Name: Chirurgiczne unerwienie skóry: metoda badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach choroby skóry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Naucz się chirurgicznego unerwienia skóry myszy, aby badać rolę nerwów w homeostazie i chorobach skóry. Ta metoda umożliwia porównanie próbek z unerwioną i nieuszkodzoną skórą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Autumn Peterson za pomoc w fotografowaniu myszy, Danielowi Thoresenowi za pomoc w pracy z myszami, oraz doktorom Nicole Ward i Abdelmadjidowi Belkadiemu za pomoc w chirurgicznym odnerwieniu. Badania te były finansowane przez Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry (granty R00AR059796 i R01AR065409); Wydział Dermatologii Uniwersytetu Michigan; Program Stypendialny Nauk Biologicznych; Centrum Organogenezy; Kompleksowe Centrum Onkologiczne Uniwersytetu Michigan; oraz Fundusz Walki z Rakiem im. Johna S. i Suzanne C. Munn. Projekt S.C.P. otrzymał dofinansowanie z Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych (grant T32 GM007315). Praca ta była również wspierana przez NIH Intramural Research Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute.

Wszystkie procedury opisane w niniejszym protokole zostały wykonane zgodnie z przepisami ustanowionymi przez Zakład Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Michigan.
1. Indukuj rekombinację genetyczną u myszy
Uwaga: Szczep myszy Gli1tm3(cre/ERT2)Alj/J (Gli1-CreERT2)13 umożliwia ukierunkowanie rekombinacji genetycznej indukowanej tamoksyfenem na nabłonek TD. Skrzyżowanie tego szczepu z myszami reporterowymi B6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1Sor/J (LacZ)22 w celu wygenerowania Gli1; Zwierzęta LacZ do wizualizacji komórek TD poprzez barwienie w całości poniżej.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór tamoksyfenu o stężeniu 12,5 mg/ml w oleju kukurydzianym.
	<ol>
		<li>W probówce o pojemności 1,5 ml dodać do 20 mg krystalicznego tamoksyfenu, a następnie 1 ml oleju kukurydzianego. Mocno przykleić probówkę do mieszalnika wirowego i wirować w sposób ciągły na najwyższym ustawieniu przy temperaturze pokojowej, aż tamoksyfen całkowicie się rozpuści (2-4 godziny), co zostało potwierdzone przez badanie probówki pod mikroskopem preparacyjnym pod kątem braku cząstek tamoksyfenu.</li>
		<li>Przenieść roztwór do probówki o pojemności 15 ml i rozcieńczyć tamoksyfen do końcowego stężenia 12,5 mg/ml z dodatkowym olejem kukurydzianym. Mieszać, wirując lepki roztwór przez dodatkowe 30 sekund. Roztwór należy przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór tamoksyfenu dootrzewnowo do Gli1; Myszy LacZ, w objętości 200 μl na 20 g masy ciała myszy, dla skutecznej dawki tamoksyfenu 2,5 mg na 20 g masy myszy.</li>
</ol>
2. Biopsje skóry z kolekcji
Uwaga: W zależności od eksperymentu, biopsje skóry należy pobrać od kilku dni do tygodni po indukcji tamoksyfenu. W przypadku wszystkich operacji należy przestrzegać standardowych protokołów chirurgii gryzoni, w tym używania sterylnych rękawiczek, noszenia maski chirurgicznej lub siatki na włosy oraz przykrywania zwierzęcia sterylną serwetą chirurgiczną podczas zabiegu.
<ol>
	<li>Przygotuj 10x podstawowy roztwór znieczulający, mieszając 90 mg/ml ketaminy i 6,5 mg/ml ksylazyny w wodzie. Rozcieńczyć ten roztwór podstawowy w stosunku 1:10 do sterylnego PBS tuż przed użyciem i przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez okres do 8 miesięcy.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, znieczulenie myszy poprzez inhalację izofluranu, zaczynając od stężenia gazu 4% z tlenem, aby w pełni znieczulić zwierzę, a następnie obniżając je do 1-2% na czas trwania zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór znieczulający wstrzyknąć dootrzewnowo w dawce 200 μl na 20 g masy ciała myszy. Sprawdź, czy zwierzę osiągnęło właściwą płaszczyznę sedacji za pomocą testu szczypania palca u nogi i potwierdź, że częstość akcji serca i oddechów jest normalna (odpowiednio około 600 uderzeń i 160 oddechów na minutę).</li>
	<li>Użyj elektrycznej maszynki do strzyżenia, aby usunąć włosy z miejsca biopsji na skórze grzbietu, uważając, aby nie naciąć ani nie uszkodzić leżącej pod spodem skóry.</li>
	<li>Przygotuj miejsce operacji, wycierając ogolony obszar w kierunku od przodu do tyłu za pomocą chusteczek Betadine i nasączonych alkoholem. Upewnij się, że wszystkie ścinki włosów zostały usunięte z witryny.</li>
	<li>Obrysuj miejsce biopsji za pomocą czarnego markera, umieść zwierzę na podkładce rozgrzewającej w aseptycznym obszarze chirurgicznym i przykryj sterylną serwetą chirurgiczną (w celach demonstracyjnych pominięto sterylną serwetę, aby zwiększyć widoczność). 
	Uwaga: Aby uzyskać podłużne odcinki mieszków włosowych, dłuższa krawędź biopsji (krawędź do przekroju do histologii, ~1 cm) powinna przebiegać w kierunku przednio-tylnym (równolegle do kierunku mieszków włosowych), przystrzałkowo do grzbietowej linii środkowej (ryc. 1A).</li>
	<li>Użyj sterylnego skalpela #11, aby wykonać wycięcie na pełnej grubości wzdłuż zaznaczonego obszaru bez uszkadzania leżącej pod spodem powięzi mięśniowej. 
	Uwaga: Wycięta tkanka skórna obejmuje naskórek, skórę właściwą, tłuszcz podskórny i panniculus carnosus. Krwawienie jest zazwyczaj minimalne.</li>
	<li>Spłaszcz wyciętą próbkę skóry na suchym ręczniku papierowym stroną do skóry właściwej skierowaną w dół, odetnij nadmiar ręcznika papierowego i przechowuj próbkę w zimnym PBS do 1 godziny, jeśli konieczne jest pobranie innych próbek. Gdy wszystko będzie gotowe, przejdź do kroków 3.1 lub 3.2, aby przetworzyć próbki do histologii, lub do kroku 4, aby zabarwić całą górę β-galaktozydazą (LacZ).</li>
	<li>Szew zamyka miejsce biopsji za pomocą nylonowych szwów 6-0, w prostym, przerywanym wzorze oddalonym od siebie o około 3 mm.</li>
	<li>Nie należy zwracać myszy, które przeszły operację, do tej samej klatki co inne zwierzęta, dopóki nie osiągną pełnej rekonwalescencji.</li>
	<li>Monitoruj zwierzęta bezpośrednio po operacji, aż odzyskają przytomność, a także codziennie, aż obszar operacyjny się zagoi, zwykle w ciągu 1 tygodnia. Stosuj leki przeciwbólowe zgodnie z wyznaczonymi instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i stosuj, jeśli myszy wykazują oznaki bólu lub niepokoju. Usuń szwy w ciągu 7-10 dni po zabiegu. 
	Uwaga: W razie potrzeby przygotować roztwór przeciwbólowy, rozcieńczając karprofen (50 mg/ml roztwór podstawowy) w stosunku 1:100 w sterylnej wodzie. Roztwór wstrzyknąć podskórnie między łopatki w pobliżu karku, w dawce 200 μl na 20 g masy ciała (5 mg/kg masy ciała myszy).</li>
</ol>
3. Próbki procesowe do badań histologicznych
Uwaga: Aby naprawić i przetworzyć wyciętą tkankę, użyj jednej z poniższych metod, w zależności od zastosowania.
<ol>
	<li>Aby wygenerować próbki histologiczne zatopione w parafinie, utrwal skórę w 3,7% formalinie w PBS O/N w RT i przechowuj w 70% etanolu przez okres do 2 tygodni. Usuń ręcznik papierowy przed zanurzeniem w parafinie.</li>
	<li>W celu wytworzenia zamrożonych próbek histologicznych zanurz tkankę w zimnym 4% paraformaldehydzie w PBS i delikatnie wstrząsaj przez 1 godzinę. Usuń roztwór i przemyj próbkę 3 zmianami PBS, około 5 minut każda. Następnie zanurz próbkę w 30% sacharozie w PBS w celu krioochrony tkanki ("zatopienie sacharozy").</li>
	<li>Inkubować, delikatnie wstrząsając O/N w temperaturze 4 °C. Następnego dnia zdejmij ręcznik papierowy i odetnij nadmiar tkanki tłuszczowej ze strony skórnej skóry. Zanurz tkankę bezpośrednio w OCT i przechowuj zamrożony blok w temperaturze -80 °C. 
	Uwaga: Po podziale na sekcje, zarówno parafinę, jak i próbki mrożone można wybarwić metodą immunohistochemiczną w celu identyfikacji TD, komórek Merkla i nerwów przy użyciu przeciwciał przeciwko odpowiednio keratynie 17, keratynie 8 i neurofilamentowi, jak opisano wcześniej5,19.</li>
</ol>
4. Wizualizacja próbek za pomocą barwienia LacZ w całości
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór do barwienia X-gal.
	<ol>
		<li>Połącz 0,94 g sodu fosforanu jednozasadowego i 2,6 g dwuzasadowego fosforanu sodu w 250 ml sterylnej wody. Dostosuj pH do 7,3. Do tego dodać 0,5 ml 1 M chlorku magnezu, 0,528 g żelazocyjanku potasu i 0,412 g żelazocyjanku potasu. Dodać 250 μl glikolu oktylofenylopolietylenowego i 125 mg deoksycholanu. Roztwór bazowy można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy w ciemności.</li>
		<li>Przygotować 50-krotny roztwór wyjściowy X-gal, dodając dimetyloformamid do butelki wyjściowej X-gal, aby uzyskać roztwór o stężeniu 50 mg/ml. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności.</li>
		<li>Tuż przed użyciem rozcieńczyć podstawowy roztwór X-gal w stosunku 1:50 do roztworu bazowego X-gal, aby uzyskać roztwór barwiący. W przypadku mniejszych biopsji (<1cm2) należy podać 1-2 ml roztworu barwiącego na próbkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwal próbkę skóry pobraną w kroku 2.7 w roztworze zawierającym 2% paraformaldehydu/0,2% aldehydu glutarowego w zimnym PBS przez 30 minut, delikatnie wstrząsając na lodzie. W przypadku mniejszych biopsji (<1cm2) należy użyć 1-2 ml roztworu utrwalającego na próbkę. 
	Uwaga: Alternatywnie, utrwal próbki w 2-4% tylko paraformaldehydzie lub tylko w 0,5% aldehydzie glutarowym. Optymalne warunki utrwalenia zależą od tkanki, stopnia ekspresji LacZ i zastosowania.</li>
	<li>Usunąć roztwór utrwalający i przepłukać próbki trzema zmianami PBS, każda po 5 minut, na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń ręcznik papierowy znajdujący się pod próbką i odetnij nadmiar tkanki tłuszczowej od strony skóry, chwytając tłuszcz kleszczami i przycinając nożyczkami preparacyjnymi.</li>
	<li>Zanurz próbkę w roztworze barwiącym X-gal i inkubuj w temperaturze 37 °C O/N. Ekspresja LacZ będzie widoczna jako niebieska plama pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 1B). 
	Uwaga: Jeśli intensywność sygnału jest słaba, wymień roztwór barwiący następnego dnia i powtórz inkubację O/N. Jeżeli barwienie tła jest zbyt intensywne, należy skrócić czas barwienia lub inkubować próbkę w temperaturze pokojowej zamiast 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór barwiący i umyć próbki w 3 zmianach PBS zawierających 3% DMSO przez około 5 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej so.</li>
	<li>Myj próbki w 2-3 przemianach 70% etanolu przez 5 minut każda. Próbki należy przechowywać w 70% etanolu.</li>
</ol>
5. Chirurgiczne odnerwienie
<ol>
	<li>Znieczulij zwierzę jak w kroku 2.2 i ogol całą skórę grzbietową.</li>
	<li>Przygotuj obszar operacyjny skóry pleców za pomocą chusteczek Betadine i nasączonych alkoholem, a następnie przykryj zwierzę sterylną serwetą chirurgiczną (w celach demonstracyjnych pominięto sterylną zasłonę, aby zwiększyć widoczność). Utrzymuj zwierzę w cieple za pomocą poduszki grzewczej podczas operacji w aseptycznym obszarze operacyjnym.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie za pomocą sterylnego skalpela #11 wzdłuż grzbietowej linii środkowej od podstawy szyi do około 0,5 cm powyżej ogona.</li>
	<li>Używając kleszczy, delikatnie odbij skórę po lewej stronie od boku, aby uwidocznić leżącą pod spodem tkankę od poduszek tłuszczowych łopatki w pobliżu szyi do tuż nad kończyną tylną. 
	Uwaga: Nerwy grzbietowo-skórne wyglądają jak białe pasma, które przemieszczają się doogonowo przez półprzezroczystą powięź ściany tułowia, zanim wykonają ostre zagięcia i wejdą w luźną tkankę łączną pod skórą (ryc. 2).</li>
	<li>Za pomocą ultracienkich kleszczy pod mikroskopem świetlnym do preparowania należy usunąć nerwy wyłącznie z lewej strony zwierzęcia znajdującego się w miejscach anatomicznych T3-12, wyrywając z miejsca, w którym segmenty zginają się przy ścianie tułowia do miejsc ich wejścia w skórę (ryc. 2).
	<ol>
		<li>Ustaw kleszcze pionowo i usuń nerwy, chwytając około 0,5 cm poniżej ich miejsc zgięcia i ciągnąc w górę, powodując rozciągnięcie nerwu i oddzielenie się od otaczającej tkanki (ryc. 2C-E). Uważaj, aby nie pęknąć sąsiednich naczyń krwionośnych.</li>
		<li>Kontynuuj, aż wszystkie nerwy rozciągające się od ściany tułowia do skóry zostaną usunięte. Nie zakłócaj nerwów w gęstej powięzi ściany tułowia. Utrzymuj tkankę wilgotną przez cały zabieg, okresowo aplikując krople sterylnego 0,9% roztworu soli fizjologicznej.</li>
		<li>Alternatywnie usuń nerwy, chwytając ich proksymalne końce w pobliżu ściany tułowia kleszczami i tnąc cienkimi nożyczkami. Następnie odetnij dystalne końce w pobliżu skóry (ryc. 2F-H). Na koniec usuń pośrednie segmenty nerwowe (ryc. 2I).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń wszelkie nerwy z płata skóry odsłoniętego w kroku 5.4. Włókna te obejmują dystalne gałęzie grzbietowych nerwów skórnych i pojawiają się jako białe rozgałęzione pasma zlokalizowane sporadycznie w tkance łącznej po stronie skórnej płata skóry (ryc. 2J-K).
	<ol>
		<li>Aby usunąć te drobne gałęzie, ustaw cienkie kleszcze mniej więcej równolegle do powierzchni skóry, chwyć nerwy i szarp w górę, aby uniknąć przerwania naczyń krwionośnych i przebicia skóry. Kontynuuj, aż wszystkie widoczne nerwy zostaną usunięte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając rozwarstwienia, odbij skórę po prawej stronie nacięcia grzbietowej linii środkowej, ale nie usuwaj nerwów. Będzie to służyło jako kontralateralna kontrola sterowana pozorem.</li>
	<li>Zszyj wzdłuż grzbietowej linii środkowej w prosty przerywany wzór, aby zamknąć nacięcie. Monitorować zwierzę podczas rekonwalescencji i po operacji, jak wykazano wcześniej (kroki 2.8-10). Zdejmij szwy w ciągu 7-10 dni po zabiegu.</li>
	<li>Aby funkcjonalnie ocenić stabilne odnerwienie do kilku tygodni po zabiegu, należy usunąć włosy ze skóry grzbietowej za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia.</li>
	<li>Delikatnie nakłuj odnerwiony obszar skóry za pomocą igły podskórnej i zwróć uwagę, czy zwierzę reaguje, zwykle drżąc lub odwracając głowę. Jeśli obszar skóry został stabilnie odnerwiony, zwierzę będzie wykazywać niewielką reakcję lub nie będzie jej wcale.</li>
	<li>Za pomocą czarnego markera obrysuj obszar braku odpowiedzi, a także obszar o podobnej wielkości i lokalizacji po przeciwległej stronie pozorowanej.</li>
	<li>Pobrać biopsje z tych miejsc, jak w krokach 2.1-2.9 do analizy. 
	Uwaga: Alternatywnie, cała skóra grzbietu grzbietu, w tym obszary odnerwione i pozorowane, może zostać usunięta jako pojedynczy arkusz w celu barwienia całego mocowania, podobnie jak opisano w kroku 4.</li>
</ol>

<ol><li>Magnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomic+nerve+development+contributes+to+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression.</a> Science. 341, 1236361(2013).</li>
<li>Zhao, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denervation+suppresses+gastric+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Denervation suppresses gastric tumorigenesis.</a> Sci Transl Med. 6, 115(2014).</li>
<li>Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+inflammation+and+the+peripheral+nervous+system+in+host+defense+and+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology.</a> Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).</li>
<li>Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+energy+balance%3A+translating+circuits+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neural control of energy balance: translating circuits to therapies.</a> Cell. 161, 133-145 (2015).</li>
<li>Peterson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinoma+preferentially+arises+from+stem+cells+within+the+hair+follicle+and+mechanosensory+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches.</a> Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).</li>
<li>Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+denervation+of+psoriasiform+mouse+skin+improves+acanthosis+and+inflammation+in+a+sensory+neuropeptide-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner.</a> J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).</li>
<li>Ward, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+neurotoxin+A+decreases+infiltrating+cutaneous+lymphocytes+and+improves+acanthosis+in+the+KC-Tie2+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model.</a> J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).</li>
<li>Roggenkamp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fibers+modulate+keratinocyte+growth+via+neuropeptide+signaling+in+an+innervated+skin+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model.</a> J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).</li>
<li>Riol-Blanco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+sensory+neurons+drive+interleukin-23-mediated+psoriasiform+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation.</a> Nature. 510, 157-161 (2014).</li>
<li>Zanchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+toxin+type-A+for+the+treatment+of+inverse+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Eur+Acad+Dermatol+Venereol%22%5BJournal%5D)">Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis.</a> J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).</li>
<li>Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+psychoneuroimmunology+in+the+pathogenesis+of+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cutis%22%5BJournal%5D)">The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis.</a> Cutis. 46, 314-316 (1990).</li>
<li>Dewing, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remission+of+psoriasis+associated+with+cutaneous+nerve+section%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section.</a> Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).</li>
<li>Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve-derived+sonic+hedgehog+defines+a+niche+for+hair+follicle+stem+cells+capable+of+becoming+epidermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).</li>
<li>Liao, X. H., Nguyen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+expression+of+Lgr6+is+dependent+on+nerve+endings+and+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells.</a> Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).</li>
<li>Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+touch%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of touch.</a> J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).</li>
<li>Maricich, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cells+are+essential+for+light-touch+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Merkel cells are essential for light-touch responses.</a> Science. 324, 1580-1582 (2009).</li>
<li>Reinisch, C. M., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+touch+dome+in+human+skin+is+supplied+by+different+types+of+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers.</a> Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).</li>
<li>Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+touch+dome+defines+an+epidermal+niche+specialized+for+mechanosensory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling.</a> Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Hedgehog+signaling+maintains+stem+cell+renewal+in+the+sensory+touch+dome+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).</li>
<li>English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+denervation+in+type+I+cutaneous+mechanoreceptors+%28Haarscheiben%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben).</a> Anat Rec. 207, 79-88 (1983).</li>
<li>Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+in+the+regeneration+of+type+I+cutaneous+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors.</a> J Physiol. 236, 57-82 (1974).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Wright, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atoh1%2B+progenitors+maintain+the+Merkel+cell+population+in+embryonic+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice.</a> J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).</li>
<li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+dependence+in+tissue%2C+organ%2C+and+appendage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).</li>
<li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+reveals+nerve-dependent+and+independent+roles+on+mammalian+hind+limb+tissue+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).</li>
<li>Ueno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+corneal+stem%2Fprogenitor+cells+on+ocular+surface+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).</li>
<li>Westphalen, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+intestinal+tuft+cells+serve+as+colon+cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells.</a> J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).</li>
<li>Uhmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hedgehog+receptor+Patched+controls+lymphoid+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment.</a> Blood. 110, 1814-1823 (2007).</li>
<li>Lau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+gene+deletion+in+sensory+ganglia+using+a+tamoxifen-inducible+Advillin-Cre-ERT2+recombinase+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse.</a> Mol Pain. 7, 100(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nerwy pełnią kluczowe funkcje nie tylko w czuciu, ale także w rozwoju, utrzymaniu i regeneracji narządów ssaków13,24-27. Ponieważ nerwy zostały ostatnio zaangażowane w różne choroby skóry, opisane tutaj techniki można wykorzystać do badania zapotrzebowania na unerwienie w różnych modelach chorób zwierzęcych. Rzeczywiście, technika jednostronnego odnerwienia pozwala na bezpośrednie porównanie skóry z nienaruszonymi lub uszkodzonymi nerwami tej samej myszy. Zapewnia to idealną kontrolę wewnętrzną w celu skompens...

W ciągu ostatnich kilku lat, coraz bardziej doceniany jest wpływ nerwów na choroby, które zwykle nie są uważane za klasyczne neuropatie1-4. Ostatnie dowody eksperymentalne sugerują, że nerwy czuciowe mogą modulować różne patologie, od łuszczycy po raka5-9. Wykazano to przy użyciu technik takich jak chirurgiczne odnerwienie i farmakologiczne hamowanie funkcji neuronalnych u gryzoni. W przypadku łuszczycy badania te dostarczyły mechanistycznych ram do zrozumienia, dlaczego ludzkie blaszki łuszczycowe cofają się po utracie funkcji neuronalnych7,10-12.
Nerwy skórne mogą również wpływać na ekspresję genów13,14 i są kluczowe dla mechanosensingu w normalnej skórze15. W szczególności nabłonek kopuły dotykowej (TD) składa się z plamy komórek naskórka walcowatego w zestawieniu z neuroendokrynnymi komórkami Merkla unerwionymi przez wolno adaptujące się włókna nerwowe typu 1 (SA1)16-18. TD pośredniczą w odczuwaniu lekkiego dotyku i wykazano, że wykazują aktywność szlaku Hedgehog5,19. Utrzymanie TD zależy od unerwienia20,21, ponieważ nerwy wydzielają ligandy Hedgehog, aby utrzymać normalne TD i związane z nimi komórki Merkla19. Ponadto unerwienie sprzyja tworzeniu się guzów zależnych od Hedgehog z nabłonka TD5. Razem badania te wzmacniają pogląd, że skomplikowane interakcje molekularne zachodzące między nerwami a otaczającymi je komórkami w ich niszy mają kluczowe znaczenie dla prawidłowej fizjologii TD, a także choroby.
Aby zbadać naturę tych interakcji, opisujemy tutaj serię technik in vivo do manipulowania ekspresją genów w TD, jak również do pobierania biopsji skóry w celu wizualizacji TD po śledzeniu linii. Na koniec opisujemy procedury wykonywania jednostronnego chirurgicznego odnerwienia, w którym nerwy są usuwane z jednej strony skóry grzbietowej myszy, pozostawiając nienaruszoną stronę przeciwległą jako pozorowaną kontrolę wewnętrzną. Kilka tygodni po zabiegu porównuje się skórę odnerwioną i pozorowaną w celu oceny zmian, które zachodzą po ablacji nerwów. Chociaż techniki te są opisane w kontekście normalnych TD, procedura denerwacji została wykorzystana do zbadania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach łuszczycy6, gojenia się ran13 i nowotworzenia5. Wreszcie, ponieważ skóra jest podatna na wielokrotne biopsje, daje to możliwość monitorowania długoterminowych losów znakowanych komórek lub oceny postępu choroby w wielu punktach czasowych.

<table><tbody><tr><td>Wkładki nasączone alkoholem</td><td>PDI</td><td>B339</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed (Xylazine)</td><td>Lloyd</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało, anty-keratyna 8</td><td>Badania rozwojowe Hybrydoma Bank</td><td>Przeciwciało szczurze TROMA-I</td><td>, stosować w stężeniu 1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało, przeciwciało królika anty-Keratyna 17</td><td>Cell Signaling</td><td>#4543</td><td>, stosować w stężeniu 1:1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało, przeciwciało królika anty-Neurofilament</td><td>Cell Signaling</td><td>C28E10</td><td>, stosować w stężeniu 1:500</td></tr><tr><td>Podkładki przygotowawcze Betadine</td><td>Medline</td><td>MDS093917</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akumulatorowa maszynka do strzyżenia</td><td>Wahl</td><td>trymer model 8900</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>stosować w stężeniu 1:1,000</td></tr><tr><td>Deoksycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Nair Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dimetyloforamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319937</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge</td><td>Pen Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCl</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Mikro szkło osłonowe</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprowadnice</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Nici nylonowe VWR</td><td>BDH0502-4LP</td><td></td></tr><tr><td>6-0</td><td>DemeTECH</td><td>NL166012F4P</td><td></td></tr><tr><td>Glikol oktylofenylopolietylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek</td> <td>potasuSigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ultra cienkie kleszczyki</td><td>Dumont</td><td>0103-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Roche</td><td>10 651 745 001</td><td>Rozpuścić w dimetyloforamidzie, aby uzyskać 50x zapas przed użyciem</td></tr></tbody></table>

chirurgiczne unerwienie skóry: metoda badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach choroby skóry

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Skórne nerwy somatosensoryczne wykrywają różne bodźce, które działają na skórę. Oprócz ich ustalonych ról sensorycznych, ostatnie badania sugerują, że nerwy mogą również modulować choroby skóry, w tym atopowe zapalenie skóry, łuszczycę i raka. W tym miejscu opisujemy protokoły testowania zapotrzebowania nerwów na utrzymanie skórnego narządu mechanosensorycznego, kopuły dotykowej (TD). W szczególności omawiamy metody genetycznego znakowania, zbierania i wizualizacji TD poprzez barwienie całej góry oraz wykonywania jednostronnego chirurgicznego odnerwienia skóry grzbietu myszy. Razem podejścia te mogą być wykorzystane do bezpośredniego porównania morfologii TD i ekspresji genów w odnerwionej i pozorowanej skórze tego samego zwierzęcia. Metody te można również łatwo dostosować do badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach patologii skóry. Wreszcie, możliwość wielokrotnego pobierania próbek skóry daje możliwość monitorowania postępu choroby na różnych etapach i w różnym czasie po jej zainicjowaniu.

Poprzez wygenerowanie myszy wykazujących indukowaną tamoksyfenem ekspresję Gli1-CreERT2 oraz allel reporterowy LacZ, możliwe jest wizualizowanie nabłonka TD i śledzenie losów tych komórek w czasie. Cała procedura denerwacji może być zazwyczaj przeprowadzona w ciągu 1 hr na mysz i powinna powodować minimalny stres dla zwierzęcia.
Nasze wcześniejsze badania wykazały, że nerwy są kluczowe dla utrzymania zarówno pr...

Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły genetycznego znakowania skóry myszy, chirurgicznego odnerwienia, biopsji skóry i wizualizacji oznakowanego nabłonka za pomocą barwienia β-galaktozydazą metodą całego montażu. Metody te można wykorzystać do badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach normalnej i patologicznej skóry.

Chirurgiczne unerwienie skóry: metoda badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach choroby skóry

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie wpływu nerwów na skórę zdrową i patologiczną. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii normalnej skóry, takie jak to, czy nerwy skórne wpływają na homeostazę i rozwój chorób. Główną zaletą tej techniki jest możliwość porównania próbek skóry nienaruszonej i odnerwionej pochodzących od tego samego zwierzęcia.Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa, ponieważ nerwy mogą być trudne do zidentyfikowania i usunięcia przy minimalnym uszkodzeniu otaczających tkanek. Najpierw znieczul mysz i sprawdź za pomocą ucisku palca u nogi, czy zwierzę osiągnęło odpowiedni poziom sedacji. Potwierdź również, że mysz wykazuje prawidłowy oddech i tętno.Następnie umieść zwierzę na podkładce grzewczej w aseptycznym obszarze chirurgicznym. Za pomocą elektrycznej strzyżarki ostrożnie usuń sierść z grzbietu w miejscu, z którego pobierana będzie biopsja. Następnie przemyj ogoloną okolicę za pomocą gazików z Betadyne i alkoholem.Należy upewnić się, że z miejsca zabiegu usunięto wszystkie obryte włosy. Następnie należy obrysować miejsce biopsji czarnym markerem. Aby uzyskać przekroje podłużne mieszków włosowych, dłuższy

cutaneous-surgical-denervation-method-for-testing-requirement-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano tutaj model zwierzęcy Spared Nerve Injury jako mysi model obwodowego bólu neuropatycznego po częściowej denerwacji nerwu kulszowego poprzez uszkodzenie gałęzi nerwu piszczelowego i wspólnego strzałkowego, przy zachowaniu nienaruszonego nerwu podszywkowego. Modyfikację behawioralną wynikającą z allodynii mechanicznej ilościowo określono za pomocą włókien von Freya.

Model Spared Nerve Injury (SNI) indukowanej allodynii mechanicznej u myszy

Ten film demonstruje testowanie funkcji nerwu czuciowego w modelu mysim poprzez chirurgiczne odnerwienie jednej strony i pozostawienie drugiej jako kontroli. Reakcja na stymulację mechaniczną potwierdza rolę nerwów czuciowych.

Testowanie funkcji nerwów czuciowych w chirurgicznie odnerwionym modelu myszy

Model przecięcia nerwu piszczelowego jest dobrze tolerowanym, sprawdzonym i powtarzalnym modelem zaniku mięśni szkieletowych. Modelowy protokół chirurgiczny został opisany i zademonstrowany na myszach C57Black6.

Przecięcie nerwu piszczelowego - standaryzowany model atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją u myszy

Pomiary właściwości przewodnictwa nerwowego in vivo są przykładem potężnego narzędzia do charakteryzowania różnych zwierzęcych modeli chorób nerwowo-mięśniowych. Tutaj przedstawiamy łatwy i niezawodny protokół, za pomocą którego można przeprowadzić analizę elektrofizjologiczną nerwów kulszowych znieczulonych myszy.

In vivo (in vivo) Pomiary elektrofizjologiczne nerwów kulszowych myszy

Ból neuropatyczny jest konsekwencją uszkodzenia lub choroby wpływającej na układ somatosensoryczny. "Model mankietowy" bólu neuropatycznego u myszy polega na wszczepieniu mankietu polietylenowego wokół głównej gałęzi nerwu kulszowego. Mechaniczna allodynia jest testowana przy użyciu filamentów von Freya.

Model kajdanki nerwu kulszowego bólu neuropatycznego u myszy

Prezentujemy protokół chirurgiczny szczegółowo opisujący, jak wykonać aksotomię cięcia lub zgniecenia nerwu twarzowego u myszy. Akskotomia nerwu twarzowego może być wykorzystana do badania fizjologicznej reakcji na uszkodzenie nerwu i testowania technik terapeutycznych.

Aksotomia nerwu twarzowego u myszy: model do badania reakcji neuronów ruchowych na uraz

To badanie ustanawia eksperymentalny model czystej neuropatii małych włókien z resiniferatoksyną (RTX). Unikalna dawka RTX (50 μg/kg) jest optymalna do opracowania modelu neuropatii małowłóknistych, który naśladuje charakterystykę pacjenta i może pomóc w zbadaniu nocyceptywnego znaczenia molekularnego leżącego u podstaw bólu neuropatycznego.

Ustalenie mysiego modelu czystej neuropatii drobnowłóknistej z ultrasilnym agonistą przejściowego potencjału receptora waniloidowego typu 1

Zmodyfikowana operacja to uproszczona metoda dla modelu uszkodzenia nerwu oszczędzonego u myszy lub szczura, która wymaga tylko jednego podwiązania i jednego cięcia, aby uszkodzić zarówno wspólne nerwy strzałkowe, jak i łydkowe.

Zmodyfikowany model chirurgii oszczędzonego uszkodzenia nerwu bólu neuropatycznego u myszy

Ten manuskrypt przedstawia protokół chirurgicznego usuwania zazwojowych neuronów współczulnych odcinka lędźwiowego u myszy. Procedura ta ułatwi wiele badań mających na celu zbadanie roli unerwienia współczulnego w dystalnych celach tkankowych.

Chirurgiczna sympatektomia lędźwiowa u myszy

Protokół ten przedstawia powtarzalny model szczura wykorzystujący nerwy czuciowe do naśladowania bólu neuromimy u człowieka oraz oceny zabiegów chirurgicznych, oferując cenne narzędzie do badań nad neuromią translacyjną.

Nowy chirurgiczny model gryzonia do badania opcji leczenia bólu nerwiaka z wykorzystaniem ukierunkowanej renerwacji mięśni przez nerw odpiszczelowy

Naucz się chirurgicznego unerwienia skóry myszy, aby badać rolę nerwów w homeostazie i chorobach skóry. Ta metoda umożliwia porównanie próbek z unerwioną i nieuszkodzoną skórą.

Chirurgiczne unerwienie skóry: metoda badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach choroby skóry

Przeglądaj więcej filmów