Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Ogólnym celem tej zminiaturyzowanej macierzy glikanów jest analiza swoistości i awidności hemaglutynin wirusa grypy A. Test ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące wiązania i awidności receptora wirusa grypy A. Główną zaletą tej techniki jest to, że w ramach jednego testu możemy zająć się zarówno swoistością, jak i względną awidnością wiązania, co zwykle nie jest osiągane w typowych testach z matrycą glikanów i płytkami.

Protokół ten rozpoczyna się od przygotowania próbek glikanów. Roztworem bazowym glikanów jest podstawowy bufor drukarski, który po przygotowaniu powinien być powoli miareczkowany do pH 8,5, a następnie podawany z dodatkiem środka powierzchniowo czynnego. Za pomocą przygotowanego buforu drukującego rozcieńczyć glikany sprzężone z PAA do 100 mikrogramów na mililitr.

Następnie rozcieńczyć jednowartościowe glikany do 100 mikromolów również w buforze drukującym. Na koniec wykonaj zapasy robocze barwników funkcjonalizowanych aminami w jednym mikromolu. Teraz załaduj dziesięć mikrolitrów każdej próbki glikanu do dołka z 384-dołkową płytką do mikromiareczkowania.

Jest to wystarczające rozwiązanie do wydrukowania pięciu slajdów. Przenieś również dziesięć mikrolitrów markera barwnikowego do jednego dołka płyty drukarskiej. Przygotuj się do drukowania tablic, najpierw ustawiając piny macierzy i głowicę drukującą zgodnie z układem.

W takim przypadku jeden pin może wydrukować wszystkie próbki. Tablice glikanów są drukowane w blokach po sześć sztuk otoczonych pustym miejscem ze wszystkich stron. Załóż rękawiczki, aby poradzić sobie ze slajdami.

Rozpakuj je i zdmuchnij wszelkie zanieczyszczenia z ich powierzchni za pomocą azotu o ultra wysokiej czystości. Następnie umieść slajdy powlekane stroną do góry na stoliku tablicy. Następnie zaprogramuj macierz.

W takim przypadku należy zaprogramować 27 miejsc na wizytę na płycie źródłowej. Trzy punkty wstępne umieszczone w obszarze nieobjętym matrycą szkiełka pokrytego poli-L-lizyną służą do usuwania nadmiaru cieczy na końcówce kołka. Pozostałe 24 miejsca na wizytę pinezki są używane do umieszczenia sześciu punktów w czterech replikowanych tablicach.

Szczegóły znajdują się w protokole tekstowym. Teraz załaduj płytki wielodołkowe do drukarki i rozpocznij drukowanie tablic. Podczas drukowania upewnij się, że wilgotność utrzymuje się w przedziale od 55 do 65%Zwróć uwagę na wygląd wstępnych plam na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną.

Po wydrukowaniu sprawdź wzrokowo każdy slajd. Sprawdź, czy plamki w granicach teflonu są prawidłowo wyrównane, co jest niezbędne, i sprawdź, czy liczba dostrzeżonych elementów jest prawidłowa. Aby ujednolicić mocowanie kropek, umieść wydrukowane szkiełka w komorze o wilgotności 100% zadrukowaną stroną do góry natychmiast po ich wykonaniu.

Użyj mokrych ręczników papierowych do wyłożenia pojemnika i prowizorycznego stojaka. Owiń komorę folią, aby zatrzymać wilgoć. Po pół godzinie wyjmij szkiełka.

Następnie ponumeruj szkiełka markerem odpornym na rozpuszczalniki i przechowuj je na noc w pudełku do wysuszania. Następnego dnia przygotować świeży bulion z buforu blokującego, energicznie mieszając. Dostosować pH 9,2 za pomocą stężonego wodorotlenku sodu.

Następnie inkubuj szkiełka w buforze przez godzinę. Aby usunąć blokadę, opłucz szkiełka w wodzie podwójnie destylowanej. Następnie przenieś szkiełka do szklanych uchwytów do barwienia i załaduj je do wahadłowego uchwytu na talerze, aby obracać szkiełka do sucha w temperaturze 10 G przez pięć minut.

Po wyschnięciu, w razie potrzeby, przechowuj szkiełka w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w szczelnie zamkniętych plastikowych torebkach. W przygotowaniu wykonaj kolejną komorę nawilżania, jak poprzednio. Aby wykryć unieruchomione glikany, należy przygotować biotynylowane lektyny SNA i ECA w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr w buforze sondującym i dodać dwa mikrogramy na mililitr streptawidyny 555 do każdego rozcieńczenia.

Aby zabarwić hemaglutyninami, należy przygotować roztwór przeciwciał pre-complex w proporcji 4 do 2 mikrogramów na mililitr w buforze blokującym w stosunku od czterech do dwóch do jednego mola, jak opisano w protokole tekstowym. Przenieś 20 mikrolitrów przygotowanych roztworów do studzienek na płytce 384-dołkowej. Następnie należy seryjnie rozcieńczyć lektyny i hemaglutyniny jeden do jednego w ich odpowiednich.

Wykonać osiem rozcieńczeń, wypełniając każdą studzienkę 10 mikrolitrami próbki i 10 mikrolitrami buforu. Teraz inkubuj płytkę na lodzie przez 30 minut. Teraz dodaj osiem mikrolitrów każdego rozcieńczenia do jednej z 48 mikrostudzienek na wydrukowanym szkiełku.

Następnie inkubuj przygotowane szkiełko w komorze nawilżania przez 90 minut. Po 90 minutach umyj szkiełko, trzymając je od krawędzi; zanurz go w PBS-T cztery razy, następnie zanurz w PBS cztery razy, a na koniec czterokrotnie zanurz w wodzie dejonizowanej. Teraz odwiruj szkiełko jak poprzednio.

Po odwirowaniu natychmiast zeskanuj szkiełko. Pamiętaj, aby ostrożnie załadować szkiełko do skanera we właściwej orientacji. Korzystając z niskiej mocy lasera wynoszącej pięć miliwatów, iteracyjnie skanuj slajdy, stopniowo zwiększając wzmocnienie od 25 do 75%Optymalizując ustawienia skanowania, pamiętaj, że fluorofory wybielą się przy wielokrotnych skanowaniach.

Przeanalizuj zapisany obraz pod kątem sygnałów wiążących za pomocą powiązanego oprogramowania. Można załadować listę tablic, która zawiera wzór wykrywania. Nałóż go na skan, aby ułatwić nawigację po rozmieszczeniu znaczników siatki.

Następnie użyj oprogramowania do analizy intensywności plamki i zapisz wyniki jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami w celu wyeksportowania do arkusza kalkulacyjnego lub innego pakietu statystycznego. Przeanalizuj dane, obliczając średnią intensywność sygnału pomniejszoną o tło. Należy przyjąć średnią z czterech z sześciu powtórzonych plamek dla każdej próbki, pomijając najwyższy i najniższy sygnał.

Następnie utwórz wykres liniowy średniego sygnału pomniejszonego o tło na tle ośmiu stężeń białka. Wygładź wynikową linię za pomocą regresji nieliniowej. Macierz PAA wykorzystano do oceny swoistości hemaglutynin wirusa grypy A w wiązaniu z receptorem.

Matryca zawierała niesjalowane kontrole w tych samych mikrostudzienkach. Jako kontrole pozytywne wykorzystano lektyny roślinne o znanej specyfice dla związków drukowanych. Lektyna ECA wiązała się z terminalną galaktozą beta 1-4 połączoną z anacetyloglukozaminą i nie wiązała się z tym samym związkiem, jeśli końcowa galaktoza była pokryta kwasem sjalowym.

Do przetestowania kwasu sjalowego sprzężonego z alfa 2-6 użyto lektyny SNA. Zgodnie z oczekiwaniami, SNA wiązał się tylko z kwasami sjalowymi sprzężonymi z alfa 2-6, ale z zauważalnymi różnicami w powinowactwie do powtórzeń barwnika lacNAc związanych z PAA i bez PAA. Następnie przetestowano hemaglutyninę H5 pochodzącą z wirusa Vietnam/1203/04, który rozpoznaje tylko kwasy sjalowe sprzężone z alfa 2-3.

Profil wiązania hemaglutyniny H5 wykazał oczekiwaną swoistość z większą awidnością dla struktur połączonych z PAA. Na koniec przetestowano hemaglutyninę H1 z ludzkiego sezonowego szczepu H1N1. Zgodnie z oczekiwaniami, ta hemaglutynina wiąże się tylko ze strukturami zawierającymi kwas sjalowy połączony z alfa 2-6.

Po opanowaniu technika ta może ujawnić specyficzność wiązania i względną awidność wirusów grypy w ramach jednego testu. Technika ta znacznie zwiększy skuteczność testów wiązania grypy, a także zmniejszy zużycie cennych środków biologicznych.