Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji
December 14th, 2016
To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.
Ogólnym celem tego testu mikroneutralizacji jest scharakteryzowanie wszystkich typów obecnie krążących wirusów grypy oraz aktywności przeciwciał i pomiarów przeciwwirusowych w sposób ilościowy, wysokoprzepustowy i bardzo czuły. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii, takie jak charakterystyka antygenowa wirusów grypy, ilościowa neutralizacja przeciwciał i aktywność przeciwwirusowa. Główną zaletą tej techniki jest to, że scharakteryzowała ona całą zakażoną populację komórek, w tym widoczne i niewidoczne blaszki oraz infekcje jednokomórkowe.
Test mikroneutralizacji zostanie zademonstrowany przez dr Yipu Lin, zastępcę dyrektora Centrum Współpracy WHO ds. Grypy w Londynie. Poziom bezpieczeństwa biologicznego lub BSL dla poniższego protokołu to BSL 2 dla wirusów grypy sezonowej i BSL 3+ dla potencjalnych wirusów grypy pandemicznej. Na początek podwielokrotność komórek należy podzielić na 96-dołkowe płytki.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez dwa do trzech dni, aby osiągnąć konfluencję. Używając 70% etanolu, wysterylizuj wielodołkową myjkę do płytek i użyj PBS lub VGM do jej wypłukania. Następnie użyj 200 mikrolitrów pożywki wzrostowej wirusa lub VGM, aby umyć zbiegające się komórki.
Odessać VGM z komórek i natychmiast dodać 50 mikrolitrów VGM do każdej studzienki. Następnie dodaj 900 mikrolitrów VGM do każdej z sześciu sterylnych probówek. Następnie odpipetuj 100 mikrolitrów wirusa do pierwszej probówki i dobrze wymieszaj.
Przygotować seryjne rozcieńczenia wirusa, zaczynając od pierwszej probówki, zmieniając końcówki między każdym rozcieńczeniem. Dodać 50 mikrolitrów każdego rozcieńczenia wirusa, zaczynając od najwyższego rozcieńczenia, aby zduplikować studzienki 96-dołkowej płytki. Następnie umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie do trzech godzin, aby wirus mógł zainfekować komórki.
Po przygotowaniu nakładki zgodnie z protokołem tekstowym należy wyjąć inokulum z dołków. Następnie dodaj 200 mikrolitrów nakładki do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc bez zakłóceń. Dodaj 200 mikrolitrów lodowatego 4% PFA w PBS A do studzienek i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut lub w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Po inkubacji odessać PFA i użyć 200 mikrolitrów na studzienkę PBS A do dwukrotnego umycia płytki. Dodaj 100 mikrolitrów buforu przepuszczalnego do płytki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie użyj PBS A, aby dwukrotnie umyć płytkę.
Następnie dodać 50 mikrolitrów do studzienki mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko grypie typu A do studzienek i inkubować w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez godzinę. Po inkubacji użyj 300 mikrolitrów buforu do płukania, aby trzykrotnie przemyć studzienkę. Następnie dodaj 50 mikrolitrów sprzężonego z HRP przeciwciała drugorzędowego koziego do próbek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę.
Po trzykrotnym umyciu studzienek, jak poprzednio, dodać 50 mikrolitrów substratu do studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub do momentu, gdy wyraźnie widoczny będzie rozwój niebieskiego koloru. Aby zatrzymać reakcję, użyj 200 mikrolitrów wody destylowanej do dwukrotnego umycia studzienek. Następnie, po wysuszeniu płytki na powietrzu, przechowuj ją w ciemnym miejscu.
Umieść płytkę studzienkową w obszarze skanowania skanera płaskiego, korzystając z limitu pozycji w kształcie litery L, aby zapewnić uzyskanie optymalnej i powtarzalnej lokalizacji obrazowania. Zeskanuj płytkę, korzystając z ustawień pokazanych tutaj. Następnie uruchom oprogramowanie czytnika płytek studzienkowych, aby obliczyć wymagane stężenie wirusa, klikając przycisk Załaduj obraz, aby załadować obraz.
Następnie na karcie progu globalnego przesuń czerwony pasek na histogramie, aby dostosować próg próbkowania. Następnie kliknij przycisk aktualizacji, aby sprawdzić wpływ na obraz. Teraz zaznacz pole Oblicz neutralizację/miareczkowanie.
Kliknij przycisk Pobieranie próbek, aby określić ilościowo populację zakażonych komórek lub ICP. Następnie, po wyświetleniu monitu, kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać wyniki próbkowania. Aby uzyskać wyniki miareczkowania, należy załadować lub wprowadzić mapę definicji płytki studziennej.
W miareczkowaniu: optymalna populacja wirusa wskaż próg. Wybierz kartę Miareczkowanie (Titration Process (Proces miareczkowania), aby obliczyć wyniki miareczkowania. Następnie sprawdź wyniki miareczkowania przed kliknięciem przycisku Zapisz i zamknij, aby zapisać wyniki.
Zapoznaj się z suplementem S1, aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące oprogramowania. Aby przeprowadzić neutralizację wirusa, przygotuj monowarstwę komórek dwa lub trzy dni wcześniej. Następnie dodaj 50 mikrolitrów VGM do każdego dołka płytki.
Kolumny 11 i 12 należy stosować odpowiednio do kontroli wirusa i kontroli komórek. Dodać 50-mikrolitrowe podwielokrotności surowicy w rozcieńczeniu jeden do 20 enzymu niszczącego receptory lub RDE, do pierwszego rzędu kolumn od 1 do 10. Wykonaj dwukrotne seryjne rozcieńczenia, przenosząc 50 mikrolitrów z rzędu A do rzędu H i odrzucając 50 mikrolitrów z rzędu H. Następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczalnika do każdej studzienki kolumny kontrolnej komórki.
Dodać 50 mikrolitrów wirusa do każdego dołka płytki, z wyjątkiem kolumny kontrolnej komórki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin. Następnie usuń inokulum i dodaj nakładkę do każdej studzienki.
Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez zakłóceń. Następnie napraw i poplam płytki, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Aby określić ilościowo neutralizację, umieść płytkę dołka w obszarze skanowania skanera płaskiego, jak pokazano wcześniej w tym filmie.
Zeskanuj płytkę i uruchom oprogramowanie czytnika płytek studzienkowych, aby obliczyć wymagane miano wirusa, tak jak poprzednio. Po załadowaniu lub wprowadzeniu mapy płyty studziennej, w Neutralizacja:Odliczenie infekcji wskaż próg. Następnie wybierz Proces neutralizacji, aby obliczyć miana.
Na koniec sprawdź miana i kliknij przycisk Zapisz i zamknij, aby zapisać wyniki neutralizacji. Pokazano tutaj wyniki miareczkowania z ostatnich eksperymentów charakterystyki antygenowej ośmiu wirusów wejściowych o rozcieńczeniach od 1,0 razy 10 do ujemnego i 1,0 razy 10 do ujemnych sześciu. Wykres ilustruje, że ICP zmniejszają się wraz ze wzrostem rozcieńczenia wirusa.
Krzywe zostały znormalizowane w stosunku do ICP tych samych wirusów, które spowodowały infekcje we wszystkich komórkach w studni. W tej tabeli wymieniono rozcieńczenia wirusa, które wytworzyły 30% nasycenia ICP, które zostały wybrane jako wejściowe rozcieńczenie wirusa do neutralizacji. Rysunek ten przedstawia wyniki eksperymentu neutralizacji z użyciem jednego wirusa wejściowego przeciwko pięciu surowicom odpornościowym.
Wykres ilustruje proces zakażenia wraz ze wzrostem rozcieńczenia surowicy. Znormalizowana populacja dodatnia na osi pionowej reprezentuje stosunek ICP z odpowiadającej im odpowiedzi na surowice odpornościowe w stosunku do średniego ICP wirusa referencyjnego. Na koniec miana neutralizacji określono jako odwrotności rozcieńczeń surowicy odpowiadające 50% redukcji ICP.
Test ten koncentruje się na spójności, szybkości i czułości wykrywania, w tym ilościowym miareczkowaniu wirusów wejściowych, obrazowaniu o wysokiej przepustowości i przetwarzaniu danych. Jest opłacalny, przyjazny dla użytkownika i jest rutynowo stosowany w badaniach antygenowych wirusów.
Przegląd
Niniejsze badanie prezentuje metodę mikroneutralizacji zaprojektowaną do analizy zależności antygenowych między wirusami grypy krążącymi w populacji. Protokół wykorzystuje skaner płaski i obejmuje cztery główne kroki: tytracja, ilościowa tytracja, neutralizacja i ilościowa neutralizacja.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Immunologia
- Choroby zakaźne
Tło
- Celem badania jest charakteryzacja obecnych wirusów grypy krążących w populacji.
- Ilościowo mierzy aktywność przeciwciał i działanie przeciwwirusowe.
- Metoda jest wysoko przepustowa i wysoce wrażliwa.
- Rozwiąże kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii.
Cel badania
- Charakteryzowanie właściwości antygenowych wirusów grypy.
- Ilościowa ocena zdolności neutralizacyjnych przeciwciał.
- Ocena działania przeciwwirusowego w systematyczny sposób.
Zastosowane metody
- Przygotowanie monowarstwy komórek w 96-dołkowych płytkach.
- Seriace rozcieńczenia wirusów do tytracji.
- Zastosowanie skanera płaskiego do ilościowej oceny zakażonych komórek.
- Zastosowanie specyficznych przeciwciał do wykrywania i analizy.
Główne wyniki
- Badanie skutecznie charakteryzuje całą populację zakażonych komórek.
- Wyniki wskazują na zmniejszenie populacji zakażonych komórek wraz ze wzrostem rozcieńczenia wirusa.
- Wykazano skuteczną ilościową ocenę wyników neutralizacji i tytracji.
- Dane wizualne potwierdzają skuteczność badania w analizowaniu wirusów grypy.
Wnioski
- Badanie mikroneutralizacji jest cennym narzędziem do badań w dziedzinie wirusologii.
- Dostarcza informacji na temat zależności antygenowych wirusów grypy.
- Metoda poprawia nasze zrozumienie odpowiedzi przeciwciał i działań przeciwwirusowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This imaging-based micro-neutralization assay enables quantitative, high-throughput characterization of influenza virus antigenic relationships by measuring the entire infected cell population. It supports antiviral and antibody activity assessment in a cost-effective, scanner-based format suitable for most laboratories. The method enhances predictive confidence in target validation by providing reproducible titration and neutralization data across virus subtypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative measurement of virus infectivity and antibody-mediated neutralization.
- Operational Value: Supports biological de-risking by characterizing antigenic properties of circulating influenza strains without reliance on plaque formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral and antibody screening workflows.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs via imaging and software-based analysis.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and scalability for influenza antiviral and immunogenicity studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system continuity from discovery through preclinical evaluation of antibody and antiviral candidates.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions via consistent titration and neutralization readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from early virus characterization to lead identification in antiviral and antibody development programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus-cell interactions and immune interference.
- Screening: Enables assay readiness through standardized virus titration and infected cell population quantification.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of infected cell populations and neutralization titers for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by supporting antigenic characterization relevant to vaccine and therapeutic evaluation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging-based platform for influenza virus studies across multiple seasons and strains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in virus-antibody interactions.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability through fixed imaging protocols and automated software analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable antigenic and neutralization data for portfolio prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement through consistent, quantitative assessment of antibody and antiviral candidates.
Implementation Considerations
- Requires virology and immunology expertise for virus handling, antibody preparation, and assay interpretation.
- Depends on flatbed scanner accessibility and compatible software for image acquisition and infected cell population quantification.
- Necessitates cross-team standardization of virus titration protocols and well plate mapping for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to non-influenza viruses or alternative cell lines based on infectivity optimization.
- Practical limitations include dependency on sufficient virus infectivity in selected cell lines for reliable imaging contrast.
