Name: Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj zoptymalizowany test mikroneutralizacji do ilościowej analizy wirusów grypy i aktywności przeciwciał. Metoda wykorzystuje skaner płaski i zapewnia wysoką czułość oraz przepustowość w badaniach wirusologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. M. Matrosovichowi za dostarczenie macierzystych linii komórkowych MDCK i MDCK-SIAT1 oraz firmie Roche Pharmaceuticals za dostarczenie karboksylanu oseltamiwiru. Dziękujemy również dr Anne Weston za cenne sugestie dotyczące manuskryptu. Badanie to było uzależnione od cennej współpracy Krajowych Centrów ds. Grypy WHO i CC WHO w ramach GISRS WHO, którzy dostarczyli wykorzystane wirusy grypy. Prace te zostały sfinansowane przez Radę ds. Badań Medycznych w ramach Programu U117512723.

UWAGA: Poziom bezpieczeństwa biologicznego (BSL) dla poniższego protokołu to BSL 2 dla wirusów grypy sezonowej i BSL 3+ dla potencjalnych wirusów grypy pandemicznej. Miareczkowanie wirusa jest wymagane przed eksperymentem neutralizacji, aby zdecydować o stężeniu wirusa w kontroli wirusa (VC).
1. Miareczkowanie wirusa
UWAGA: W zależności od liczby wirusów i liczby duplikatów, można ustawić płytkę studzienkową z następującymi elastycznościami: (1) Rozcieńczenie wirusa może być ułożone wzdłuż rzędów lub kolumn (Rysunek 1). Każdy wirus powinien zajmować osobny wiersz/kolumnę. (2) Przyrost rozcieńczenia wirusa jest elastyczny, ale powinien zaczynać się od najwyższego stężenia wirusa w lewym górnym rogu. (3) Nie ma ograniczeń co do liczby duplikatów.
UWAGA: Komórki nerki psa Madin Darby (MDCK) i MDCK-SIAT1 (SIAT) zostały uprzejmie dostarczone przez Dr. M. Matrosovich, Marburg, Niemcy10. Komórki SIAT to komórki MDCK stabilnie transfekowane ludzkim genem CMP-N-acetyloneuraminianu: β-galaktozydu α-2,6-sialylotransferazy w celu zwiększenia ekspresji oligosacharydów zakończonych kwasem sjalowym (SA) α2-6Gal.
<ol>
	<li>Podzielić wystarczającą ilość komórek MDCK lub komórek MDCK-SIATz 8 na płytki 96-dołkowe (200 μl/dołek). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 lub 3 dni, aby osiągnąć konfluencję. Rozmnażaj komórki w DMEM uzupełnione 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą (FCS) i antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Inkubować komórki SIAT w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 1 mg/ml siarczanu G418. 
	UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia zależy od doświadczenia i użytej linii komórkowej. Monowarstwa komórkowa musi być zlewająca się (tj. bez ściany komórkowej lub widocznego konturu dla komórek MDCK i ciasno upakowany układ dla komórek MDCK-SIAT1) w momencie inokulacji wirusa. Przykłady rozcieńczeń opartych na subkulturze zlewających się kolb komórek MDCK lub MDCK-SIAT1 podano w Tabeli 1.</li>
	<li>Przemyć komórki 3 razy 200 μl pożywki wzrostowej wirusa (VGM) na dołek. Sterylizuj wielościenną podkładkę płytkową z 70% EtOH przez 30 minut, a następnie wypłucz ją w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub VGM przed myciem.</li>
	<li>Zassać VGM i natychmiast dodać 50 μl VGM do każdej studzienki.</li>
	<li>Dodaj 900 μl VGM do każdej z 6 sterylnych probówek (lub mniej, w zależności od liczby testowanych wirusów i duplikatów). Odpipetować 100 μl wirusa do pierwszej probówki, dobrze wymieszać i seryjnie rozcieńczyć, zmieniając końcówki między każdym rozcieńczeniem. Powtórz te czynności dla każdego wirusa, który ma być stopniowo miareczkowany. 
	UWAGA: Spowoduje to rozcieńczenie wirusa od 10-1 do 10-6.</li>
	<li>Dodać 50 μl każdego rozcieńczenia wirusa, zaczynając od najwyższego rozcieńczenia (1 x 10-5 na rysunku 1), do zduplikowanych studzienek (kolumny 9 i 10 na rysunku 1) płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C na 2-3 godziny, aby wirus mógł zainfekować komórki. 
	UWAGA: Konieczna jest inkubacja trwająca od 2 do 3 godzin, aby zapewnić, że wirusy w inokulum mają wystarczająco dużo czasu, aby dotrzeć do monowarstwy.</li>
	<li>Przygotować nakładkę (10 ml/płytkę) 
	UWAGA: Nakładka składa się z 5 ml 2x DMEM, trypsyny (2 μg/ml stężenie końcowe), 20 μl bulionu 1 mg/ml i 5 ml lintersów bawełnianych z celulozy (patrz Lista Materiałów).</li>
	<li>Usunąć inokulum.</li>
	<li>Dodaj nakładkę (200 μl do każdego dołka). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, BEZ ZAKŁÓCEŃ. 
	UWAGA: Pączkowanie wirusa następuje po około 4 godzinach, dlatego ważne jest, aby po tym czasie nie naruszyć płytki.</li>
	<li>Zassać nakładkę ze studzienek.</li>
	<li>Dodaj lodowaty 4% paraformaldehyd do PBS A (200 μl/dołek). Umieść je w temperaturze 4 °C na 30 minut lub w temperaturze pokojowej na 20 minut. 
	UWAGA: PBS A to sól fizjologiczna buforowana fosforanami o naturalnym pH z 10 g NaCl, 0,25 g KCl, 1,437 g Na2HPO4, 0,25 g KH2PO4 i 1 l wody destylowanej (patrz Lista materiałów). 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest szkodliwy w przypadku wdychania i może spowodować oparzenia w przypadku połknięcia. Istnieją również ograniczone dowody na działanie rakotwórcze i może powodować uczulenie po kontakcie ze skórą.</li>
	<li>Odessać paraformaldehyd i dwukrotnie przemyć płytki PBS A (200 μl/dołek).</li>
	<li>Przechowywać płytki w PBS A w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości lub kontynuować następujące czynności.</li>
	<li>Dodać bufor permeabilizacyjny (100 μl/basenik). Pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
	<li>Umyć płytkę dwukrotnie PBS A (200 μl/basenik).</li>
	<li>Dodać 50 μl pierwszego przeciwciała, mysiego MAb przeciwko grypie typu A (1:1000 w buforze ELISA), na basenie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (lub 4 °C przez noc), wstrząsając.</li>
	<li>Przemyj go 3 razy w 100 μl buforu do płukania (0,05% Tween 80 w PBS A, v/v) na studzienkę. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut między praniami. Alternatywnie umyj go 3 razy bez inkubacji, używając 300 μl na studzienkę.</li>
	<li>Dodać 50 μl drugiego przeciwciała, koniugatu koziego anty-mysiego IgG (H + L) HRP (1:1,000 w buforze ELISA) na studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, wstrząsając.</li>
	<li>Umyj go 3 razy, jak opisano w kroku 1.17.</li>
	<li>Dodać substrat (50 μl/studzienkę). Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub do momentu, gdy wyraźnie widoczny będzie rozwój niebieskiego koloru.</li>
	<li>Aby zatrzymać reakcję, umyć płytkę dwukrotnie 200 μl wody destylowanej na studzienkę, inkubując w temperaturze pokojowej przez 2 -3 minuty między płukaniami.</li>
	<li>Wysuszyć płytkę na powietrzu i przechowywać ją w ciemnym miejscu (np. zawinąć w folię aluminiową).</li>
</ol>
2. Miareczkowanie
<ol>
	<li>Umieść płytkę studzienkową w obszarze skanowania skanera płaskiego, jak pokazano na rysunku 2a. Użyj limitu pozycji w kształcie litery L, aby zapewnić optymalną i powtarzalną lokalizację obrazowania. 
	UWAGA: Możliwe jest zobrazowanie dwóch płytek dołkowych podczas jednego skanowania.</li>
	<li>Zeskanuj obraz. 
	UWAGA: Ustawienia są pokazane w Tabeli 2.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie "Wellplate Reader", aby obliczyć wymagane stężenie wirusa (Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk "Załaduj obraz", aby załadować obraz. Przesuń czerwony pasek na histogramie zakładki "Próg globalny", aby dostosować próg próbkowania. Kliknij przycisk "Aktualizuj", aby sprawdzić wpływ na obraz.</li>
		<li>Zaznacz pole "Oblicz neutralizację/miareczkowanie". Kliknij przycisk "Pobieranie próbek", aby określić ilościowo ICP. Kliknij przycisk "Zapisz", aby zapisać wyniki próbkowania, gdy zostaniesz o to poproszony. 
		UWAGA: Po zakończeniu procesu pobierania próbek, jeśli zaznaczone jest pole "Oblicz neutralizację/miareczkowanie", automatycznie pojawia się nowe okno o nazwie "Obliczanie neutralizacji i miareczkowania".</li>
		<li>Załaduj lub wprowadź mapę definicji płyty studzienki. Wskaż próg (np. 30%) w polu "Miareczkowanie: optymalna populacja wirusa (%)". Wybierz zakładkę "Proces miareczkowania", aby obliczyć wyniki miareczkowania. Sprawdź wyniki miareczkowania. Kliknij przycisk "Zapisz i zamknij", aby zapisać wyniki miareczkowania. 
		UWAGA: Zapoznaj się z Uzupełnieniem S1, aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące oprogramowania. Kopia oprogramowania na zamówienie jest dostępna na życzenie. 
		UWAGA: Zazwyczaj najlepsze rozcieńczenie wirusa do testu redukcji blaszek miażdżycowych daje około 50% (20-85%) ICP wszystkich komórek w każdym dołku11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Neutralizacja wirusa
UWAGA: Oblicz liczbę płytek wymaganych do przeprowadzenia testu neutralizacji. Każda płytka może pomieścić jednego wirusa i kilka surowic odpornościowych.
UWAGA: W zależności od liczby surowic odpornościowych i liczby duplikatów, można ustawić płytkę studzienkową o następujących elastycznościach: (1) Rozcieńczenie surowicy może być ułożone wzdłuż rzędu lub kolumny (Rysunek 4). Każda surowica powinna zajmować osobny wiersz lub kolumnę. (2) Przyrost rozcieńczenia surowicy jest elastyczny, ale powinien zaczynać się od najwyższego stężenia surowicy w lewym górnym rogu płytki. (3) Liczba duplikatów równoważy liczbę surowic odpornościowych. Więcej duplikatów może pomóc w wygładzeniu eksperymentalnych wariantów. (4) Liczba VC i liczba duplikatów kontrolnych komórek (CC) są elastyczne, ale powinny być również umieszczone w oddzielnych wierszach lub kolumnach. Oczekuje się, że liczba duplikatów VC jest znacznie większa niż w przypadku surowic odpornościowych.
<ol>
	<li>Przygotuj monowarstwę komórki, jak w krokach 1.1-1.3, 2 lub 3 dni wcześniej.</li>
	<li>Dodaj 50 μl VGM do każdego dołka płytki.</li>
	<li>Użyj kolumn 11 i 12 odpowiednio dla VC i CC. Dodać 50 μl podwielokrotności surowicy traktowanej enzymem niszczącym receptory (RDE) w stosunku 1:20 do pierwszego rzędu (A) kolumn 1-10, 
	UWAGA: Dla każdej kombinacji wirusa i surowicy test przeprowadza się dwukrotnie, więc jedna płytka może, na przykład, zawierać jednego wirusa testowanego przeciwko pięciu surowicom odpornościowym.</li>
	<li>Przeprowadzić 2-krotne rozcieńczenia seryjne, przenosząc 50 μl z rzędu A do rzędu H (kolumny 1-10 na rysunku 4) i odrzucając 50 μl z rzędu H.</li>
	<li>Dodać 50 μl rozcieńczalnika do każdego dołka kolumny CC (kolumna 12 na rysunku 4).</li>
	<li>Dodać 50 μl wirusa do każdego dołka płytki, z wyjątkiem kolumny CC (kolumny 1-11, wiersze A-H na rysunku 4).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny. Usunąć inokulum. Dodaj nakładkę (200 μl) do każdego dołka. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, W STANIE NIEZAKŁÓCONYM. Zamocuj i wybarwić płytki jak w przypadku miareczkowania wirusa (kroki 1.11-1.22).</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja neutralizacji
<ol>
	<li>Umieść płytkę studzienkową w obszarze skanowania skanera płaskiego, jak pokazano na rysunku 2a. Użyj limitu pozycji w kształcie litery L, aby zapewnić optymalną i powtarzalną lokalizację obrazowania. 
	UWAGA: Możliwe jest zobrazowanie dwóch płytek dołkowych podczas jednego skanowania.</li>
	<li>Zeskanuj płytkę zgodnie z opisem w kroku 2.2.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie "Wellplate Reader", aby obliczyć wymagane miana wirusa (Rysunek 3, krok 2.3).
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk "Załaduj obraz", aby załadować obraz. Przesuń czerwony pasek w polu "Próg globalny", aby dostosować próg próbkowania. Kliknij przycisk "Aktualizuj", aby sprawdzić efekt.</li>
		<li>Zaznacz pole "Oblicz neutralizację/miareczkowanie". Kliknij przycisk "Pobieranie próbek", aby określić ilościowo ICP. Kliknij przycisk "Zapisz", aby zapisać wyniki próbkowania, gdy zostaniesz o to poproszony. 
		UWAGA: Po zakończeniu procesu pobierania próbek, jeśli zaznaczone jest pole "Oblicz neutralizację/miareczkowanie", automatycznie pojawia się nowe okno o nazwie "Obliczanie neutralizacji i miareczkowania".</li>
		<li>Załaduj lub wprowadź mapę płyty wiertniczej. Wskaż próg (np. 50%) w polu "Neutralizacja: Odliczenie infekcji (%)".</li>
		<li>Wybierz "Proces neutralizacji", aby obliczyć miana. Sprawdź miana i kliknij przycisk "Zapisz i zamknij", aby zapisać wyniki neutralizacji. 
		UWAGA: Neutralizację podaje się jako odwrotność największego rozcieńczenia surowicy z predefiniowaną redukcją ICP (taką jak 50% lub 80%) w stosunku do VC (średnia z kolumny 11 na rysunku 4). W reprezentatywnych wynikach zastosowano 50% redukcję ICP.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li>
<li>Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+residues+of+recent+human+A%28H3N2%29+influenza+viruses+that+contribute+to+the+inability+to+agglutinate+chicken+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.</a> Virology. 289, 74-85 (2001).</li>
<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A%28H3N2%29+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site%3A+a+role+in+virus+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment.</a> J Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li>
<li>Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+response+in+humans+to+influenza+virus+type+B+host-cell-derived+variants+after+vaccination+with+standard+%28egg-derived%29+vaccine+or+natural+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection.</a> J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).</li>
<li>Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+antibody+to+avian+influenza+A+%28H5N1%29+virus+in+human+serum+by+using+a+combination+of+serologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol.37%22%5BJournal%5D)">Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays.</a> J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).</li>
<li>Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+focus+reduction+neutralization+test+of+influenza+A+and+B+viruses+in+microtiter+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system.</a> J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).</li>
<li>Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus%3A+a+novel+method+to+assess+viral+and+neutralizing+antibody+titers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro.</a> J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol J. 3, 63-70 (2006).</li>
<li>Comley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+-+Emerging+importance+of+novel+reagents%2Fprobes+and+pathway+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+World+Summer+2005%22%5BJournal%5D)">High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis.</a> Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+alpha-2%2C+6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li>
<li>Sullivan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+virus+plaque+quantitation+using+a+flatbed+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner.</a> J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).</li>
<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu opisaliśmy test MN oparty na obrazowaniu w celu ilościowego określenia prawdziwych relacji antygenowych między wirusami. W porównaniu z innymi testami redukcji blaszki miażdżycowej, metoda ta kładzie nacisk na pomiar ICP całej studni, zapewniając pełne pokrycie populacji zakaźnej. Jego niezależność od tworzenia blaszek miażdżycowych rozszerza również zastosowanie testu do wirusów, które mogą tworzyć głównie niewidoczne małe blaszki lub które mogą zarządzać infekcją tylko jednokomórkową. W związku z tym test jest w stanie zbadać więcej wirusów i działanie szerszego zakresu przeciwciał niż HI, a także pomaga bardziej kompleksowo odzwierciedlić podobieństwa lub różnice antygenowe między wirusami12. Na przykład, gdy włączy się karboksylan oseltamiwiru, test MN jest mniej podatny na wiązanie zależne od NA, co dokładniej odzwierciedla różnice antygenowe. Podczas opracowywania testu włożono wiele wysiłku w zwiększenie spójności, szybkości i czułości eksperymentu, w tym poprzez kontrolowanie wirusów wejściowych za pomocą miareczkowania ilościowego, obrazowanie z wysoką przepustowością za pomocą skanera płaskiego oraz wdrożenie przyjaznej dla użytkownika platformy przetwarzania danych. Wyniki były na ogół zgodne z wynikami HI i je potwierdziły. Warto zauważyć, że wyniki ujawniły również różnice antygenowe między wariantami dryfu antygenowego niedawnych wirusów szczepionkowych typu A i B, a także zmiany antygenowe spowodowane selekcją kultur lub sporadycznymi zmianami, takimi jak substytucja G155E w HA1 niektórych wirusów A(H1N1)pdm0912.
Protokół dopasował typ lub podtyp wirusa do wyboru linii komórkowych, które dały najsilniejszą infekcję, co znacznie wzmocniło sygnał obrazowania. Zmienność eksperymentalna została wygładzona dzięki zaprojektowaniu duplikatów, które równoważyły się z liczbą badanych surowic odpornościowych. Niepewności mogą również wynikać z jakości obrazu, na którą wpływ ma głównie urządzenie do obrazowania. Porządny kolorowy skaner płaski może znacznie poprawić kontrast obrazu i zredukować szumy. Ilość wirusa wejściowego do neutralizacji musi być ilościowo określona z wyprzedzeniem na podstawie odpowiedniego miareczkowania, podczas gdy wirusy nadal utrzymują podobny status. Podczas neutralizacji odpowiedź surowicy odpornościowej na zakażenie jest normalizowana w stosunku do różnicy między wirusem referencyjnym (VC) a poziomem tła (CC). Dokładne pomiary VC i CC są niezbędne w eksperymencie neutralizacji. Zaleca się stosowanie większej liczby duplikatów (w reprezentatywnych wynikach wykorzystano osiem duplikatów). Wreszcie, zrozumienie oprogramowania ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Oprogramowanie było testowane pod kątem rutynowej charakterystyki wirusa w Centrum Grypy WHO w Wielkiej Brytanii przez ponad dwa lata. Szczegółowe instrukcje dotyczące postępowania w różnych sytuacjach znajdują się w Dodatku S1.
Ten test MN nadaje się do zastosowań, w których próbki obejmują bardzo duże pole widzenia, ale wymagają jedynie umiarkowanej rozdzielczości obrazowania. Niski koszt i prosta konfiguracja sprawiają, że system jest łatwo dostępny dla większości laboratoriów wirusologicznych. Różnica w pomiarach tej samej próbki była mniejsza niż 3%, co z grubsza określa niepewność wprowadzoną podczas skanowania11. Taka powtarzalność jest wystarczająca w wielu badaniach wirusologicznych i może być dodatkowo zmniejszona poprzez uśrednianie obrazów z wielu skanów.
Podsumowując, badanie to demonstruje solidny test MN, który może być rutynowo stosowany w badaniach antygenowych i jako wsparcie danych HI w szczegółowych analizach obecnie krążących wirusów grypy, w szczególności w przypadku dwuletniej selekcji wirusów do włączenia do szczepionek przeciwko grypie ludzkiej.

Testy mikroneutralizacji (MN) są używane w wirusologii do ilościowego oznaczania przeciwciał neutralizujących i aktywności przeciwwirusowej. Jako alternatywa dla testów hamowania hemaglutynacji (HI), testy MN mogą przezwyciężyć efekty nieantygenowe, na które wpływają zmiany powinowactwa wiązania receptorów w wirusach grypy, co może komplikować interpretację wyników HI1,2,3. Do niedawna większość testów MN opierała się na efektach cytopatycznych (CPE) lub testach immunoenzymatycznych (ELISA)4,5. W 1990 r. opracowano testy MN oparte na koncentracji i redukcji blaszki miażdżycowej6,7,8. Testy redukcji płytki nazębnej polegają na zliczaniu widocznych blaszek w celu ilościowego określenia zakaźności. Jednak zliczenia wizualne obejmują tylko duże blaszki, które są rozpoznawane przez ludzkie oczy, mimo że większość blaszek jest mała i niewidoczna dla wielu obecnie krążących wirusów. To niepełne pokrycie może powodować znaczne różnice między egzaminatorami i między eksperymentami, prowadząc do nieporównywalnych wyników. Niemożliwe jest również zastosowanie tej metody, gdy niektóre wirusy wykazują nieudaną infekcję pojedynczych komórek lub bardzo małe blaszki.
Słaba rozdzielczość zliczania może być poprawiona przez wprowadzenie protokołu opartego na obrazowaniu. Dzięki postępowi technologicznemu, mikroskopia optyczna i wysokowydajne czytniki płytek studziennych mogą zapewnić dokładne metody liczenia zainfekowanych komórek9. Pod mikroskopem z prześwietlanym światłem zakażone komórki oznaczone pewnymi markerami mogą być wizualizowane przez ich absorpcję lub kontrast fluorescencyjny w rozdzielczości subkomórkowej. Próbka może być następnie analizowana na ekranie komputera.
Niestety, ze względu na ograniczenie pola widzenia, do pokrycia jednej studni potrzeba więcej niż stu obrazów wyłożonych kafelkami. Analiza płytki z 96 dołkami wymagałaby zobrazowania i przetworzenia około dziesięciu tysięcy obrazów. Tak pracochłonny proces jest czasochłonny i kosztowny, a uzyskana rozdzielczość jest na ogół zbędna do rutynowej charakterystyki infekcji wirusowych. Laboratoria dysponujące ograniczonym budżetem mogą uznać, że podejście oparte na skanerze płaskim stanowi opłacalną alternatywę o wysokiej przepustowości.
W tym artykule opisujemy ulepszony test MN do redukcji płytki nazębnej, który jest odpowiedni do charakterystyki antygenowej dużej liczby wirusów oraz do ilościowego pomiaru aktywności przeciwwirusowej i przeciwciał neutralizujących. Test ma kilka zalet: po pierwsze, jest to test oparty na obrazowaniu, który jest w stanie zmierzyć infekcje wirusowe na poziomie komórkowym, niezależnie od wielkości płytki nazębnej. Zliczenie całkowitej populacji zakażonych komórek (ICP) w studzience znacznie zwiększa czułość wykrywania, umożliwiając scharakteryzowanie wirusów o niskiej zakaźności. Po drugie, przed neutralizacją wprowadza się dokładniejsze miareczkowanie ilościowe w celu określenia ilości wirusa wejściowego. Ilościowy wirus wejściowy znacznie zmniejsza różnice między różnymi eksperymentami i sprawia, że wyniki są bardziej porównywalne między laboratoriami. Po trzecie, miana neutralizacji można określić bezpośrednio poprzez analizę obrazów, dzięki czemu kwantyfikacja jest szybka i przyjazna dla użytkownika. Wreszcie, protokół zapewnia opłacalną i wysokowydajną alternatywę o wymaganej rozdzielczości i dokładności. Kwantyfikacja opiera się na skanerze płaskim i bezpłatnym oprogramowaniu do przetwarzania danych. Cała konfiguracja zajmuje niewiele miejsca i można ją wdrożyć w większości laboratoriów.
Protokół przedstawiony w tym artykule składa się z czterech głównych etapów, w tym miareczkowania wirusa, miareczkowania, neutralizacji wirusa i kwantyfikacji neutralizacji. Miareczkowanie wirusów to eksperyment przygotowawczy, który określa ilość wirusów wejściowych, które mają być użyte do neutralizacji. Podczas miareczkowania do monowarstw komórek w 96-dołkowej płytce nakłada się szereg stężeń wirusa. Zainfekowane komórki są następnie oznaczane ilościowo w sekcji 2. Rozcieńczenie wirusa, które wytwarza 20%-85% ICP, jest z kolei stosowane jako wirusy wejściowe do odpowiedniej neutralizacji w sekcji 3. Miana w protokole neutralizacji określa się ilościowo za pomocą sekcji 4. Eksperymenty, które przeprowadzono zgodnie z powyższymi protokołami, przedstawiono w Reprezentatywnych Wynikach. Test został dokładnie przetestowany w ciągu ostatnich dwóch lat z większością obecnie krążących wirusów grypy, takich jak wirusy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B. Wyniki charakterystyki wirusa grypy zostały zawarte w raportach na spotkanie konsultacyjne WHO, w których wydano zalecenia dotyczące szczepionek przeciw grypie do stosowania na półkuli południowej w 2016 r. i na półkuli północnej w latach 2016-2017.

<table><tbody><tr><td>VGM</td><td>Sigma</td><td>D6429, P0781</td><td>500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td></tr><tr><td>PBS Nature</td><td></td><td></td><td>pH Sól fizjologiczna buforowana fosforanami: NaCl 10&nbsp; g, KCl 0,25&nbsp; g, Na2HPO4 1,437 g, KH2PO4 0,25 g i Dist. Woda 1 L.</td></tr><tr><td>Avicell</td><td>FMC</td><td>RC-581F</td><td>2,4 g w 100 ml wody destylowanej rozpuszczonej przez mieszanie na mieszadle magnetycznym przez 1 godzinę. Sterylizować w autoklawie.</td></tr><tr><td>2x DMEM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21935-028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Nakładka (10 ml/płytka):</td><td></td><td></td><td>5 ml 2x DMEM, Trypsyna 2&nbsp; &mu; g/ml stężenie końcowe, Avicell 5&nbsp; ml</td></tr><tr><td>Triton X- 100e</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T8787</td><td>Bufor permeabilizacyjny: 0,2% w PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P5188</td><td>Bufor do płukania: 0,05% Tween 80 w PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>PAA Labs Ltd</td><td>B15-021</td><td>Bufor ELISA: 10% w PBS A (v/v) + 0,1% Tween 80</td></tr><tr><td>Mysz MAb przeciwko grypie typu A</td><td>Biorad</td><td>MCA 400</td><td>1st Przeciwciało: 1:1,000 w ELISA Bufor</td></tr><tr><td>Koza anty-mysia IgG (H+L) HRP koniugat</td><td>Biorad</td><td>172-1011</td><td>2nd Przeciwciało: 1:1,000 w buforze ELISA</td></tr><tr><td>Prawdziwy substrat peroksydazy Blu</td><td>KPL&nbsp;</td><td>50-78-02</td><td>Podłoże: True Blue +0,03% H2O2g (1:1,000 z 30% roztworu)</td></tr><tr><td>96-dołkowe płaskie płytki do mikromiareczkowania</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>8-kanałowa podkładka i rozdzielacz wielościenna</td><td>Sigma</td><td>M2656</td><td></td></tr><tr><td>Skaner płyt doskonałości</td><td>Epson</td><td>V750 Pro</td><td>Oprogramowanie do obrazowania można pobrać bezpłatnie ze strony <a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp; infoType=Pliki do pobrania">http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp; infoType=Pliki do pobrania</a>.</td></tr><tr><td>Środowisko operacyjne oprogramowania: LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td>Corporation Window oparte na konstruktorze NI Vision</td><td>Wersja: LabVIEW2012 lub nowsza</td></tr></tbody></table>

optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Test mikroneutralizacji (MN) jest standardową techniką pomiaru zakaźności wirusa grypy i hamowania replikacji wirusa. W tym badaniu przedstawiamy protokół testu MN opartego na obrazowaniu w celu ilościowego określenia prawdziwych relacji antygenowych między wirusami. W przeciwieństwie do typowych testów redukcji blaszek miażdżycowych, które opierają się na widocznych blaszkach, ten test określa ilościowo całą populację zakażonych komórek w każdym dołku. Protokół dopasowuje typ lub podtyp wirusa do wyboru linii komórkowych w celu osiągnięcia maksymalnej zakaźności, co zwiększa kontrast próbki podczas obrazowania i przetwarzania obrazu. Wprowadzenie miareczkowania ilościowego określa ilość wirusów wejściowych do neutralizacji i umożliwia porównywanie wyników różnych eksperymentów. Konfiguracja obrazowania z płaskim skanerem i bezpłatnym oprogramowaniem do pobrania sprawia, że podejście to jest wydajne, opłacalne, przyjazne dla użytkownika i łatwe do wdrożenia w większości laboratoriów. Nasze badanie pokazuje, że ulepszony test MN działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B, bez znaczącego wpływu podstawień aminokwasów w neuraminidazie (NA) wirusów A(H3N2). Jest to szczególnie przydatne do charakteryzowania wirusów, które albo rosną do niskiego miana kwasu hialuronowego, albo przechodzą nieudaną infekcję powodującą niezdolność do tworzenia blaszek w hodowanych komórkach.

Zgodnie z powyższymi procedurami przedstawiamy wyniki z ostatnich eksperymentów dotyczących charakterystyki antygenowej. Układ miareczkowania został zaprojektowany w celu zbadania ośmiu wirusów wejściowych, z podwójnymi powtórzeniami dla każdego rozcieńczenia. Rozcieńczenia wirusów testowano w zakresie od 1.0 x 10-1 do 1.0 x 1.0-6, aby objąć różnice między wirusami. Badane wirusy należały do podtypu H3N2 i obejmowały: A/Cameroon/15V-3538/2015, A/Vladivostok/36/2015, A/Moscow/103/2015, A/Tomsk/5/2015/, A/Moscow/101/2015, A/Moscow/100/2015, A/Moscow/133/2015 oraz A/Bratislava/437/2015. Wyniki miareczkowania przedstawiono na Rysunku 5. Rysunek 5d obrazuje spadek ICP wraz ze wzrostem rozcieńczenia wirusa. Krzywe znormalizowano względem ICP tych samych wirusów, które wywołały infekcje we wszystkich komórkach w studni12 (zdefiniowano jako saturację ICP). Jeśli przy najwyższym stężeniu wirusa nie osiągnięto saturacji ICP, zamiast tego wykorzystano średnią ICP z odpowiadających im powtórzeń (A/Moscow/103/2015 na Rysunku 5d). Rozcieńczenia wirusów, które spowodowały 30% saturacji ICP, wybrano jako rozcieńczenie wirusa wejściowego do neutralizacji (Tabela 3).
Neutralizacja została zaplanowana tak, aby jeden wariant wirusa wejściowego był testowany przeciwko pięciu antyserom, z podwójnymi powtórzeniami na każdej płytce. Przedstawionym wirusem referencyjnym jest H3N2 A/Stockholm/63/2015. Pięć antyser to A/HK 4801/14 Egg F12/15, A/HK 7295/14 MDCK F02/15, A/South Africa R2665/15 SIAT F50/15, A/Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18/15 oraz A/Dutch 525/14 SIAT f23/15. Wyniki neutralizacji zilustrowano na Rysunku 6. Rysunek 6d przedstawia postęp infekcji wraz ze wzrostem rozcieńczenia surowicy. Znormalizowana populacja pozytywna na osi pionowej reprezentuje stosunek ICP z odpowiedzi odpowiedniego antiserum do średniego ICP wirusa referencyjnego12. Podczas normalizacji odjęto ICP w tle z kontrolnych komórek niezakażonych. Miana neutralizacji określono jako odwrotności rozcieńczeń antiserum odpowiadające 50% redukcji ICP (Tabela 4). Do oszacowania mian przypadających pomiędzy dwoma sąsiednimi rozcieńczeniami surowicy zastosowano interpolację liniową.
<img alt="Mikropłytkowy test rozcieńczeń wirusa, rozcieńczenia seryjne, ilościowe oznaczanie wirusa, wyświetlone wyniki eksperymentu." src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przykład układu płytek w eksperymencie miareczkowania wirusa. Badane wirusy są przypisane do oddzielnych rzędów (od A do H). Kolumny są przeznaczone dla różnych rozcieńczeń wirusa (od 1 do 12). Dwie kolumny zostały wykorzystane jako powtórzenia dla każdego rozcieńczenia wirusa. Pasek skali = 10 mm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Ustawienie płytki 96-dołkowej na skanerze; schemat ogranicznika w kształcie litery L; wymiary zaznaczone dla procesu skanowania." src="/files/ftp_upload/54897/54897fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schematy systemu skanowania próbek. (a) Płytka 96-dołkowa w pozycji obrazowania skanera płaskiego (ponownie opublikowano z referencji11 za zgodą Elsevier B.V.) oraz (b) wymiary ogranicznika pozycji w kształcie litery L pokazanego na (a). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Interfejs oprogramowania do analizy elektroforezy żelowej; identyfikacja prążków DNA; ustawienia progu; analiza danych." src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schemat ekranu oprogramowania do kwantyfikacji „Wellplate Reader”. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Płytka ELISA przedstawiająca rozcieńczenie surowicy w eksperymencie immunoanalizy do analizy wykrywania przeciwciał." src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przykład ustawienia płytki do testów w eksperymencie neutralizacji. Każdemu antyserum przypisano dwie kolumny z powtórzeniami (1 do 10). Wiersze są przeznaczone dla różnych rozcieńczeń surowicy (A do H). Kontrola wirusa znajduje się w kolumnie 11, z ośmioma powtórzeniami (A11 do H11). Kontrola komórek znajduje się w kolumnie 12, z ośmioma powtórzeniami (A12 do H12). Pasek skali = 10 mm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ustawienie płytki do miareczkowania, rozcieńczenie wirusa w płytce do mikrotitracji, wykres wyników miareczkowania; test kolorymetryczny." src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wyniki eksperymentu miareczkowania. (a) Ustawienie płytki do mikrotitracji, (b) obraz zeskanowanej płytki, (c) ilustracja zakodowanej kolorystycznie, skwantyfikowanej populacji komórek zainfekowanych wirusem oraz (d) znormalizowane populacje komórek zainfekowanych wirusem w zależności od rozcieńczeń wirusa. Jako próg przyjęto 30% ICP. Słupki błędu na (d) przedstawiają odchylenia standardowe (SD) z powtórzeń próbek (± 1 SD). Paski skali na (b) i (c) = 10 mm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ testu neutralizacji, obrazy płytek i wykres przedstawiający wpływ rozcieńczenia surowicy na miano wirusa." src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Wyniki eksperymentu neutralizacji. (a) Układ płytki wielodołkowej, (b) obraz zeskanowanej płytki wielodołkowej, (c) ilustracja skwantyfikowanej populacji komórek zainfekowanych wirusem oraz (d) znormalizowana populacja komórek zainfekowanych wirusem w funkcji rozcieńczenia surowicy. Jako wirus wejściowy (VC) zastosowano szczep A/Stockholm/63/2015. Do obliczenia mian wykorzystano 50% ICP. Słupki błędów na wykresie (d) przedstawiają odchylenia standardowe (SD) z powtórzeń próbek (± 1 SD). Paski skali na (b) i (c) = 10 mm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Uzupełnienie S1: <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Typowe rozcieńczenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>komórki MDCK</td>
			<td>komórki MDCK-SIAT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 dni</td>
			<td>1:5 (1 + 4)</td>
			<td>1:10 (1 + 9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 dni</td>
			<td>1:10 (1 + 9)</td>
			<td>1:20 (1 + 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Typowa liczba komórek na ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>komórki MDCK</td>
			<td>komórki MDCK-SIAT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 dni</td>
			<td>2 x 105</td>
			<td>1 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 dni</td>
			<td>1 x 105</td>
			<td>5 x 104</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Typowe rozcieńczenia przy subkulturze konfluentnych kolb komórek MDCK lub MDCK-SIAT1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryb</td>
			<td>Tryb profesjonalny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typ dokumentu</td>
			<td>Film (z przewodnikiem po obszarze filmu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typ automatycznej ekspozycji</td>
			<td>Zdjęcie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typ obrazu</td>
			<td>kolor 24-bitowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdzielczość</td>
			<td>1200 dpi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Format zapisanego obrazu</td>
			<td>TIFF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Typowa konfiguracja skanera płaskiego.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Rząd</td>
			<td >Wirus</td>
			<td >Zalecane rozcieńczenie</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >A</td>
			<td >A/Cameron/15V-3538/2016</td>
			<td >1.0 x 10-2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >B</td>
			<td >A/Vladivostok/36/2015</td>
			<td >1.0 x 10-3</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >C</td>
			<td >A/Moscow/103/2015</td>
			<td >1.1 x 10-1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >D</td>
			<td >A/Tomsk/5/2015</td>
			<td >5.9 x 10-1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >E</td>
			<td >A/Moscow/101/2015</td>
			<td >8.3 x 10-1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >F</td>
			<td >A/Moscow/100/2015</td>
			<td >1.4 x 10-2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >G</td>
			<td >A/Moscow/133/2015</td>
			<td >1.3 x 10-2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >H</td>
			<td >A/Bratislava/437/2015</td>
			<td >1.3 x 10-4</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3: Rozcieńczenia wirusa obliczone dla populacji z 30% ICP.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kolumna</td>
			<td>Antysera</td>
			<td>Zalecane miano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 - 2</td>
			<td>A/HK4801/2014</td>
			<td>110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 - 4</td>
			<td>A/HK7295/2014</td>
			<td>213.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 - 6</td>
			<td>A/South Africa/R2665/2015</td>
			<td>2155.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 - 8</td>
			<td>A/Szwajcaria/9715293/2013</td>
			<td>89.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 - 10</td>
			<td>A/Netherlands/525/2014</td>
			<td>78.6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Miana przy 50% ICP A/Stockholm/63/2015 przeciwko antyserom.

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Ogólnym celem niniejszego testu mikroneutralizacji jest ilościowa, wysokoprzepustowa i wysokoczuła charakterystyka wszystkich typów obecnie krążących wirusów grypy oraz aktywności przeciwciał i środków przeciwwirusowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii, takie jak charakterystyka antygenowa wirusów grypy, ilościowa neutralizacja przeciwciał oraz aktywności przeciwwirusowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że charakteryzuje ona całą populację zainfekowanych komórek, w tym widoczne i niewidoczne płytki oraz infekcje pojedynczych komórek.Test mikro-neutralizacji zostanie zaprezentowany przez dr. Yipu Lin, zastępcę dyrektora WHO Collaborating Center for Influenza w Londynie. Poziom bezpieczeństwa biologicznego, czyli BSL, dla poniższego protokołu to BSL 2 dla sezonowych wirusów grypy oraz BSL 3+ dla potencjalnych pandemicznych wirusów grypy. Na początek należy nanieść odpowiednią ilość komórek do płytek 96-dołkowych.Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dwa do trzech dni, aż osiągną konfluencję. Za pomocą 70% etanolu wysterylizować myjkę do płytek wielodołkowych, a następnie przepłukać ją PBS lub VGM. Następnie użyć 200 µL pożywki do wzrostu wirusa (VGM), aby przemyć konfluentne komórki.Odssać VGM z komórek i natychmiast dodać 50 µL VGM do każdej studni. Następnie dodać 900 µL VGM do każdej z sześciu sterylnych probówek. Potem pipetować 100 µL wirusa do pierwszej probówki i dokładnie wymieszać.Przygotować rozcieńczenia seryjne wirusa, zaczynając od pierwszej probówki, wymieniając końcówki między każdym rozcieńczeniem. Dodać 50 µL każdego rozcieńczenia wirusa, zaczynając od najwyższego rozcieńczenia, do dubletów studzienek płytki 96-dołkowej. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez dwie do trzech godzin, aby umożliwić zainfekowanie komórek przez wirusa.Po przygotowaniu warstwy nakładki zgodnie z protokołem tekstowym, usuń inokulum z dołków. Następnie dodaj 200 µL nakładki do każdego dołka i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc, nieporuszając płytką. Do dołków dodaj 200 µL lodowatego 4% PFA w PBS A i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 30 minut lub w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Po inkubacji odessać PFA i dwukrotnie przemyć płytkę, używając 200 µL PBS A na dołek. Do płytki dodać 100 µL buforu do permeabilizacji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie płytkę dwukrotnie przemyć PBS A.Następnie do każdej studni dodaj 50 µL mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko wirusowi grypy typu A i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę przy wytrząsaniu. Po inkubacji przemyj studnię trzykrotnie, używając 300 µL buforu do mycia. Następnie do próbek dodaj 50 µL koziego przeciwciała wtórnego sprzężonego z HRP i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Po trzykrotnym przemyciu dołków w sposób opisany wcześniej, należy dodać 50 µL substratu do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub do momentu wyraźnego pojawienia się niebieskiego zabarwienia. Aby zatrzymać reakcję, należy dwukrotnie przemyć dołki, używając 200 µL wody destylowanej. Następnie, po wysuszeniu płytki na powietrzu, należy przechowywać ją w ciemnym miejscu.Umieść płytkę wielodołkową w obszarze skanowania skanera płaskiego, wykorzystując ogranicznik pozycji w kształcie litery L, aby zapewnić optymalne i powtarzalne rozmieszczenie do obrazowania. Zeskanuj płytkę, korzystając z ustawień pokazanych tutaj. Następnie uruchom oprogramowanie czytnika płytek wielodołkowych, aby obliczyć wymaganą stężenie wirusa, klikając przycisk Load Image w celu załadowania obrazu.Następnie, w karcie global threshold, przesuń czerwony pasek na histogramie, aby dostosować próg próbkowania. Następnie kliknij przycisk update, aby sprawdzić efekt na obrazie. Teraz zaznacz pole Calculate Neutralization/Titration.Kliknij przycisk Sampling, aby określić liczebność populacji zakażonych komórek (ICP). Następnie, gdy pojawi się odpowiedni komunikat, kliknij przycisk Save, aby zapisać wyniki próbkowania. Aby uzyskać wyniki miareczkowania, wczytaj lub wprowadź mapę definicji płytki wielodołkowej.W sekcji Titration:Optimal Virus Population wskaż wartość progową. Wybierz zakładkę Titration Process, aby obliczyć wyniki miareczkowania. Następnie sprawdź wyniki miareczkowania przed kliknięciem przycisku Save and Close w celu zapisania rezultatów.Szczegółowe instrukcje dotyczące oprogramowania znajdują się w suplemencie S1. Aby przeprowadzić neutralizację wirusa, należy przygotować monowarstwę komórek dwa lub trzy dni wcześniej. Następnie do każdego dołka płytki należy dodać 50 µL VGM.Kolumny 11 i 12 należy wykorzystać odpowiednio jako kontrolę wirusa i kontrolę komórek. Do pierwszego rzędu kolumn od 1 do 10 należy dodać aliquoty po 50 µL surowicy traktowanej enzymem niszczącym receptory (RDE) w rozcieńczeniu 1:20. Należy wykonać dwukrotne rozcieńczenia seryjne, przenosząc 50 µL z rzędu A do rzędu H, a następnie odrzucając 50 µL z rzędu H. Następnie do każdego dołka w kolumnie kontroli komórek należy dodać 50 µL rozcieńczalnika.Do każdej studni płytki, z wyjątkiem kolumny kontroli komórkowej, dodać 50 µL wirusa. Płytkę inkubować w temperaturze 37 °C przez dwie do trzech godzin. Następnie usunąć inokulum i do każdej studni dodać warstwę overlay.Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C bez zakłócania procesu. Następnie utrwal i zabarw płytki w sposób zademonstrowany wcześniej w tym filmie. Aby ilościowo określić neutralizację, umieść płytkę w obszarze skanowania skanera płaskiego, zgodnie z instrukcją pokazaną wcześniej w tym filmie.Zeskanuj płytkę i uruchom oprogramowanie czytnika płytek, aby obliczyć wymagane miana wirusa w sposób opisany wcześniej. Po załadowaniu lub wprowadzeniu mapy płytki, w sekcji Neutralization:Infection Deduction określ wartość progową. Następnie wybierz Neutralization Process, aby obliczyć miana.Na koniec sprawdź miana i kliknij przycisk Save and Close, aby zapisać wyniki neutralizacji. Przedstawione tutaj wyniki miareczkowania pochodzą z niedawnych eksperymentów charakterystyki antygenowej ośmiu wirusów wejściowych z rozcieńczeniami od 1,0 × 10⁻¹ do 1,0 × 10⁻⁶. Wykres obrazuje, że ICP maleją wraz ze wzrostem rozcieńczenia wirusa.Krzywe znormalizowano względem ICP tych samych wirusów, które wywołały infekcje we wszystkich komórkach w dołku. W poniższej tabeli wymieniono rozcieńczenia wirusa, które spowodowały 30% nasycenia ICP i które wybrano jako rozcieńczenie wirusa wejściowego do neutralizacji. Rysunek ten przedstawia wyniki eksperymentu z neutralizacji z użyciem jednego wirusa wejściowego przeciwko pięciu antyserom.Wykres przedstawia proces zakażenia wraz ze wzrostem rozcieńczenia surowicy. Znormalizowana populacja pozytywna na osi pionowej reprezentuje stosunek ICP z odpowiadającej odpowiedzi antyserum do średniego ICP wirusa referencyjnego. Ostatecznie miana neutralizacji określono jako odwrotności rozcieńczeń antyserum odpowiadających 50% redukcji ICP.Analiza ta koncentruje się na powtarzalności, szybkości i czułości detekcji, obejmując ilościowe miareczkowanie wirusów wejściowych, obrazowanie wysokoprzepustowe oraz przetwarzanie danych. Jest ona efektywna kosztowo, przyjazna dla użytkownika i rutynowo stosowana w badaniach nad antygenowością wirusów.

optimization-of-a-quantitative-micro-neutralization-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje testy mikroneutralizacji do pomiaru przeciwciał neutralizujących za pomocą komórek nerki Madin-Darby Canine nadekspresji kwasu sjalowego związanego z α2,6 w surowicy ludzkiej. Ten test jest często stosowany w badaniach serologicznych grypy u...

Test mikroneutralizacji do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących w surowicy ludzkiej

Ten film demonstruje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu do analizy relacji antygenowych między wirusami grypy A i B. Zapewnia ilościowy i wizualny sposób oceny skuteczności przeciwciał lub innych metod leczenia w zapobieganiu infekcji wirusowej.

Analiza związku antygenowego między wirusami przy użyciu testu mikroneutralizacji opartego na obrazie

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Protokół do określania względnej aktywności antyapoptotycznej mAb anty-TNFα przy użyciu mechanizmu neutralizacji z komórkami WEHI 164 jest przedstawiony tutaj. Protokół ten jest przydatny do porównywania siły neutralizacji różnych cząsteczek o tej samej funkcjonalności biologicznej.

Oznaczanie względnej siły działania przeciwciała monoklonalnego anty-TNF (mAb) przez neutralizację TNF przy użyciu metody bioanalitycznej in vitro

Zademonstrowano test immunologiczny oparty na naczyniach włosowatych, wykorzystujący komercyjną platformę do pomiaru docelowych białek z całkowitych preparatów białkowych. Ponadto parametry testowe czasu ekspozycji, stężenia białka i rozcieńczenia przeciwciał są zoptymalizowane pod kątem systemu modelowego hodowli komórkowych.

Procedura i kluczowe strategie optymalizacyjne dla zautomatyzowanej metody immunologicznego opartego na elektroforetycznych naczyniach włosowatych

Przeciwciała neutralizujące grypę korelują z ochroną przed infekcjami grypowymi. Testy mikroneutralizacji mierzą przeciwciała neutralizujące w surowicach ludzkich i są często stosowane w serologii grypy u ludzi. Opisujemy test mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1 do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących wobec współczesnych wirusów 3C.2a i 3C.3a A(H3N2) po szczepieniu lub zakażeniu grypą.

Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Kompleksowy protokół laboratoryjny i przepływ pracy analizy są opisane dla szybkiego, opłacalnego i prostego testu kolorymetrycznego opartego na komórkach do wykrywania elementów neutralizujących przeciwko AAV6.

Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV za pomocą kolorymetrycznego testu komórkowego

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Poznaj zoptymalizowany test mikroneutralizacji do ilościowej analizy wirusów grypy i aktywności przeciwciał. Metoda wykorzystuje skaner płaski i zapewnia wysoką czułość oraz przepustowość w badaniach wirusologicznych.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Przeglądaj więcej filmów