Chirurgiczne unerwienie skóry: metoda badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach choroby skóry

Ogólnym celem tego zabiegu jest zbadanie wpływu nerwów na normalną i patologiczną skórę. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w normalnej biologii skóry, takie jak to, czy nerwy skórne wpływają na homeostazę i chorobę. Główną zaletą tej techniki jest to, że można porównać nienaruszone i odnerwione próbki skóry tego samego zwierzęcia.

Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ nerwy mogą być trudne do rozpoznania i usunięcia przy minimalnym uszkodzeniu otaczających tkanek. Najpierw znieczul mysz i sprawdź, czy osiągnęła właściwą płaszczyznę sedacji, używając szczypania palca u nogi. Upewnij się również, że mysz wykazuje normalny oddech i bicie serca.

Teraz umieść zwierzę na podkładce rozgrzewającej w aseptycznym obszarze chirurgicznym. Za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia ostrożnie usuń włosy z grzbietu, gdzie zostanie wykonana biopsja. Następnie przetrzyj ogolony obszar za pomocą Betadyne i chusteczek nasączonych alkoholem.

Upewnij się, że wszystkie ścinki włosów zostały usunięte z witryny. Teraz obrysuj miejsce biopsji za pomocą czarnego markera. Aby uzyskać podłużne odcinki mieszków włosowych, dłuższa krawędź biopsji powinna przebiegać w kierunku od przodu do tyłu w pobliżu grzbietowej linii środkowej.

Za pomocą skalpela wykonaj wycięcie na pełną grubość, nie uszkadzając leżącej pod spodem powięzi mięśniowej. Krwawienie jest zazwyczaj minimalne. Próbka biopsji powinna obejmować naskórek, skórę właściwą, podskórną tkankę tłuszczową i panniculus carnosus.

Spłaszcz wyciętą próbkę skóry na suchym ręczniku papierowym, skórą właściwą do dołu. Odetnij nadmiar ręcznika papierowego i przechowuj próbkę na zimnym TBS do godziny, jeśli konieczne jest pobranie innych próbek. Wracając do myszy, zszyj miejsce biopsji za pomocą 60 nylonowych szwów oddalonych od siebie o około trzy milimetry.

Następnie monitoruj mysz w klatce ratunkowej, aż odzyska przytomność. Stosuj środki przeciwbólowe zgodnie z wyznaczonymi instytucjonalnymi środkami opieki nad zwierzętami i postępuj zgodnie z ich wytycznymi, jeśli mysz wydaje się zestresowana. W ciągu siedmiu do 10 dni od zabiegu usuń szwy.

Kontynuuj przetwarzanie biopsji pod kątem histologii lub barwienia całej wierzchowca. Znieczulij zwierzę, ogol całą skórę grzbietową i oczyść obszar podobnie jak w przypadku biopsji. Teraz wykonaj nacięcie za pomocą sterylnego skalpela wzdłuż grzbietowej linii środkowej od podstawy szyi do około pół centymetra powyżej ogona.

Używając sterylnych, kleszczy, delikatnie cofnij skórę po lewej stronie od boku, aby uwidocznić leżącą pod spodem tkankę od poduszek tłuszczowych łopatki w pobliżu szyi do tuż nad kończyną tylną. Teraz zidentyfikuj grzbietowy nerw skórny pod mikroskopem świetlnym. Wyglądają one jak białe pasma, które przemieszczają się doogonowo przez półprzezroczystą powięź ściany tułowia, zanim wykonają ostre zagięcia i wejdą w luźną tkankę łączną pod skórą.

Następnie, za pomocą ultracienkich kleszczy, usuń nerw wyłącznie z lewej strony zwierzęcia znajdujący się w miejscach anatomicznych od T3 do T12, wyrywając je z miejsca, w którym ich segmenty zginają się przy ścianie tułowia, do miejsc wejścia w skórę. Ustaw kleszcze pionowo i chwyć nerwy około pół centymetra poniżej ich miejsc zgięcia. Po chwyceniu pociągnij w górę, aby nerwy się rozciągnęły i oddziel od otaczającej tkanki, aby je usunąć.

Unikaj uszkodzenia sąsiednich naczyń krwionośnych. Upewnij się, że tkanka jest wilgotna przez cały zabieg, okresowo stosując krople 0,9% roztworu soli fizjologicznej. Kontynuuj usuwanie wszystkich nerwów rozciągających się od ściany tułowia do skóry, ale nie zakłócaj nerwów w gęstej powięzi ściany tułowia.

Następnie usuń wszelkie nerwy z odsłoniętego płata skóry. Włókna te obejmują dystalne gałęzie grzbietowego nerwu skórnego i pojawiają się jako białe rozgałęzione pasma zlokalizowane sporadycznie w tkance łącznej po stronie skórnej płata skóry. Aby usunąć te drobne gałęzie, ustaw kleszcze mniej więcej równolegle do powierzchni skóry, chwyć nerw i szarp w górę.

W ten sposób usuń wszystkie widoczne nerwy. Nie nakłuwać naczyń krwionośnych i skóry. Na tym etapie ważne jest, aby uniknąć pęknięcia sąsiednich naczyń krwionośnych.

Jeśli znajdziesz nerw z sąsiednim naczyniem krwionośnym, podążaj za nim w końcu do obszaru, w którym nie ma sąsiedniego naczynia i usuń go przez wyrywanie. Teraz poluzuj skórę po prawej stronie nacięcia grzbietowej linii środkowej, ale nie usuwaj żadnych nerwów. Będzie to służyło jako kontralateralna pozorna kontrola operacyjna.

Na koniec zszyj zwierzę i monitoruj pooperacyjnie jak wcześniej. Później, aby potwierdzić stabilną utratę nerwów, kilka tygodni po zabiegu, delikatnie nakłuj odnerwiony obszar za pomocą sterylnej igły podskórnej. Zwróć uwagę, czy zwierzę reaguje, zazwyczaj drżąc lub odwracając głowę.

Jeśli obszar skóry został stabilnie odnerwiony, zwierzę będzie wykazywać niewielką reakcję lub nie będzie jej wcale. Pobieraj biopsje skóry z obszaru braku odpowiedzi i strony pozorowanej po przeciwnej stronie dla dopasowanych próbek eksperymentalnych i kontrolnych. Z biopsji ważne jest, aby pobrać próbki z wielu skrawków histologicznych w celu zidentyfikowania potencjalnych różnic w obfitości kopuły dotykowej lub morfologii między próbkami pozorowanymi i odnerwionymi.

Szczep myszy glebe one cree ERT2 umożliwia ukierunkowanie rekombinacji genetycznej wywołanej przez tamoksyfen na obszary skóry, które wykazują wysoką aktywność szlaku jeża, takie jak nabłonek kopuły dotykowej. Myszy te skrzyżowano, aby skłonić myszy reporterowe abolaxi do wizualizacji nabłonka kopuły dotykowej. Węzły mają kluczowe znaczenie dla utrzymania zarówno normalnych kopuł dotykowych, jak i powiązanych z nimi komórek Merkla.

Wykazano to eksperymentalnie poprzez stopniową utratę normalnej morfologii kopuły dotykowej, a także utratę keratyny w ośmiu zdeponowanych komórkach po odnerwieniu. Nerwy mają również kluczowe znaczenie dla promowania sygnalizacji jeża w kopule dotykowej, monitorowanej przez ekspresje ERE2 Glebe one cree oraz zbiorowego barwienia po stronie beta zarówno z pozorowanej, jak i odnerwionej skóry. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak chirurgicznie usunąć grzbietowe nerwy skórne, aby sprawdzić, czy nerwy te są zaangażowane w normalne funkcjonowanie skóry, czy też modulują chorobę.

Po opanowaniu technika ta może być wykonywana rutynowo i niezawodnie przy minimalnym stresie dla zwierzęcia. Po tej procedurze można zastosować metody takie jak barwienie aminofluorescencyjne, aby potwierdzić, czy nerwy są całkowicie usunięte ze skóry i czy ma to wpływ na ekspresję genów.