach, badając 6 różnych glikanów, w tym dwie kontrole bez sjalilacji. Jest to odpowiednik 18 płytek 96-dołkowych w tradycyjnym teście płytkowym. Format macierzy glikanowej zmniejsza zużycie związków i środków biologicznych, a tym samym znacznie zwiększa wydajność.

Drukowanie, skanowanie i analizy danych
Aby zapewnić prawidłowy wydruk, niezbędne jest właściwe wyrównanie siatki naniesionych plamek wewnątrz maski teflonowej, która wyznacza każdą macierz na szkiełku. Podczas drukowania, ze względu na naturę powłoki teflonowej, plamki na szkiełkach MPX nie są widoczne gołym okiem. Zwraca się wówczas uwagę na wygląd wstępnych plamek na szkiełkach powlekanych poli-L-lizyną. Bezpośrednio po wydru...

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Ogólnym celem tej zminiaturyzowanej macierzy glikanowej jest analiza swoistości i awidności hemaglutynin wirusa grypy A. Ten test może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące wiązania receptorów i awidności wirusa grypy A. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego określenia swoistości oraz względnej awidności wiązania w ramach jednego testu, co zazwyczaj nie jest osiągalne w typowych macierzach glikanowych i testach płytkowych.Niniejszy protokół rozpoczyna się od przygotowania próbek glikanów. Roztworem podstawowym dla glikanów jest bufor do drukowania, który po przygotowaniu należy powoli miareczkować do pH 8,5, a następnie dodać surfaktant. Używając przygotowanego buforu do drukowania, należy rozcieńczyć glikany sprzężone z PAA do stężenia 100 µg/mL.Następnie rozcieńcz monowalentne glikany do stężenia 100 µM w buforze do drukowania. Na koniec przygotuj roztwory robocze barwników funkcjonalizowanych aminą o stężeniu 1 µM. Teraz nanieś 10 µL każdej próbki glikanu do dołka płytki mikrotitracyjnej 384-dołkowej.Jest to wystarczająca ilość roztworu do wydrukowania pięciu slajdów. Następnie przenieś 10 µL markera barwnikowego do jednej dołki płytki do drukowania. Przygotuj się do drukowania macierzy, najpierw ustawiając piny arrayera i głowicę drukującą zgodnie z układem.W tym przypadku jedna igła może nanieść wszystkie próbki. Matryce glikanów są nanoszone w blokach po sześć, otoczonych pustymi miejscami z każdej strony. Przed obsługą szkiełek należy założyć rękawiczki.Rozpakuj je i zdmuchnij wszelkie zanieczyszczenia z ich powierzchni za pomocą azotu o ultrawysokiej czystości. Następnie umieść szkiełka na stole urządzenia do tworzenia macierzy stroną pokrytą do góry. Następnie zaprogramuj urządzenie.W tym przypadku zaprogramuj 27 punktów na każdą wizytę w płytce źródłowej. Trzy punkty wstępne, umieszczone w obszarze poza matrycą na szkiełku pokrytym poli-L-lizyną, służą do usunięcia nadmiaru cieczy z końcówki pinu. Pozostałe 24 punkty na wizytę pinu są wykorzystywane do naniesienia sześciu punktów w czterech powtórzonych matrycach.Szczegóły znajdują się w protokole tekstowym. Teraz należy wprowadzić płytki wielodołkowe do drukarki i rozpocząć drukowanie matryc. Podczas drukowania należy upewnić się, że wilgotność utrzymuje się w przedziale od 55 do 65%. Należy zwrócić uwagę na wygląd wstępnych plamek (pre spots) na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną.Po wydrukowaniu należy przeprowadzić kontrolę wizualną każdego slajdu. Niezwykle ważne jest sprawdzenie, czy plamki są prawidłowo wyrównane w obrębie teflonowych obramowań, a także weryfikacja poprawności liczby naniesionych elementów. Aby pomóc w homogenizacji przylegania kropek, zaraz po ich naniesieniu należy umieścić wydrukowane slajdy stroną roboczą do góry w komorze o 100% wilgotności.Wyłożyć pojemnik oraz prowizoryczną podstawkę mokrymi ręcznikami papierowymi. Owinąć komorę folią plastikową, aby zatrzymać wilgoć wewnątrz. Po pół godziny wyjąć preparaty.Następnie ponumeruj preparaty markerem odpornym na rozpuszczalniki i przechowuj je w pochłaniaczu wilgoci przez noc. Następnego dnia przygotuj świeży roztwór buforu blokującego, intensywnie mieszając. Dostosuj pH do poziomu 9.2 za pomocą stężonego wodorotlenku sodu.Następnie inkubuj preparaty w buforze przez godzinę. Aby usunąć blokadę, wypłucz preparaty w wodzie dwukrotnie destylowanej. Następnie przenieś preparaty do szklanych koszyczków do barwienia i umieść koszyczki w wirówce z wahadłowymi uchwytami, aby osuszyć preparaty przez wirowanie przy 10 G przez pięć minut.Po wyschnięciu, w razie potrzeby, przechowywać preparaty w temperaturze -20 °C w szczelnych plastikowych woreczkach. W ramach przygotowań należy przygotować kolejną komorę nawilżającą w taki sam sposób jak poprzednio. Aby wykryć unieruchomione glikany, należy przygotować biotynilowane lektyny SNA i ECA w stężeniu 10 µg/mL w buforze do sondowania, a do każdego rozcieńczenia dodać 2 µg/mL streptawidyny 555.Aby przeprowadzić barwienie hemaglutyninami, należy przygotować roztwór przeciwciał w kompleksie o stężeniu 20 µg/mL w buforze blokującym w stosunku molowym 4:2:1, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieś 20 µL przygotowanych roztworów do dołków płytki 384-dołkowej. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia lektyn i hemaglutynin w stosunku 1:1 w odpowiednich buforach.Przygotuj osiem rozcieńczeń, wypełniając każdą studzienkę 10 µL próbki i 10 µL buforu. Następnie inkubuj płytkę na lodzie przez 30 minut. Teraz dodaj 8 µL każdego rozcieńczenia do jednej z 48 mikrostudzienek na drukowanym szkiełku.Następnie inkubować przygotowany preparat w komorze nawilżającej przez 90 minut. Po 90 minutach wypłukać preparat, trzymając go za krawędź; zanurzyć go czterokrotnie w PBS-T, następnie czterokrotnie w PBS i na koniec czterokrotnie w wodzie dejonizowanej. Teraz osuszyć preparat za pomocą wirówki, tak jak wcześniej.Po osuszeniu przez wirowanie natychmiast zeskanuj preparat. Należy upewnić się, że preparat został ostrożnie włożony do skanera w odpowiedniej orientacji. Przy użyciu niskiej mocy lasera wynoszącej 5 mW wykonaj iteracyjne skanowanie preparatów, stopniowo zwiększając wzmocnienie (gain) z 25 do 75%. Optymalizując ustawienia skanowania, należy pamiętać, że fluorofory będą ulegać blaknięciu podczas wielokrotnego skanowania.Przeanalizuj zapisany obraz pod kątem sygnałów wiązania, korzystając z powiązanego oprogramowania. Można wczytać listę matrycy zawierającą wzór naniesienia próbek. Nałóż ją na skan, aby ułatwić nawigację po rozmieszczeniu znaczników siatki.Następnie należy użyć oprogramowania do analizy intensywności plamek i zapisać wyniki w formie pliku tekstowego z rozdzielaczem tabulacyjnym, aby wyeksportować je do arkusza kalkulacyjnego lub innego pakietu statystycznego. Przeanalizuj dane, obliczając średnią intensywność sygnału pomniejszoną o tło. Wyznacz średnią z czterech z sześciu powtórzeń plamek dla każdej próbki, pomijając sygnał najwyższy oraz najniższy.Następnie należy sporządzić wykres liniowy średniego sygnału pomniejszonego o tło w zależności od ośmiu stężeń białka. Powstałą linię należy wygładzić za pomocą regresji nieliniowej. Matrycę PAA wykorzystano do oceny specyficzności wiązania receptorowego hemaglutynin wirusa grypy A.Matryca zawierała kontrole niesjalilowane w tych samych mikrodofkach. Jako kontrole pozytywne wykorzystano lektyny roślinne o znanej specyficzności względem naniesionych związków. Lektyna ECA wiązała terminalną galaktozę z wiązaniem beta 1-4 do N-acetyloglukozaminy i nie wiązała tego samego związku, jeśli terminalna galaktoza była zablokowana kwasem sialowym.Do badania kwasu sialowego z wiązaniem $\alpha$ 2-6 wykorzystano lektynę SNA. Zgodnie z oczekiwaniami, SNA wiązała się wyłącznie z kwasami sialowymi z wiązaniem $\alpha$ 2-6, wykazując jednak istotne różnice w powinowactwie do powtórzeń lacNAc barwionych z użyciem PAA w porównaniu do powtórzeń niepowiązanych z PAA. Następnie przetestowano hemaglutyninę H5 pochodzącą z wirusa Vietnam/1203/04, która rozpoznaje wyłącznie kwasy sialowe z wiązaniem $\alpha$ 2-3.Profil wiązania hemaglutyniny H5 wykazał oczekiwaną swoistość z wyższą awidnością wobec struktur związanych z PAA. Na koniec przetestowano hemaglutyninę H1 z ludzkiego sezonowego szczepu H1N1. Zgodnie z oczekiwaniami, hemaglutynina ta wiązała się wyłącznie ze strukturami zawierającymi kwas sialowy z wiązaniem alfa 2-6.Po opanowaniu ta technika pozwala na ujawnienie swoistości wiązania i względnej awidności wirusów grypy w ramach jednego testu. Metoda ta znacznie zwiększy wydajność testów wiązania wirusa grypy, a jednocześnie zmniejszy zużycie cennych materiałów biologicznych.

a-miniaturized-glycan-microarray-assay-for-assessing-avidity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowano prostą metodę slot blot do ilościowego oznaczania hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy przy użyciu uniwersalnych przeciwciał skierowanych przeciwko ich najbardziej konserwatywnym sekwencjom, zidentyfikowanym za pomocą analiz bioinformatycznych. To innowacyjne podejście może stanowić przydatną alternatywę dla ilościowego określania wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusowych.

Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A z wykorzystaniem uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot blot

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

W tym filmie pokazujemy proces wykrywania izotypów przeciwciał w wielu próbkach ludzkiej surowicy za pomocą szkiełka mikromatrycowego wydrukowanego z antygenowymi podtypami szczepów wirusa grypy.

Test mikromacierzy antygenu wirusowego do wykrywania izotypów przeciwciał w surowicy przeciwko antygenowi wirusowemu

Film demonstruje test hamowania hemaglutynacji do wykrywania przeciwciał surowicy przeciwko określonym antygenom. Potwierdzenie zahamowania hemaglutynacji w studzience testowej i hemaglutynacji w studzience kontrolnej uzyskuje się za pomocą wyraźnych wzorców wizualnych. Test ten odgrywa kluczową rolę w ocenie odpowiedzi immunologicznej, skuteczności szczepionki i badaniu infekcji wirusowych w wirusologii i immunologii.

Test zahamowania hemaglutynacji w celu wykrycia przeciwciał w surowicy przeciwko antygenowi docelowemu

Film demonstruje test do ilościowego oznaczania wirusów grypy A i B. Test ten wykorzystuje namnażanie endonukleazy za pomocą starterów specyficznych dla grypy i wykrywanie celów za pomocą sond molekularnych.

Test molekularny do ilościowego oznaczania wirusów grypy A i B

Ten film pokazuje test mierzący miano przeciwciał influenza neuraminidazy (NA) w próbce surowicy. Próbkę surowicy zawierającą przeciwciała przeciwko NA dodaje się do płytki mikrodołkowej pokrytej fetuiną. Po dodaniu wirusa przeciwciała zapobiegają rozszczepianiu przez wirusa NA fetuiny i odsłanianiu jej ugrupowania galaktozy. Następnie dodaje się lektynę sprzężoną z peroksydazą, która wiąże się z odsłoniętą galaktozą. Miano przeciwciał hamujących NA określa się za pomocą testu...

Test do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy

Opisujemy test lektyny sprzężony z enzymem (ELLA) do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy (NA) w surowicach. Test wykorzystuje aglutyninę z orzeszków ziemnych do ilościowego określenia reszt galaktozy, które stają się dostępne, gdy NA usuwa kwas sjalowy z 96-dołkowych płytek pokrytych fetuiną.

Pomiar mian przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy za pomocą testu lektyny sprzężonej z enzymem

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Przedstawione protokoły opisują, jak przeprowadzić test hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla grypy z próbek surowicy biorców szczepionki przeciw grypie. Pierwszy test określa optymalne stężenia antygenu wirusowego za pomocą hemaglutynacji. Drugi test określa ilościowo miana przeciwciał swoistych dla grypy poprzez hamowanie hemaglutynacji.

Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy

Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.

Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy

Przedstawiamy protokół użycia mikromatrycy białkowej zbudowanej przez drukowanie antygenów grypy na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą do jednoczesnego sondowania surowicy pod kątem wielu izotypów przeciwciał przeciwko ponad 250 antygenom z różnych szczepów wirusa, umożliwiając w ten sposób pomiar szerokości przeciwciał w surowicy dla różnych podtypów wirusa.

Wykorzystanie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w różnych podtypach wirusa

Poznaj zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A. Ta metoda umożliwia jednoczesną analizę specyficzności i wiązania receptorów w pojedynczym badaniu.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Przeglądaj więcej filmów