Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Ogólnym celem tego testu mikroneutralizacji jest scharakteryzowanie wszystkich typów obecnie krążących wirusów grypy oraz aktywności przeciwciał i pomiarów przeciwwirusowych w sposób ilościowy, wysokoprzepustowy i bardzo czuły. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii, takie jak charakterystyka antygenowa wirusów grypy, ilościowa neutralizacja przeciwciał i aktywność przeciwwirusowa. Główną zaletą tej techniki jest to, że scharakteryzowała ona całą zakażoną populację komórek, w tym widoczne i niewidoczne blaszki oraz infekcje jednokomórkowe.

Test mikroneutralizacji zostanie zademonstrowany przez dr Yipu Lin, zastępcę dyrektora Centrum Współpracy WHO ds. Grypy w Londynie. Poziom bezpieczeństwa biologicznego lub BSL dla poniższego protokołu to BSL 2 dla wirusów grypy sezonowej i BSL 3+ dla potencjalnych wirusów grypy pandemicznej. Na początek podwielokrotność komórek należy podzielić na 96-dołkowe płytki.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez dwa do trzech dni, aby osiągnąć konfluencję. Używając 70% etanolu, wysterylizuj wielodołkową myjkę do płytek i użyj PBS lub VGM do jej wypłukania. Następnie użyj 200 mikrolitrów pożywki wzrostowej wirusa lub VGM, aby umyć zbiegające się komórki.

Odessać VGM z komórek i natychmiast dodać 50 mikrolitrów VGM do każdej studzienki. Następnie dodaj 900 mikrolitrów VGM do każdej z sześciu sterylnych probówek. Następnie odpipetuj 100 mikrolitrów wirusa do pierwszej probówki i dobrze wymieszaj.

Przygotować seryjne rozcieńczenia wirusa, zaczynając od pierwszej probówki, zmieniając końcówki między każdym rozcieńczeniem. Dodać 50 mikrolitrów każdego rozcieńczenia wirusa, zaczynając od najwyższego rozcieńczenia, aby zduplikować studzienki 96-dołkowej płytki. Następnie umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie do trzech godzin, aby wirus mógł zainfekować komórki.

Po przygotowaniu nakładki zgodnie z protokołem tekstowym należy wyjąć inokulum z dołków. Następnie dodaj 200 mikrolitrów nakładki do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc bez zakłóceń. Dodaj 200 mikrolitrów lodowatego 4% PFA w PBS A do studzienek i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut lub w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Po inkubacji odessać PFA i użyć 200 mikrolitrów na studzienkę PBS A do dwukrotnego umycia płytki. Dodaj 100 mikrolitrów buforu przepuszczalnego do płytki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie użyj PBS A, aby dwukrotnie umyć płytkę.

Następnie dodać 50 mikrolitrów do studzienki mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko grypie typu A do studzienek i inkubować w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez godzinę. Po inkubacji użyj 300 mikrolitrów buforu do płukania, aby trzykrotnie przemyć studzienkę. Następnie dodaj 50 mikrolitrów sprzężonego z HRP przeciwciała drugorzędowego koziego do próbek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Po trzykrotnym umyciu studzienek, jak poprzednio, dodać 50 mikrolitrów substratu do studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub do momentu, gdy wyraźnie widoczny będzie rozwój niebieskiego koloru. Aby zatrzymać reakcję, użyj 200 mikrolitrów wody destylowanej do dwukrotnego umycia studzienek. Następnie, po wysuszeniu płytki na powietrzu, przechowuj ją w ciemnym miejscu.

Umieść płytkę studzienkową w obszarze skanowania skanera płaskiego, korzystając z limitu pozycji w kształcie litery L, aby zapewnić uzyskanie optymalnej i powtarzalnej lokalizacji obrazowania. Zeskanuj płytkę, korzystając z ustawień pokazanych tutaj. Następnie uruchom oprogramowanie czytnika płytek studzienkowych, aby obliczyć wymagane stężenie wirusa, klikając przycisk Załaduj obraz, aby załadować obraz.

Następnie na karcie progu globalnego przesuń czerwony pasek na histogramie, aby dostosować próg próbkowania. Następnie kliknij przycisk aktualizacji, aby sprawdzić wpływ na obraz. Teraz zaznacz pole Oblicz neutralizację/miareczkowanie.

Kliknij przycisk Pobieranie próbek, aby określić ilościowo populację zakażonych komórek lub ICP. Następnie, po wyświetleniu monitu, kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać wyniki próbkowania. Aby uzyskać wyniki miareczkowania, należy załadować lub wprowadzić mapę definicji płytki studziennej.

W miareczkowaniu: optymalna populacja wirusa wskaż próg. Wybierz kartę Miareczkowanie (Titration Process (Proces miareczkowania), aby obliczyć wyniki miareczkowania. Następnie sprawdź wyniki miareczkowania przed kliknięciem przycisku Zapisz i zamknij, aby zapisać wyniki.

Zapoznaj się z suplementem S1, aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące oprogramowania. Aby przeprowadzić neutralizację wirusa, przygotuj monowarstwę komórek dwa lub trzy dni wcześniej. Następnie dodaj 50 mikrolitrów VGM do każdego dołka płytki.

Kolumny 11 i 12 należy stosować odpowiednio do kontroli wirusa i kontroli komórek. Dodać 50-mikrolitrowe podwielokrotności surowicy w rozcieńczeniu jeden do 20 enzymu niszczącego receptory lub RDE, do pierwszego rzędu kolumn od 1 do 10. Wykonaj dwukrotne seryjne rozcieńczenia, przenosząc 50 mikrolitrów z rzędu A do rzędu H i odrzucając 50 mikrolitrów z rzędu H. Następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczalnika do każdej studzienki kolumny kontrolnej komórki.

Dodać 50 mikrolitrów wirusa do każdego dołka płytki, z wyjątkiem kolumny kontrolnej komórki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin. Następnie usuń inokulum i dodaj nakładkę do każdej studzienki.

Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez zakłóceń. Następnie napraw i poplam płytki, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Aby określić ilościowo neutralizację, umieść płytkę dołka w obszarze skanowania skanera płaskiego, jak pokazano wcześniej w tym filmie.

Zeskanuj płytkę i uruchom oprogramowanie czytnika płytek studzienkowych, aby obliczyć wymagane miano wirusa, tak jak poprzednio. Po załadowaniu lub wprowadzeniu mapy płyty studziennej, w Neutralizacja:Odliczenie infekcji wskaż próg. Następnie wybierz Proces neutralizacji, aby obliczyć miana.

Na koniec sprawdź miana i kliknij przycisk Zapisz i zamknij, aby zapisać wyniki neutralizacji. Pokazano tutaj wyniki miareczkowania z ostatnich eksperymentów charakterystyki antygenowej ośmiu wirusów wejściowych o rozcieńczeniach od 1,0 razy 10 do ujemnego i 1,0 razy 10 do ujemnych sześciu. Wykres ilustruje, że ICP zmniejszają się wraz ze wzrostem rozcieńczenia wirusa.

Krzywe zostały znormalizowane w stosunku do ICP tych samych wirusów, które spowodowały infekcje we wszystkich komórkach w studni. W tej tabeli wymieniono rozcieńczenia wirusa, które wytworzyły 30% nasycenia ICP, które zostały wybrane jako wejściowe rozcieńczenie wirusa do neutralizacji. Rysunek ten przedstawia wyniki eksperymentu neutralizacji z użyciem jednego wirusa wejściowego przeciwko pięciu surowicom odpornościowym.

Wykres ilustruje proces zakażenia wraz ze wzrostem rozcieńczenia surowicy. Znormalizowana populacja dodatnia na osi pionowej reprezentuje stosunek ICP z odpowiadającej im odpowiedzi na surowice odpornościowe w stosunku do średniego ICP wirusa referencyjnego. Na koniec miana neutralizacji określono jako odwrotności rozcieńczeń surowicy odpowiadające 50% redukcji ICP.

Test ten koncentruje się na spójności, szybkości i czułości wykrywania, w tym ilościowym miareczkowaniu wirusów wejściowych, obrazowaniu o wysokiej przepustowości i przetwarzaniu danych. Jest opłacalny, przyjazny dla użytkownika i jest rutynowo stosowany w badaniach antygenowych wirusów.