Name: Metoda ekstrakcji i analizy lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych w eksperymentach z wieloma próbkami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 39 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych. Technika ta zapewnia równowagę między przepustowością a dokładnością w badaniach ekologii mikrobowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) oraz DOE OBP Office of Energy of Energy and Renewable Energy (DE-AC05-76RL01830). Autorzy pragną podziękować Andersowi Gurdzie za jego cierpliwy i umiejętny wkład w filmowanie i montaż.

UWAGA: Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas całej procedury. Aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia próbki, nie dotykaj naczyń szklanych gołymi rękami. Nosić odpowiednie rękawice podczas wykonywania czynności protokołu, które wymagają obchodzenia się z chloroformem.
1. Przygotowania (2 dni na ~40 próbek)
<ol>
	<li>Zbierz ziemię do sterylnych worków i przetransportuj z pola w lodówce zawierającej lód. Jeżeli nie jest możliwe przesianie świeżej gleby i natychmiastowe wysuszenie, należy przechowywać próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia analizy.</li>
	<li>Przygotuj glebę przez homogenizację. Usunąć korzenie i pestki, a bryły rozbić przez grube przesiewanie (np. 2 mm).</li>
	<li>Przygotować się do liofilizacji, umieszczając podpróbki w odpowiednim pojemniku zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji liofilizatora i jak najszybciej wysuszyć na zimno. Po wysuszeniu gleby liofilizuj ją w szczelnie zamkniętym pojemniku ze środkiem osuszającym do czasu ekstrakcji. Najlepiej przechowywać liofilizowaną glebę w temperaturze co najmniej -20 °C, ale najlepiej w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przygotowując się do ekstrakcji, usuń liofilizowane gleby z magazynu i zmiel do konsystencji mąki. Metody mielenia obejmują młyn kulowy, ubijak kulowy oraz moździerz i tłuczek. Po zmieleniu ziemi przechowywać w zamrażarce (patrz 1.3). 
	UWAGA: Ilość próbki użytej do ekstrakcji zależy od zawartości materii organicznej. Ogólną wytyczną jest użycie od 0,5 do 1 g gleby o zawartości od 12 do 18% węgla w masie i od 3 do 5 g w przypadku gleby o zawartości od 1 do 3% węgla w masie.</li>
	<li>Wstępnie przepłukać probówki wirówkowe o pojemności 30 ml heksanem. Dodaj około 2 do 3 ml heksanu do probówek i wiruj przez 5 sekund. Zdekantować heksan do innej probówki i wirować. Heksan (2 do 3 ml) może być używany do seryjnego płukania sześciu probówek. Rurki płukane heksanem należy przechowywać odwrócone do góry dnem w dygestorium, a zużyty heksan wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady.</li>
	<li>Zawiń szkło w 2 do 3 warstw folii aluminiowej i umieść w piecu muflowym. Piec (muflować) szklane naczynia w temperaturze 450 °C przez 4,5 godziny.</li>
	<li>Przygotuj odczynniki.
	<ol>
		<li>Dla użytej ilości gleby dodaj chemikalia w stosunku objętościowym 0,8:1:2 dla buforu fosforanowego (bufor P):CHCl3:MeOH.</li>
		<li>Przygotować roztwór buforu P: Bufor fosforanowy: 0,1 M, pH 7,0.
		<ol>
			<li>Dodać 61 ml sterylnego bulionu 1M K2HPO4 (substancja chemiczna powinna być klasy ACS lub lepszej). Dodać 39 ml sterylnego bulionu 1 M KH2PO4 (substancja chemiczna powinna być klasy ACS lub lepszej). Napełnij do 1000 ml wodą typu 1. Doprowadzić pH do 7,0 za pomocą NaOH lub HCl. Niewykorzystany roztwór przechowywać do 7 dni w temperaturze otoczenia lub 30 dni w lodówce.</li>
			<li>Alternatywnie, odważyć 10,62 gK2HPO4 i 5,31 g KH2PO4; rozcieńczyć do 1 l wodą typu 1. Sprawdź pH, wyreguluj w razie potrzeby.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować odczynnik 1, odczynnik do zmydlania.
		<ol>
			<li>Nalej 300 ml wody typu 1. Dodać 300 mlCH3OH (stopień HPLC lub wyższy). Dodać 90,00 g NaOH (certyfikowany ACS lub lepszy). Dodaj granulki NaOH do roztworu, mieszając. Mieszaj, aż granulki się rozpuszczą. Zaleca się przechowywanie tego roztworu nie dłużej niż 30 dni.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować odczynnik 2, odczynnik do metylacji.
		<ol>
			<li>Dozować 275 mlCH3OH (klasa HPLC lub wyższa). Dodaj 325 ml certyfikowanego 6,00 N HCL, mieszając. Zaleca się przechowywanie tego roztworu nie dłużej niż 30 dni.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować odczynnik 3, odczynnik ekstrakcyjny: 50 % C6H14 (heksan), 50% C5H12O (MTBE).
		<ol>
			<li>W dygestorium połączyć 200 ml C6H14 (klasa HPLC lub wyższa) i 200 ml C5H12O (klasa HPLC lub wyższa). Dobrze wymieszaj; szczelnie zakryć. Przechowywać w szafce na materiały łatwopalne lub okapie nie dłużej niż 1 rok.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj odczynnik 4, odczynnik do płukania bazy.
		<ol>
			<li>Wlej 900 ml wody typu 1 do zlewki. Dodaj 10,80 g NaOH (Certified ACS lub lepszy) podczas mieszania. Mieszaj, aż granulki się rozpuszczą. Zaleca się przechowywanie tego roztworu nie dłużej niż 30 dni.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy wzorca wewnętrznego.
		<ol>
			<li>Odważyć 100 mg wzorca 19:0 EE. Dodać do 50 ml kolby miarowej przepłukanej heksanem. Dodać ~15 ml roztworu Hexane-MTBE (odczynnik 3) do kolby, zamieszać do rozpuszczenia. Uzupełnić do 50 ml roztworem Hexane-MTBE (odczynnik 3). Zakręć i zamieszaj, aby wymieszać. Przenieść do szklanych probówek płukanych heksanem z nakrętkami wyłożonymi PTFE i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. DZIEŃ 1 - Ekstrakcja kwasów tłuszczowych z gleby (4 do 5 godzin dla ~40 próbek)
<ol>
	<li>Przygotuj trzy pipety dozujące o pojemności od 5 do 10 ml do buforu P, chloroformu i metanolu. 
	UWAGA: Zaproponowano mniej niebezpieczne alternatywy dla chloroformu jako ekstrahenty. Mogą one skutkować równoważnymi wskaźnikami odzysku lipidów 16,17, ale nie są oceniane w tym protokole.</li>
	<li>Zważyć liofilizowane gleby do probówek wirówkowych o pojemności 30 ml i zanotować masę gleby.</li>
	<li>Zrób dwa puste miejsca i dołącz standard kontrolny (gleba, która została wcześniej wydobyta).</li>
	<li>W dygestorium dodać odczynniki do gleby w probówce wirówkowej w następującej kolejności: P-bufor, CHCl3 i MeOH (Tabela 1). Poczekaj, aż gleba zwilży się po dodaniu buforu P przed dodaniem CHCl3. Szczelnie przykryj probówki wirówkowe i przykryj, aby chronić je przed światłem.</li>
	<li>Umieść je na wytrząsarce poziomo, upewniając się, że są dobrze zabezpieczone. Przy ustawieniu prędkości obrotowej 280 obr./min, potrząsaj przez 1 h18.</li>
	<li>Przygotować dwie szklane probówki o wymiarach 16 mm x 150 mm dla każdej próbki w następujący sposób: Oznaczyć probówkę i dodać taką samą objętość CHCl3 i równą objętość buforu P.</li>
	<li>Wyjąć probówki wirówkowe z wytrząsarki i wirować przez 10 minut w temperaturze 1,430 x g i temperaturze 25 °C. W szklanej probówce powinna być widoczna separacja faz</li>.
	<li>W dygestorium zdekantować supernatant z probówki wirówkowej do jednej z probówek przygotowanych w kroku 2.6. Powtórzyć kroki od 2.4 do 2.5 i zdekantować supernatant do drugiej probówki.</li>
	<li>Bezpiecznie zakryj wszystkie szklane rurki 16 mm × 150 mm nakrętkami wyłożonymi PTFE i odwróć 10 x do wymieszania.</li>
	<li>Pozostawić próbki w spokoju przez noc do całkowitego rozdzielenia dwóch faz. W tym celu należy przechowywać próbki w ciemnej szafce/pomieszczeniu lub przykryć folią aluminiową w temperaturze pokojowej. Dopuszczalne jest pozostawienie ekstraktów do rozdzielenia w ciągu weekendu.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, jeśli ktoś chce przejść bezpośrednio do następnego etapu lub jeśli próbki zostaną naruszone następnego dnia, należy odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 25 °C. 
		UWAGA: Wszystkie próbki w grupie porównawczej należy poddać temu samemu czasowi separacji faz</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>
3. DZIEŃ 2 - Izolacja lipidów (3 do 4 godzin dla ~40 próbek)
<ol>
	<li>Włączyć aparat do odparowywania i pułapkę rozpuszczalnika. Ustawić aparat do odparowywania na 33 °C i podgrzać.</li>
	<li>Ustaw aspirator próżniowy w kapturze: kolbę z bocznym ramieniem podłączoną do pompy próżniowej, rurkę o wysokiej czystości i szklaną pipetę.</li>
	<li>Zassać górną warstwę i granicę faz (około 2/3 drogi w dół) dwóch szklanych rurek, zachowując warstwę wodną. Powtórzyć proces, używając czystej pipety dla każdej próbki.</li>
	<li>Połączyć wodne warstwy ekstraktu z drugiej probówki z warstwami ekstraktu z pierwszej probówki, ostrożnie dekantując. Upewnij się, że dekantowana rura jest wolna od zadrapań lub pęknięć.</li>
	<li>Po połączeniu ekstraktówCHCl 3 sprawdź płyn - powinien być klarowny. Jeśli nie, dodaj MeOH, aż będzie czysty.</li>
	<li>Wysuszyć wszystkie próbki za pomocą aparatu do odparowywania próżniowego. Zacznij od ustawień temperatury 33 °C, prędkości wiru 26% i ciśnienia 400 mbar.</li>
	<li>Umieścić próbki w układzie odparowywania i po 10 minutach powoli obniżyć ciśnienie do 350 mbar.</li>
	<li>Monitoruj postęp, a gdy poziom cieczy w rurze osiągnie poziom bloku grzewczego, zmniejsz ciśnienie do 300 mbar.</li>
	<li>Kontynuuj monitorowanie wysokości pozostałej cieczy, a gdy osiągnie ona głębokość około 1 cm, zmniejsz ciśnienie do 200 mbar.</li>
	<li>Po wyschnięciu próbek należy je usunąć i uruchomić pompę na dodatkowe 10 minut, aby usunąć opary.</li>
	<li>Szczelnie zamknąć probówki i przechowywać lipidy w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zasysaną ciecz należy utylizować zgodnie z obowiązującymi przepisami bezpieczeństwa chemicznego.</li>
</ol>
4. DZIEŃ 3 - Zmydlanie i metylacja (6 do 7 godzin dla ~40 próbek)
<ol>
	<li>Włącz łaźnie wodne. Ustaw kąpiel od 1 do 95 °C, a kąpiel od 2 do 80 °C.</li>
	<li>Ustaw dozowniki pipet i upewnij się, że dozują odpowiednią objętość. 
	Odczynnik 1: 1 ml na próbkę 
	Odczynnik 2: 2 ml na próbkę 
	Odczynnik 3: 1,25 ml na próbkę 
	Odczynnik 4: 3 ml na próbkę 
	UWAGA: Proces ogrzewania spowoduje wytworzenie ciśnienia w rurze. Nie używaj porysowanych, pękniętych lub wyszczerbionych rurek.</li>
	<li>Za pomocą dozownika pipetowego dodać 1,0 ml odczynnika 1 do wysuszonych lipidów. Zakręć szczelnie, wiruj przez 5 s i umieść w stojaku.</li>
	<li>Umieścić stojak z probówkami na próbki w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C na 5 minut. Zdjąć stojak z probówkami z wanny i sprawdzić, czy rurki nie przeciekają, na co wskazują pęcherzyki unoszące się w probówce. Dokręć lub załóż zaślepki nieszczelnych rurek i ponownie sprawdź, czy nie ma pęknięć lub odprysków. Kontynuuj podgrzewanie rurek w łaźni wodnej przez dodatkowe 10 minut.</li>
	<li>Wyjąć próbki z łaźni 1 i umieścić w łaźni 2 (80 °C) i kontynuować inkubację przez kolejne 15 minut.</li>
	<li>Wyjmij probówki i schłodzić próbki, umieszczając ruszt w garnku z wodą z kranu w celu schłodzenia.</li>
	<li>Dodać 2 ml odczynnika 2 do każdej próbki. Szczelnie zakryj i wiruj przez 5 do 10 sekund.</li>
	<li>Umieścić ruszt w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C i inkubować przez 10 minut.</li>
	<li>Wyjmij stojak z rurkami z łaźni wodnej i włóż do garnka z wodą z kranu w celu schłodzenia. Mieszaj stojak rur, aby przyspieszyć proces chłodzenia. 
	UWAGA: Nie przekraczaj czasu i temperatury. Zbyt duże ogrzewanie może spowodować degradację FAME.</li>
	<li>Za pomocą dozownika pipetowego dodać 1,25 ml odczynnika 3 do każdej probówki z próbką, aby wyekstrahować estry metylowe kwasów tłuszczowych. Szczelnie zakręć i umieść probówki na shakerze na 10 minut.</li>
	<li>Po wstrząśnięciu pozostaw stojak z probówkami na 10 minut, aby fazy się rozdzieliły. Przenieść fazę organiczną (warstwę wierzchnią) do szklanej probówki o wymiarach 16 mm x 100 mm za pomocą szklanej pipety.</li>
	<li>Powtórzyć ekstrakcję, ponownie dodając odczynnik 3, wstrząsając, pozwalając fazom się rozdzielić i przenosząc fazę górną. 
	UWAGA: Nie przenoś żadnej dolnej fazy. Dobrze jest pozostawić niewielką ilość górnej fazy w probówce.</li>
	<li>Za pomocą dozownika do pipet dodać 3 ml odczynnika 4 do probówek o wymiarach 16 mm x 100 mm.</li>
	<li>Szczelnie zakryj probówki i wiruj przez 20-30 s.</li>
	<li>Po wirowaniu wirować przez 3 minuty przy 1 000 × g.</li>
	<li>Za pomocą pipety z czystego szkła odessać górną fazę organiczną i przenieść do bursztynowej fiolki o pojemności 4 ml.</li>
	<li>Włączyć aparat do odparowywania i pułapkę rozpuszczalnika. Ustawić aparat do odparowywania na 30 °C, prędkość wiru na 26%, próżnię na 200 mbar i nacisnąć podgrzewanie.</li>
	<li>Monitoruj postępy. Po wyschnięciu próbek należy je usunąć i uruchomić pompę na dodatkowe 10 minut, aby usunąć opary.</li>
	<li>Wyjąć pipetę z butelek z odczynnikami 1 i 4 i przepompować przez rozcieńczony kwas (np. 1% HCl), a następnie wodę z roztworem dozwolonym. Przepłukać pipetę używaną do odczynnika 2, przepompowując ją przez wodę z d.I. Spuść rozpuszczalnik z pipety używanej do odczynnika 3 do odpowiedniego pojemnika i trzymaj go w kapturze, aż pozostałości rozpuszczalnika odparują.</li>
	<li>Pipety należy przechowywać odwrócone, z usuniętymi tłokami, aby zapobiec zakleszczeniu się zaworów zwrotnych.</li>
	<li>Jednorazowo należy użyć szklanych pipet, a następnie wyrzucić do odpowiedniego pojemnika.</li>
	<li>W okapie poczekaj, aż pozostałości rozpuszczalnika na szklanych naczyniach odparują.</li>
	<li>Opłucz szklane naczynia czystą wodą i roztworem detergentu.</li>
</ol>
5. DZIEŃ 4 - Przygotowanie roztworu roboczego i przeniesienie FAME do fiolek GC (2-3 h dla ~40 próbek)
<ol>
	<li>Zebrać materiały: 4 ml bursztynowe fiolki z wysuszonymi próbkami; bursztynowe 2 ml fiolki GC; 400 μl wkłady szklane i nakrętki z płaskim dnem; szklana strzykawka 500 μl; kolba miarowa 50 ml; Roztwór podstawowy - nonadekanian etylu (wzorzec wewnętrzny 19:0 EE) w heksanie 50/50/MTBE (odczynnik 3).</li>
	<li>Za pomocą szklanej strzykawki dodać 500 μl roztworu podstawowego nonadekanianu etylu (19:0 EE) do kolby miarowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Napełnij kolbę do wyniku wolumetrycznego odczynnikiem 3.</li>
	<li>Zakręć kolbę i odwróć 5x, aby wymieszać.</li>
	<li>Przenieść 3 ml do czystej fiolki o pojemności 4 ml w celu uzyskania zbiornika roztworu roboczego.</li>
	<li>Za pomocą szklanej strzykawki dodać 300 μl roztworu roboczego do każdej z 4 ml fiolek zawierających wysuszone estry metylowe kwasów tłuszczowych i nakrętkę.</li>
	<li>Wirować próbkę przez 15 s i odstawić na 15 minut.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety Pasteura ostrożnie przenieść zawieszone estry metylowe kwasów tłuszczowych do fiolki o pojemności 2 ml GC zawierającej wkładkę o pojemności 400 μl.</li>
	<li>Przed analizą przechowywać szczelnie zamknięte fiolki GC w zamrażarce o temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Prześlij próbki do analizy GC. 
	UWAGA: Analizę należy przeprowadzić przy użyciu specjalnej kolumny GC i warunków, które są opisane w pliku uzupełniającym S1. Najlepiej, aby analiza GC została zakończona w ciągu 2 tygodni od metylacji.</li>
</ol>

<ol><li>Van Der Heijden, M. G. a, Bardgett, R. D., Van Straalen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unseen+majority%3A+Soil+microbes+as+drivers+of+plant+diversity+and+productivity+in+terrestrial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Lett%22%5BJournal%5D)">The unseen majority: Soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems.</a> Ecol Lett. 11 (3), 296-310 (2008).</li>
<li>Bever, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rooting+theories+of+plant+community+ecology+in+microbial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Rooting theories of plant community ecology in microbial interactions.</a> Trends Ecol Evol. 25 (8), 468-478 (2010).</li>
<li>Suleiman, A. K. A., Manoeli, L., Boldo, J. T., Pereira, M. G., Roesch, L. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifts+in+soil+bacterial+community+after+eight+years+of+land-use+change%5BTitle%5D)+AND+%22Syst+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shifts in soil bacterial community after eight years of land-use change.</a> Syst Appl Microbiol. 36 (2), 137-144 (2013).</li>
<li>Sayer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071713000680">Grassland management influences spatial patterns of soil microbial communities.</a> Soil Biol Biochem. 61, 61-68 (2013).</li>
<li>Fernandes, M. F., Saxena, J., Dick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Whole-Cell+Fatty+Acid+%28MIDI%29+or+Phospholipid+Fatty+Acid+%28PLFA%29+Extractants+as+Biomarkers+to+Profile+Soil+Microbial+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecol%22%5BJournal%5D)">Comparison of Whole-Cell Fatty Acid (MIDI) or Phospholipid Fatty Acid (PLFA) Extractants as Biomarkers to Profile Soil Microbial Communities.</a> Microbial Ecol. 66 (1), 145-157 (2013).</li>
<li>van der Heijden, M. G. A., Wagg, C. <a target="_blank" href="http://www.zora.uzh.ch/77626/2/FINAL.pdf">Soil microbial diversity and agro-ecosystem functioning.</a> Plant Soil. 363 (1-2), 1-5 (2013).</li>
<li>Allison, V. J., Miller, R. M., Jastrow, J. D., Matamala, R., Zak, D. R. <a target="_blank" href="http://dzumenvis.nic.in/Microbes_and_Soil_Fertility/pdf/Changes_in_Soil_Microbial_Community_Structure.pdf">Changes in soil microbial community structure in a tallgrass prairie chronosequence.</a> Soil Sci Soc Am J. 69 (5), 1412-1421 (2005).</li>
<li>Kowalchuk, G. A., Buma, D. S., de Boer, W., Klinkhamer, P. G. L., van Veen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+above-ground+plant+species+composition+and+diversity+on+the+diversity+of+soil-borne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22A+van+Leeuw%22%5BJournal%5D)">Effects of above-ground plant species composition and diversity on the diversity of soil-borne microorganisms.</a> A van Leeuw. 81 (1-4), 509-520 (2002).</li>
<li>Bardgett, R. D., Hobbs, P. J., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF00382522">Changes in soil fungal:bacterial biomass ratios following reductions in the intensity of management of an upland grassland.</a> Biol Fert Soils. 22 (3), 261-264 (1996).</li>
<li>Frostegård, Å, Tunlid, A., Bååth, E. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071710004426">Use and misuse of PLFA measurements in soils.</a> Soil Biol Biochem. 43 (8), 1621-1625 (2011).</li>
<li>Haack, S. K., Garchow, I. H., Odelson, D. A., Forney, L. J., Klug, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+%2C+Reproducibility+%2C+and+Interpretation+of+Fatty+Acid+Methyl+Ester+Profiles+of+Model+Bacterial+Communitiest%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accuracy , Reproducibility , and Interpretation of Fatty Acid Methyl Ester Profiles of Model Bacterial Communitiest.</a> Appl Environ Microbiol. 60 (7), 2483-2493 (1994).</li>
<li>Drenovsky, R. E., Elliott, G. N., Graham, K. J., Scow, K. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071704002111">Comparison of phospholipid fatty acid ( PLFA ) and total soil fatty acid methyl esters ( TSFAME ) for characterizing soil microbial communities.</a> Soil Biol Biochem. 36, 1793-1800 (2004).</li>
<li>Cavigelli, M. A., Robertson, G. P., Klug, M. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF02183058">Fatty acid methyl ester ( FAME ) profiles as measures of soil microbial community structure.</a> Plant Soil. 170, 99-113 (1995).</li>
<li>Findlay, R. Determination of microbial community structure using phospholipid fatty acid profiles. Molecular microbial ecology manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Robert_Findlay2/publication/281208148_Determination_of_microbial_community_structure_using_phospholipid_fatty_acid_profiles/links/55db4f0b08aec156b9afe776.pdf">https://www.researchgate.net/profile/Robert_Findlay2/publication/281208148_Determination_of_microbial_community_structure_using_phospholipid_fatty_acid_profiles/links/55db4f0b08aec156b9afe776.pdf</a> 2885-2906 (2004).</li>
<li>Balser, T. C., Liang, C., Gutknecht, J. L. Linking microbial community analysis and ecosystem studies: A rapid lipd analysis protocol for high throughput. Biol Fert Soils. , Forthcoming (2017).</li>
<li>Findlay, R. H., King, G. M., Watling, L., Watling, L. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Phospholipid+Analysis+in+Determining+Microbial+Biomass+in+Sediments+Efficacy+of+Phospholipid+Analysis+in+Determining+Microbial+Biomass+in+Sedimentst%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sediments Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sedimentst.</a> Appl Environ Microbiol. 55 (11), 2888-2893 (1989).</li>
<li>Willers, C., Jansen van Rensburg, P. J., Claassens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+signature+lipid+biomarker+analysis+-+an+approach+that+is+still+preferred%2C+even+amid+various+method+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial signature lipid biomarker analysis - an approach that is still preferred, even amid various method modifications.</a> J Appl Microbiol. 118 (6), 1251-1263 (2015).</li>
<li>Balser, T. C. Phospholipid Fatty-acid Analysis (PLFA). Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nature.berkeley.edu/soilmicro/methods/BalserPLFA.pdf">http://nature.berkeley.edu/soilmicro/methods/BalserPLFA.pdf</a> (2017).</li>
<li>Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/003807179290191Y">Signature fatty-acids in phospholipids and lipopolysachharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils.</a> Soil Biol Biochem. 24 (4), 317-323 (1992).</li>
<li>Frostegard, A., Tunlid, A., Baath, E. <a target="_blank" href="http://aem.asm.org/content/59/11/3605.abstract">Phospholipid fatty-acid composition, biomass, and activity of microbial communities from 2 soil types experimentally exposed to different heavy-metals.</a> Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3605-3617 (1993).</li>
<li>Federle, T. W., Dobbins, D. C., Thorntonmanning, J. R., Jones, D. D. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1745-6584.1986.tb01013.x/abstract">Microbial biomass, activity, and community structure in subsurface soils.</a> Ground Water. 24 (3), 365-374 (1986).</li>
<li>Vestal, J. R., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+in+microbial+ecology+-+quantitative+approaches+to+the+study+of+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22BioScience%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis in microbial ecology - quantitative approaches to the study of microbial communities.</a> BioScience. 39 (8), 535-541 (1989).</li>
<li>Wilkinson, S. G. Gram negative bacteria. Microbial Lipids. , 299-488 (1988).</li>
<li>Balser, T. C., Treseder, K., Ekenler, M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071704003116">Using lipid analysis and hyphal length to quantify AM and saprotrophic fungal abundance along a soil chronosequence.</a> Soil Biol Biochem. 37 (3), 601-604 (2005).</li>
<li>Buyer, J. S., Sasser, M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139312001400">High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils.</a> Appl Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can J Biochem Phys. (37), 911-917 (1959).</li>
<li>Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of Fatty Acid Methyl Ester (FAME) Methods for Characterizing Microbial Communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).</li>
<li>Jandl, G., Leinweber, P., Schulten, H., Ekschmitt, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071704004146">Contribution of primary organic matter to the fatty acid pool in agricultural soils.</a> Soil Biol Biochem. 37, 1033-1041 (2005).</li>
<li>Nielsen, P., Petersen, S. O. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071700000419">Ester-linked polar lipid fatty acid profiles of soil microbial communities: a comparison of extraction methods and evaluation of interference from humic acids.</a> Soil Biol Biochem. 32, 1241-1249 (2000).</li>
<li>Duncan, D. S., Jewell, K. A., Suen, G., Jackson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071716000493">Detection of short-term cropping system-induced changes to soil bacterial communities differs among four molecular characterization methods.</a> Soil Biol Biochem. 96, 160-168 (2016).</li>
<li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071715004137">Switchgrass rhizospheres stimulate microbial biomass but deplete microbial necromass in agricultural soils of the upper Midwest, USA.</a> Soil Biol Biochem. 94, 173-180 (2016).</li>
<li>Jangid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071711002525">Land-use history has a stronger impact on soil microbial community composition than aboveground vegetation and soil properties.</a> Soil Biol Biochem. 43 (10), 2184-2193 (2011).</li>
<li>Ritz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+in+soil+chemical+and+microbiological+properties+in+an+upland+grassland%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Spatial structure in soil chemical and microbiological properties in an upland grassland.</a> FEMS Microbiol Ecol. 49 (2), 191-205 (2004).</li>
<li>Carini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relic+DNA+is+abundant+in+soil+and+obscures+estimates+of+soil+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity.</a> J Chem Inf Model. 53 (9), 1689-1699 (2013).</li>
<li>Lennon, J. T., Jones, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+seed+banks%3A+The+ecological+and+evolutionary+implications+of+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial seed banks: The ecological and evolutionary implications of dormancy.</a> Nat Rev Microbiol. 9 (2), 119-130 (2011).</li>
<li>Gutknecht, J. L. M., Field, C. B., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2486.2012.02686.x/abstract">Microbial communities and their responses to simulated global change fluctuate greatly over multiple years.</a> Glob Change Biol. 18, 225-269 (2012).</li>
<li>Pei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071716000511">Soil and tree species traits both shape soil microbial communities during early growth of Chinese subtropical forests.</a> Soil Biol Biochem. 96, 180-190 (2016).</li>
<li>Oates, L. G., Duncan, D. S., Sanford, G. R., Liang, C., Jackson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167880916304595">Bioenergy cropping systems that incorporate native grasses stimulate growth of plant-associated soil microbes in the absence of nitrogen fertilization.</a> Ag Ecosys Environ. 233, 396-403 (2016).</li>
<li>Bååth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+neutral+lipid+fatty+acids+to+indicate+the+physiological+conditions+of+soil+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecol%22%5BJournal%5D)">The use of neutral lipid fatty acids to indicate the physiological conditions of soil fungi.</a> Microbial Ecol. 45 (4), 373-383 (2003).</li>
<li>Ngosong, C., Gabriel, E., Ruess, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+signature+Fatty+Acid+16%3A1%CF%895+as+a+tool+to+determine+the+distribution+of+arbuscular+mycorrhizal+fungi+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipids%22%5BJournal%5D)">Use of the signature Fatty Acid 16:1ω5 as a tool to determine the distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in soil.</a> J Lipids. 2012, 236807(2012).</li>
<li>Sharma, M. P., Buyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139315300172">Comparison of biochemical and microscopic methods for quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in soil and roots.</a> Appl Soil Ecol. 95, 86-89 (2015).</li>
<li>Oates, L. G., Balser, T. C., Jackson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139312000984">Subhumid pasture soil microbial communities affected by presence of grazing, but not grazing management.</a> Appl Soil Ecol. 59, 20-28 (2012).</li>
<li>Liang, C. Potential legacy effects of biofuel cropping systems on soil microbial communities in southern Wisconsin, USA. Ag Sci. 2 (2), 131-137 (2011).</li>
<li>Herzberger, A. J., Duncan, D. S., Jackson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bouncing+Back+Plant-Associated+Soil+Microbes+Respond+Rapidly+to+Prairie+Establishment%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Bouncing Back Plant-Associated Soil Microbes Respond Rapidly to Prairie Establishment.</a> PloS One. 9 (12), 1-14 (2014).</li>
<li>Fraterrigo, J. M., Balser, T. C., Turner, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+variation+and+its+relationship+with+nitrogen+mineralization+in+historically+altered+forests%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Microbial community variation and its relationship with nitrogen mineralization in historically altered forests.</a> Ecology. 87 (3), 570-579 (2006).</li>
<li>Kao-Kniffin, J., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071706004068">Elevated CO2 differentially alters belowground plant and soil microbial community structure in reed canary grass-invaded experimental wetlands.</a> Soil Biol Biochem. 39 (2), 517-525 (2007).</li>
<li>Mentzer, J. L., Goodman, R. M., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s11104-006-0032-1">Microbial response over time to hydrologic and fertilization treatments in a simulated wet prairie.</a> Plant Soil. 284 (1-2), 85-100 (2006).</li>
<li>Ushio, M., Wagai, R., Balser, T. C., Kitayama, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071708002241">Variations in the soil microbial community composition of a tropical montane forest ecosystem: Does tree species matter.</a> Soil Biol Biochem. 40 (10), 2699-2702 (2008).</li>
<li>Bartelt-Ryser, J., Joshi, J., Schmid, B., Brandl, H., Balser, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1433831904000101">Soil feedbacks of plant diversity on soil microbial communities and subsequent plant growth.</a> Perspect Plant Ecol. 7 (1), 27-49 (2005).</li>
<li>Fichtner, A., von Oheimb, G., Härdtle, W., Wilken, C., Gutknecht, J. L. M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/259572809_Effects_of_anthropogenic_disturbances_on_soil_microbial_communities_in_oak_forests_persist_for_more_than_100_years">Effects of anthropogenic disturbances on soil microbial communities in oak forests persist for more than 100 years.</a> Soil Biol Biochem. 70, 79-87 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W przypadku badania wielu próbek z eksperymentów z wieloma powtórzeniami i/lub jednostkami eksperymentalnymi, naukowcy mogą uznać, że analiza fosfolipidowych kwasów tłuszczowych (PLFA) jest zaporowa pod względem czasu i materiałów25. Metodą PLFA fosfolipidy błon komórkowych są ekstrahowane, oczyszczane i identyfikowane za pomocą zmodyfikowanej dwufazowej ekstrakcji wodno-organicznej Bligh and Dyer26. Następnie przeprowadza się chromatografię krzemionkową w fazie stałej w celu oddzielenia lipidów według polarności oraz zasadową metylację fosfolipidowych kwasów tłuszczowych do estrów metylowych kwasów tłuszczowych. W profilowaniu PLFA wydajność lipidów może być niska, ale o bardzo wysokiej czystości. W ramach projektu Microbiologal ID wprowadzono alternatywną metodę, procedurę estru metylowego kwasów tłuszczowych (MIDI-FA). W metodzie MIDI-FA wszystkie lipidy są ekstrahowane bezpośrednio z czystych kultur lub próbek gleby/osadów 11,12,27 poprzez zmydlanie. Ta metoda ma mniejszą utratę lipidów i jest szybka, ponieważ nie ma żadnych etapów koncentracji ani oczyszczania metody PLFA. Jednakże, chociaż metoda MIDI-FA jest szybka i tańsza, ponieważ została pierwotnie zaprojektowana do identyfikacji organizmów w czystej kulturze, nie ma wstępnych etapów ekstrakcji lub oczyszczania. W związku z tym może zawierać związki podobne do lipidów ekstrahowane z materii organicznej gleby, które zniekształcają sygnaturę zbiorowiska 27,28,29. Ze względu na to, że włączenie to może również zniekształcić pomiary biomasy, MIDI-FA jest zazwyczaj używany tylko do zgrubnego jakościowego opisu lipidów w glebie13.
Opisana tutaj procedura łączy w sobie to, co najlepsze z dwóch oddzielnych procedur ekstrakcji: 1) ekstrakcję i koncentrację lipidów przy użyciu zmodyfikowanej metody Bligha i Dyera26 oraz 2) procedurę zmydlania, metylacji, ekstrakcji i płukania estrów metylowych kwasów tłuszczowych opracowanych komercyjnie. Metoda ta została opracowana w celu osiągnięcia korzyści płynących z obu tych protokołów przy jednoczesnej minimalizacji wad15. Przeprowadzając wstępną ekstrakcję i izolując składniki rozpuszczalne w organiach (np. lipidy) przed wykonaniem MIDI-FA i kończąc to etapem oczyszczania, protokół ten zapewnia równowagę między szybkością a precyzją. Chociaż metoda ta może nie być odpowiednia, gdy wymagana jest wysoka czystość (tj. do analizy 13C PLFA) lub gdy oddzielnie analizuje fosfolipidy i lipidy obojętne, w wielu przypadkach umożliwia wykrywanie reakcji społeczności drobnoustrojów na warunki środowiskowe z większą czułością niż metody oparte na DNA 30,31,32,33. Lipidy błonowe rozkładają się szybko po śmierci komórki, co pozwala im odzwierciedlać żywą społeczność drobnoustrojów w momencie pobieraniapróbek 5,7, w przeciwieństwie do środowiskowego DNA, w którym większość informacji pochodzi z martwych lub nieaktywnych organizmów34. Biorąc pod uwagę wysoki wskaźnik spoczynku obserwowany wśród mikroorganizmów glebowych35, charakterystyka żywej biomasy może być wykorzystana do zrozumienia czasowych interakcji roślina-mikroorganizmy w stosunkowo drobnej skali czasowej, a biomarkery lipidowe można wykorzystać do oceny stanu fizjologicznego społeczności drobnoustrojów7. Wykazano, że do oceny odpowiedzi mikrobiologicznej w warunkach dużego pola wymagane są metody wysokoprzepustowe25 i chociaż metoda, którą tutaj proponujemy, nie odtwarza dokładności profilowania biomarkerów PLFA, zwiększa przepustowość, jednocześnie minimalizując zmienność realizowaną za pomocą procedury MIDI-FA. Metoda ta okazała się skutecznym narzędziem w rozwiązywaniu problemów związanych z dynamiką zbiorowisk mikrobiologicznych na szerokim zakresie gleb w zakrojonych na szeroką skalę badaniach rolniczych i ekosystemowych 36,37,38,42,43,44,45,46,47,48,49,50.
Klas lipidów łączy się tą metodą i może dojść do utraty informacji zawartych w tych oddzielnych klasach22,39, ale połączenie klas lipidów może wzmocnić moc wykrywania arbuskularnego pochodzenia grzybów mikoryzowych 16:1 ω5c zarówno z lipidów fosfo-, jak i obojętnych40. Ponadto, chociaż liczba nieznanych kwasów tłuszczowych (które mogą pochodzić z nieożywionej materii organicznej) może być wyższa w przypadku tej metody, wykazano, że jest ona niższa niż MIDI-FA i pozwala na porównanie profili lipidowych z badań z wieloma próbkami, w których problemem jest przepustowość próbki15. Ogólnie uważa się, że frakcja neutralna pochodzi głównie z lipidów zapasowych wytwarzanych przez grzyby, chociaż może być również mniejszy wkład fauny glebowej41. W związku z tym opisana tutaj metoda może dać wyniki wykazujące większy udział lipidów grzybów 18:2 ω 6,9c i 18:1 ω 9c niż PLFA. Pozostałe lipidy, które mają tendencję do pojawiania się we frakcji neutralnej, to niektóre nasycone kwasy tłuszczowe, np. 16:0, 18:0, 20:0.
Istnieją różne sposoby wyrażania i analizowania danych dotyczących lipidów. Najczęstszymi reprezentacjami są obfitość (nmol g-1 gleba), frakcja molowa (nmol pojedynczy lipid nmol-1 całkowity lipid) i procent molowy (frakcja molowa * 100). Znormalizowane przez całkowitą zawartość lipidów w próbce, ułamek molowy i procent molowy są miarami względnej obfitości danego lipidu. Po odpowiednim przekształceniu, np. pierwiastek kwadratowy sinus łukowy, ułamek molowy jest odpowiedni do użycia w analizie przez składowe główne lub ordynacji analizy redundancji. Obfitość to bezwzględna ilość danego lipidu wyekstrahowanego na gram gleby. Ponieważ ilość lipidów w komórce jest rozsądnie stała, a ekstrakcja lipidów jest wysoce wydajna i kompleksowa, całkowita obfitość jest dobrym oszacowaniem całkowitej ilości lipidów, a obfitość kluczowych wskaźników odzwierciedla biomasę grupy ekologicznej, którą reprezentuje17. Wreszcie, dobrym sposobem przyjrzenia się składowi społeczności drobnoustrojów jest zastosowanie metod analizy wielowymiarowej16, np. metody porządkowania, takie jak niemetryczne skalowanie wielowymiarowe (NMDS - które nie wymaga transformacji danych) lub analiza głównych składowych (PCA), mogą być przydatne do porównywania względnej obfitości wszystkich biomarkerów lipidowych.

Biorąc pod uwagę kluczową rolę mikroorganizmów w obiegu składników odżywczych 1, modyfikacji składu zbiorowisk roślinnych 2, regulacji produktywności roślin 3, oraz rozkładu materii organicznej 4, zrozumienie zbiorowisk mikroorganizmów glebowych jest niezbędne do zrozumienia ekosystemów lądowych.
Ze względu na ich stosunkowo dużą obfitość w glebie i ich sygnaturę chemiczną, biomarkery lipidowe mogą być używane do profilowania dominujących grup ekologicznych tworzących społeczności mikroorganizmów glebowych 5. Określając ilościowo biomarkery lipidowe, które są charakterystyczne dla różnych grup drobnoustrojów, możemy oszacować całkowitą liczbę lipidów, a następnie podzielić te lipidy na grupy istotne ekologicznie, takie jak bakterie Gram-dodatnie (Gm+) i Gram-ujemne (Gm-), grzyby mikoryzowe arbuskularne (AM) i saprotroficzne oraz promieniowce <klasa sup = "xref">5,6,7,8.
Istnieje wiele metod charakteryzowania aspektów społeczności mikroorganizmów. Metoda PLFA jest powszechnie stosowana do zrozumienia podstawowej struktury zbiorowisk drobnoustrojów. Jest to skuteczny sposób oceny względnej liczebności grup drobnoustrojów, a także całkowitej biomasy drobnoustrojów. Ze względu na szybki obrót lipidów, profilowanie PLFA pozwala również na stosunkowo szybkie wykrycie zmian w zbiorowisku mikroorganizmów glebowych i dostarcza informacji, które umożliwiają porównanie funkcji ekosystemu, np. stosunek grzybów do bakterii w celu oceny tempa obiegu składników odżywczych 1,9,10. Jednakże, chociaż metoda ekstrakcji PLFA jest uświęcona tradycją i szanowana, jest również czasochłonna i nie nadaje się dobrze do badań na skalę ekosystemu, które wymagają dużej liczby próbek z replik w skali terenowej11,12.
Dla kontrastu, metoda ekstrakcji estrem metylowym kwasów tłuszczowych (MIDI-FA) ma potencjał, aby umożliwić szybką przepustowość. W tej metodzie próbki są zmydlane, przekształcane w FAME, ekstrahowane, a następnie analizowane. Metoda MIDI-FA jest szybka, ale mniej dyskryminująca niż PLFA, która łączy ekstrakcję lipidów z separacją różnych klas lipidów13 (fosfolipidy, lipidy obojętne i glikolipidy).
W tym protokole opisujemy metodę, która łączy w sobie elementy profilowania lipidów zarówno PLFA, jak i MIDI-FA. Polega ona na ekstrakcji lipidów przy użyciu początkowych etapów ekstrakcji chloroformem zmodyfikowanej metody Bligha i Dyera, a następnie zmydlaniu i konwersji do FAME. Zapewnia to niezawodny sposób wykrywania struktury społeczności drobnoustrojów przy jednoczesnym wykluczeniu dużej części szumu tła z materiałów niemikrobiologicznych 5,14. Metoda ta została opracowana w celu osiągnięcia równowagi między protokołami PLFA i MIDI-FA, tj. zachowania większości dokładności przy jednoczesnym zwiększeniu przepustowości, aby logistycznie i ekonomicznie możliwe było analizowanie lipidów z badań na dużą skalę z wieloma próbkami15. Przeprowadzając wstępną ekstrakcję i izolując składniki rozpuszczalne w organiach (np. lipidy) przed wykonaniem MIDI-FA i kończąc to etapem oczyszczania, protokół zapewnia równowagę między szybkością a precyzją.

<table><tbody><tr><td>RapidVap</td><td>Labconco</td><td>7900000</td><td>System wyparny</td></tr><tr><td>RapidVap</td><td>Labconco</td><td>7491400</td><td>Blok próbek</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa odporna na chemikalia</td><td>Labconco</td><td>7584000</td><td>Pompa próżniowa</td></tr><tr><td>Kanister pułapki chemicznej</td><td>Labconco</td><td>7815300</td><td>Kanister pułapki</td></tr><tr><td>Wkład rozpuszczalnika</td><td>Labconco</td><td>7515200</td><td>Wkład pułapki rozpuszczalnika</td></tr><tr><td>Pompa membranowa</td><td>Welch</td><td>7398000</td><td>Pompa próżniowa DryFast</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Fisher</td><td>15-462-15Q</td><td>2 studniowa łaźnia wodna</td></tr><tr><td>Chromatograf gazowy</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td> Do <td>analizy próbki</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Różne</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Do separacji próbek</td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do liofilizacji próbek</td></tr><tr><td>Repipet (6)</td><td>BrandTech</td><td>4720440</td><td>Do dozowania odczynników</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher</td><td>02-215-365</td><td>Analogowy mieszalnik wirowy</td></tr><tr><td>Teflonowe probówki</td> wirówkowe <td>Thermo/Nalgene</td><td>3114-0030</td><td>Teflonowe probówki</td></tr><tr><td></td><td>Nakrętki Thermo/Nalgene</td><td>DS3131-0020</td><td>Nasadki do probówek teflonowych</td></tr><tr><td>Probówka</td><td>Corning</td><td>9825-16</td><td>Probówki</td></tr> <tr>16x100mm<td>Probówka</td><td>Corning</td><td>9825-16xx</td><td>Probówki 16x150mm Nakrętki</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>9998-15</td><td>15-415 gwint czarne nasadki fenolowe z wkładką PTFE</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisher</td><td>13-678-20B</td><td>Szklana</td></tr><tr><td>strzykawka 14,6 cm 500 uL</td><td>Fisher</td><td>13684106LC</td><td>Hamilton 81217</td></tr><tr><td>Fiolki bursztynowe</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td>4mL Bursztynowe fiolki</td></tr><tr><td>Nakrętki</td><td>Agilent</td><td>5182-0717</td><td>Niebieskie nakrętki</td></tr><tr><td>Wkładki</td><td>Agilent</td><td>5181-3377</td><td>400uL płaskie wkładki szklane</td></tr> <tr><td><mocne>Standardy</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>19:0 nonadekanonian etylu (nonadekanonian etylu)</td><td>VWR</td><td>TCN0459-5G</td><td>Standard</td></tr> <tr><td>analityczny<silny>Chemikalia</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforan dipotasowy (K2HPO4 - klasa ACS lub lepsza)</td><td>Różne</td><td>Nie</td> dotyczy Do <td>wytwarzania monozasadowego fosforanu fosforanowego</td></tr><tr><td>fosforanu potasu (KH2PO4 - klasa ACS lub lepsza)</td><td>Różne</td><td>nie dotyczy</td> Do <td>wytwarzania metanolu fosforanowo-buforowego</td></tr><tr><td>(CH3OH - klasa HPLC lub lepsza)</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td> Do <td>wytwarzania odczynników 1 i 2</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH - klasa ACS lub lepsza)</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do wytwarzania odczynników 1 i 4</td></tr><tr><td>Kwas solny (6N HCL)</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td> Do <td>wytwarzania odczynnika 2</td></tr><tr><td>Heksan (klasa HPLC lub lepsza)</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do wytwarzania odczynnika 3</td></tr><tr><td>MTBE (eter metylowo-tert-butylowy - klasa HPLC lub lepsza)</td><td>Różne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do wytwarzania odczynnika 3</td></tr></tbody></table>

metoda ekstrakcji i analizy lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych w eksperymentach z wieloma próbkami

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Społeczności mikrobiologiczne są ważnymi czynnikami napędzającymi i regulującymi procesy ekosystemowe. Aby zrozumieć, w jaki sposób zarządzanie ekosystemami może wpływać na społeczności drobnoustrojów, stosunkowo precyzyjną, ale pracochłonną techniką badania składu społeczności mikrobiologicznej jest analiza fosfolipidowych kwasów tłuszczowych (PLFA). PLFA został opracowany do analizy biomarkerów fosfolipidowych, które mogą być wykorzystane jako wskaźniki biomasy mikrobiologicznej i składu szerokich grup funkcjonalnych grzybów i bakterii. Jest powszechnie używany do porównywania gleb w alternatywnych zbiorowiskach roślinnych, ekologii i reżimach zarządzania. Wykazano, że metoda PLFA jest czuła na wykrywanie zmian w składzie zbiorowisk drobnoustrojów.
Alternatywna metoda, ekstrakcja i analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych (MIDI-FA) została opracowana do szybkiej ekstrakcji całkowitej ilości lipidów, bez oddzielania frakcji fosfolipidowej, z czystych kultur jako technika identyfikacji mikrobiologicznej. Ta metoda jest szybka, ale jest mniej odpowiednia dla próbek gleby, ponieważ brakuje w niej początkowego etapu oddzielania cząstek gleby, a zamiast tego rozpoczyna się od reakcji zmydlania, która prawdopodobnie wytwarza artefakty z tła materii organicznej w glebie. 
Ten artykuł opisuje metodę, która zwiększa przepustowość, jednocześnie równoważąc wysiłek i dokładność ekstrakcji lipidów z błon komórkowych mikroorganizmów do wykorzystania w charakterystyce zarówno lipidów całkowitych, jak i względnej obfitości lipidów wskaźnikowych w celu określenia struktury społeczności mikroorganizmów glebowych w badaniach z wieloma próbkami. Metoda łączy w sobie dokładność osiągniętą dzięki profilowaniu PLFA poprzez ekstrakcję i zagęszczenie lipidów glebowych jako pierwszy krok oraz zmniejszenie wysiłku poprzez zmydlanie wyekstrahowanego materiału organicznego i przetwarzanie metodą MIDI-FA jako drugi krok.

Tabele danych z raportów można zebrać w arkuszu kalkulacyjnym lub bazie danych. Po skorygowaniu o czynnik odpowiedzi (współczynnik korekcyjny normalizujący odpowiedź dla różnych długości łańcuchów), pola powierzchni pików można porównać z polami powierzchni pików standardów zewnętrznych lub wewnętrznych, aby obliczyć stężenie w ekstrakcie. Poprzez podzielenie wyniku przez masę ekstrahowanej gleby, dane można wyrazić jako masę FAME na gram gleby lub, wykorzystując masę cząsteczkową każdego FAME, jako częściej raportowaną wartość nmol na gram gleby. Suma mikrobiologicznych FAME jest wskaźnikiem całkowitej biomasy mikroorganizmów i może być porównywana pomiędzy wariantami doświadczalnymi (Rycina 1). Niektóre FAME mogą być również powiązane z konkretnymi grupami mikroorganizmów, takimi jak bakterie Gram-dodatnie lub Gram-ujemne, aktynomycety, grzyby arbuskularne oraz grzyby saprotroficzne 19,20,21,22,23,24. Stosunki masy specyficznych biomarkerów mogą odzwierciedlać względną liczebność tych grup (Rycina 2). Ogólne wzorce liczebności FAME tworzą „odciski palców” na poziomie społeczności, co pozwala na porównanie niepodobieństwa społeczności mikrobiologicznych za pomocą technik wielowymiarowych, takich jak ordynacja (Rycina 3). W przeciwieństwie do większości metod opartych na DNA, dane lipidowe na poziomie społeczności można analizować jako liczebność względną lub bezwzględną. Jeśli całkowita biomasa różni się znacząco pomiędzy próbkami, te dwa podejścia dadzą bardzo odmienne wyniki; wybór odpowiedniej metody powinien być podyktowany pytaniami ekologicznymi leżącymi u podstaw eksperymentu.
<img alt="Wykres biomasy FAME; porównanie żyzności gleby w systemach uprawy kukurydzy, preriach nawożonych i nienawożonych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Całkowita biomasa FAME. Porównanie całkowitej biomasy biomarkerów FAME (nmol g-1 gleby) w przypadku ciągłej uprawy kukurydzy, preri nawożonej oraz preri nienawożonej. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy biomasy FAME, uprawa kukurydzy w porównaniu z systemem preriowym, porównanie bakterii i grzybów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Biomasa FAME bakterii i grzybów. Porównanie wariantów biomasy markerów FAME bakterii i grzybów (nmol g-1 gleby) dla ciągłej uprawy kukurydzy, nawożonej preri i preri nienawożonej. Masa grzybów i bakterii obliczona z bezwzględnej liczebności. Średnia (suma f/suma b). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres niemetrycznego skalowania wielowymiarowego (NMDS); kukurydza, prerie nawożone i nienawożone." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Niemetryczne skalowanie wielowymiarowe biomarkerów lipidowych FAME. Porównanie ogólnej struktury społeczności drobnoustrojów z wykorzystaniem profili bezwzględnej liczebności wszystkich lipidowych biomarkerów FAME drobnoustrojów. W tym przykładzie społeczności z monokultury kukurydzy i nienawożonych preri oddzieliły się i są od siebie bardzo oddalone, podczas gdy niektóre próbki z nawożonych preri mają społeczności drobnoustrojów przypominające te z kukurydzy, a inne przypominają nienawożoną prerię. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela przygotowania roztworu glebowego; objętości buforu fosforowego (P-Buffer), CHCl3 i MeOH dla różnych mas gleby." src="/files/ftp_upload/55310/55310table1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Typ rozpuszczalnika, proporcje dodawane na g-1 gleby oraz kolejność ich dodawania. Jest to istotne dla prawidłowej ekstrakcji i rozdzielenia fazy organicznej i wodnej.
Plik uzupełniający S1: <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55310/S1_GC_analysis.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać.</a>

Artykuł opisuje metodę, która zwiększa przepustowość, jednocześnie równoważąc wysiłek i dokładność ekstrakcji lipidów z błon komórkowych mikroorganizmów do wykorzystania w charakterystyce zarówno lipidów całkowitych, jak i względnej obfitości lipidów wskaźnikowych w celu określenia struktury społeczności mikroorganizmów glebowych w badaniach z wieloma próbkami.

Metoda ekstrakcji i analizy lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych w eksperymentach z wieloma próbkami

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Celem tego filmu jest opisanie metody zwiększającej przepustowość przy jednoczesnym zachowaniu równowagi między nakładem pracy a dokładnością ekstrakcji lipidów z błon komórkowych mikroorganizmów, stosowanej w celu charakterystyki zarówno lipidów całkowitych, jak i względnej zawartości lipidów wskaźnikowych do określania struktury mikrobiologicznej społeczności glebowej w badaniach obejmujących wiele próbek. W terenie należy uwzględnić heterogeniczność gleby, pobierając próbki w sposób reprezentatywny dla danego stanowiska. Aby zachować stan społeczności mikrobiologicznej w momencie poboru, próbki z terenu powinny być transportowane w lodzie.Po powrocie do laboratorium usuń korzenie i kamienie, a grudki rozbij za pomocą grubego sita. Pozwoli to również na homogenizację próbki. Przygotuj próbki do liofilizacji, umieszczając podpróbki w odpowiednich pojemnikach, a następnie przeprowadź liofilizację tak szybko, jak to możliwe.Po liofilizacji gleby należy przechowywać w szczelnym pojemniku z osuszaczem do momentu ekstrakcji. Zaleca się przechowywanie liofilizowanych gleb w temperaturze -80 °C. W ramach przygotowania do ekstrakcji należy wyjąć liofilizowane gleby z przechowywania i je zmielić. Metody mielenia obejmują użycie młyna kulowego, mielnika kulowego lub moździerza z tłuczkiem.Po ponownym zmieleniu ujednolicić dokładnie próbki gleby i przechowywać je w zamrażarce. Wszystkie naczynia laboratoryjne muszą być skrupulatnie czyste. Jakiekolwiek pozostałości detergentu, tłuszczu lub zanieczyszczeń mogą wpłynąć na wyniki, pojawiając się jako piki na końcowym chromatogramie GC.Ekstrakcje przeprowadza się w 30 mililitrowych teflonowych probówkach wirówkowych, które należy przepłukać rozpuszczalnikiem. Do probówek należy dodać od dwóch do trzech mililitrów heksanu i mieszać w wortexie przez kilka sekund. Heksan należy przelać do drugiej probówki i ponownie wymieszać w wortexie.Do seryjnego płukania sześciu probówek można użyć od dwóch do trzech mililitrów heksanu. Płukane heksanem probówki należy przechowywać dnem do góry w dygestorium, a zużyty heksan zutylizować w odpowiednim pojemniku na odpady. Szkło laboratoryjne można wyprażyć lub przepłukać rozpuszczalnikiem bezpośrednio przed użyciem.Wypalanie w piecu muflowym zapewnia czystość szkła laboratoryjnego poprzez utlenianie pozostałości w wysokiej temperaturze. Owinięto szkło dwiema do trzech warstwami folii aluminiowej i umieszczono w piecu muflowym. Ustawiono temperaturę na 450 °C, a po osiągnięciu przez piec zadanej wartości wypalano szkło przez minimum 4,5 godziny.Przed wyjęciem z pieca należy odczekać co najmniej godzinę w celu schłodzenia próbek. Należy opisać i zważyć teflonowe probówki przepłukane heksanem. Do teflonowych probówek do wirowania należy dodać glebę, a następnie ponownie zważyć je w celu określenia masy gleby.Zawsze należy przygotować co najmniej dwie próby ślepe na partię oraz standard kontrolny, najlepiej glebę, która została wcześniej poddana ekstrakcji, jeśli chcą Państwo zweryfikować poprawność przebiegu procesu ekstrakcji. Ekstrakcje lipidów. Przygotować trzy pipety transferowe o pojemności od 5 do 10 ml dla buforu fosforanowego, chloroformu i metanolu.Chloroform jest bardzo gęstą cieczą o niskim napięciu powierzchniowym. Należy zadbać o to, aby odmierzana ilość była dokładna i powtarzalna. Butelka powinna być wypełniona cieczą co najmniej do połowy.W dygestorium dodaj odczynniki do gleby w probówce teflonowej w następującej kolejności: bufor fosforanowy, chloroform i metanol. Jest to pierwsza fizyczna ekstrakcja lipidów z materiału próbkowego. Przepisy na roztwory odczynników znajdują się w protokole pisemnym.Proporcje rozpuszczalników oraz kolejność ich dodawania są istotne dla prawidłowego rozdzielenia fazy organicznej i wodnej. Po dodaniu buforu należy odczekać, aż gleba zostanie zwilżona, przed dodaniem chloroformu. W razie potrzeby ekstrahenty można połączyć i dodać jako jedną porcję podczas drugiej i każdej kolejnej ekstrakcji.Szczelnie zakręć probówki teflonowe i osłoń je przed światłem. Umieść je poziomo na wytrząsarce, upewniając się, że są dobrze zamocowane. Przy ustawieniu wysokiej prędkości wytrząsaj przez jedną godzinę.Podczas mieszania probówek, przygotuj dwie długie szklane probówki dla każdej próbki w następujący sposób. Oznacz probówkę, dodaj taką samą objętość chloroformu, jaka została dodana do gleby, oraz równą objętość buforu fosforanowego. Po wyjęciu probówek teflonowych z wytrząsarki w temperaturze 25 °C, odwiruj je przez 10 minut przy 2 500 RPM.Następnie, w dygestorium przy wyłączonym oświetleniu, przelej nadsącz z probówki teflonowej do jednej z długich probówek. W probówce szklanej powinno być widoczne rozdzielenie faz. Dolna warstwa zawiera rozpuszczalnik organiczny, głównie chloroform, oraz lipidy.Ekstrakcję tę należy powtórzyć. Przelej nadsącz do drugiej probówki przygotowanej wcześniej. W ten sposób lipidy zostały fizycznie wyekstrahowane z gleby dwukrotnie.W przypadku większości gleb jest to wystarczające. Szczelnie zamknąć wszystkie probówki typu long class zakrętkami z wyściółką teflonową i odwrócić 10 razy w celu wymieszania. Rozdzielić fazy grawitacyjnie w ciągu nocy.Pozostaw próbki w spokoju przez noc, aby umożliwić całkowite rozdzielenie dwóch faz. W tym celu przechowuj próbki w ciemnej szafce lub owinięte w folię aluminiową w temperaturze pokojowej. Dopuszczalne jest pozostawienie ekstraktów do rozdzielenia w ciągu weekendu.Drugi dzień, izolacja lipidów. W drugim dniu warstwę wodną odsysa się, a lipidy zagęszcza poprzez usunięcie rozpuszczalnika w systemie odparowywania próżniowego. Próbki można również osuszyć, umieszczając je w łaźni wodnej lub piaskowej i aplikując łagodny strumień azotu.ciecz w probówkach powinna być teraz wyraźnie rozdzielona i w dużej mierze przejrzysta. Jeśli tak nie jest lub jeśli granica między dwiema warstwami jest szczególnie gruba, należy pozostawić próbki do dalszego rozdzielania na kolejny dzień. W dygestorium należy przygotować aspirator próżniowy.Jest to kolba z bocznym wylotem podłączona do pompy próżniowej za pomocą wężyka Tygon i pipety Pasteura. Przy włączonej pompie użyj pipety, aby odessać fazę wodną do kolby. Odessaj górną warstwę oraz fazę graniczną.Będzie to w przybliżeniu 2/3 wysokości. Powtórz tę czynność dla dwóch lub trzech zestawów szklanych probówek. Górna warstwa może zawierać kilka cząsteczek gleby.Jeśli to możliwe, usuń te pozostałości. Połącz ekstrakt z drugiego i/lub trzeciego zestawu probówek z ekstraktem z dwóch pierwszych, ostrożnie go przelewając. Staraj się nie przelewać żadnego materiału stałego i wypłucz ścianki probówki poprzez obracanie.Do każdej próbki należy użyć czystej pipety i powtórzyć ten proces dla pozostałych próbek. Po połączeniu ekstraktów chloroformowych i odczekaniu kilku minut należy sprawdzić powierzchnię cieczy. Często tworzy się na niej cienka warstwa resztkowej wody.Jeśli jest obecna, należy ją odessać przed kontynuacją. Pozostała woda może reagować z wiązaniami podwójnymi kwasów tłuszczowych, jednak bardzo niewielka jej ilość powinna odparować wraz z rozpuszczalnikami podczas suszenia próbek. Wszystkie próbki należy wysuszyć do całkowitego odparowania za pomocą aparatu do odparowywania próżniowego.Szczelnie zakręć probówki i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Dzień trzeci, saponifikacja i metylacja. Najpierw włącz łaźnie wodne. Sprawdź poziom wody i ustaw łaźnię pierwszą na 95 °C, a łaźnię drugą na 80 °C. Używając repipety, dodaj 1 ml odczynnika do saponifikacji, Odczynnik 1, do wysuszonych lipidów.Mocno zakręć nakrętki, krótko wymieszaj w wirówce typu vortex i umieść probówki w statywie. Po wykonaniu tego kroku umieść statyw z probówkami w kąpieli wodnej o temperaturze 95°C na pięć minut. Wyjmij statyw z kąpieli i sprawdź, czy probówki nie przeciekają.Będzie to widoczne w postaci pęcherzyków unoszących się w probówce, przypominających pianę. Ponownie dokręć lub wymień nakrętki w nieszczelnych probówkach. Kontynuuj ogrzewanie probówek w kąpieli wodnej przez kolejne 10 minut.Obniż temperaturę kąpieli wodnej do 80 °C i kontynuuj inkubację przez kolejne 15 minut. Wyjmij probówki i schłodź je, umieszczając statyw w kuwecie z wodą z kranu. Nie używaj wody z lodem.Po ostygnięciu próbek należy dodać do każdej z nich dwa mililitry odczynnika do metylacji, Reagent 2. Ponownie szczelnie zakręcić probówki i wymieszać w wirówce typu vortex przez 5 do 10 sekund. W roztworze mogą pojawić się widoczne ziarniste sole w formie osadu, co zdarza się niekiedy z powodu nadmiaru odczynników.Umieść statyw w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C i inkubuj przez 10 minut. Wyjmij statyw z probówkami z łaźni wodnej i umieść go w kuwecie z wodą z kranu w celu schłodzenia. Potrząśnij statywem, aby przyspieszyć proces chłodzenia.Używając repipety, dodaj po 1,25 milliliters heksanu i metylu tercjowo-butylowego eteru, Odczynnik 3, do każdej probówki w celu ekstrakcji fazy. Szczelnie zakręć nakrętki i umieść probówki na shakerze na 10 minutes. Po wytrząsaniu pozostaw statyw z probówkami na 10 minutes, aby fazy mogły się rozdzielić.Przenieś fazę organiczną, która znajduje się obecnie w górnej warstwie, do krótkiej szklanej probówki za pomocą pipety Pasteura. Należy dążyć do odzyskania jak największej ilości cieczy. Bardzo niewielkie ilości fazy wodnej nie wpłyną negatywnie na ekstrakcję.Powtórz ekstrakcję w fazie wodnej poprzez dodanie Odczynnika 3, wstrząśnięcie, odczekanie do rozdzielenia się faz i przeniesienie górnej fazy. W zależności od stanu fazy dolnej czynność tę można powtórzyć jeszcze raz, aby uzyskać łącznie trzy transfery. Do ekstraktów w krótkich probówkach dodaj 3 milliliter przemywania zasadowego, Odczynnika 4, który jest rozcieńczonym roztworem wodorotlenku sodu.Szczelnie zakręć probówki, wymieszaj w wstrząsarze vortex przez 20 do 30 sekund, a następnie wiruj przez trzy minuty przy 2 000 RPM. Po wirowaniu, używając czystej pipety Pasteura, odessij górną fazę organiczną i przenieś ją do czteromililitrowej fiolki bursztynowej. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie odessać fazy wodnej.Kolejnym krokiem jest odparowanie rozpuszczalnika do suchości w aparaturze do odparowywania próżniowego. Dzień czwarty: przygotowanie ekstraktów do analizy GC. Za pomocą pipetora dodaj 100 µL Odczynnika 3 do każdej z fiolek 4 ml zawierających wysuszoną fazę.Wymieszaj próbkę na wirówce laboratoryjnej, a następnie pozostaw ją na 10 minut. Używając drugiej pipety, ostrożnie przenieś zawiesinę FAME do fiolki do GC. Do fiolki o pojemności czterech mililitrów dodaj kolejną porcję rozpuszczalnika i krótko wymieszaj na wirówce.Przetocz fiolkę, aby upewnić się, że pozostałe na jej ściankach FAME zostały rozpuszczone. Używając ponownie drugiej pipety, przenieś rozpuszczalnik do fiolki do GC. Zakończ proces przenoszenia, dodając do fiolki trzecią porcję rozpuszczalnika, mieszając na wirówce typu vortex, a następnie przenosząc zawartość do fiolki do GC.Zakręć fiolkę do GC i przechowuj w zamrażarce. Przed analizą przechowuj szczelnie zamknięte fiolki do GC w zamrażarce. Analiza GC.Aby korzystać z tego systemu, analiza musi być przeprowadzona przy użyciu specyficznej kolumny GC. Chromatograf gazowy jest wyposażony w wtryskiwacz typu split/splitless z szklanym linerem o średnicy wewnętrznej 4 mm, zawierającym dezaktywowaną wkładkę z wełny szklanej. Wtryskiwacz jest ustawiony na 250 °C i pracuje w trybie stałego ciśnienia.Gazem nośnym jest wodór. Azot i powietrze są wymagane jako gazy wspomagające detektor. Użyto kolumny Agilent Ultra 2.Kolumna ma długość 25 metrów, średnicę wewnętrzną 2 milimetrów oraz grubość filmu fazy stacjonarnej 33 mikrometrów. Faza stacjonarna w tej kolumnie to 5% fenylu i 95% metylopolisiloksanu, znana również jako kolumna typu DB-5. W celu analizy ekstraktów lipidowych wstrzykuje się alikwot o objętości dwóch mikrolitrów przy stosunku podziału 100:1 i temperaturze pieca 170 stopni C. Po wtrysku temperatura pieca jest programowana na wzrost o pięć stopni na minutę do 300 stopni C, a następnie utrzymywana przez 12 minut.Wykonuje się serię wstrzyknięć zgodnie ze standardem MIDI, a uzyskane wyniki służą do wprowadzenia korekt zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku MIDI. Po przeprowadzeniu kalibracji w ten sposób system może wymagać sporadycznych drobnych korekt, lecz zazwyczaj powinien zapewniać dobre wyniki przy zastosowaniu tych parametrów. System MIDI generuje raport dla każdej próbki, który zawiera tabelę z jednym wierszem dla każdego zidentyfikowanego piku.Oprogramowanie podaje czas retencji piku, pole piku, identyfikację piku, a także ECL lub szacowaną długość łańcucha (parametr wykorzystywany do identyfikacji piku) oraz współczynnik odpowiedzi (parametr służący do normalizacji wariancji i odpowiedzi detektora w odniesieniu do czasu retencji). ECL określa miejsce elucji każdego nieznanego FAME w serii FAME o prostych łańcuchach. Na przykład, jeśli czas retencji nieznanego związku wypada w połowie między czasami retencji łańcuchów 12 i 13 węglowych, ECL jest raportowany jako łańcuch 12,5 węglowy.Oprogramowanie porównuje ECL każdego piku z wartościami FAME w bazie danych i w przypadku dopasowania przypisuje odpowiadającą im nazwę do nieznanego związku. W sytuacjach, gdy dwa FAME w bazie danych mają bardzo zbliżone wartości ECL, oprogramowanie podaje obie nazwy, wymieniając w pierwszej kolejności tę najbliższą. Tabele danych z raportów można zebrać w arkuszu kalkulacyjnym lub bazie danych.Po skorygowaniu o współczynnik odpowiedzi, powierzchnie pików można porównać z powierzchnią piku standardu zewnętrznego lub wewnętrznego, aby wyznaczyć stężenie ekstraktu. Poprzez podzielenie przez masę ekstrahowanej gleby, dane można wyrazić jako masę FAME na gram gleby lub, wykorzystując dodatkowo masę cząsteczkową każdego FAME, jako nanomole na gram gleby. Następnie można zsumować FAME będące biomarkerami, aby uzyskać biomasę grup mikrobiologicznych, a następnie poddać te grupy dalszej analizie.Na przykład widzimy tutaj, że nienawożone prerie wykazują większą biomasę FAME niż prerie nawożone. W obu przypadkach biomasa jest większa niż na pobliskich polach kukurydzy. Ponadto FAME są powiązane z konkretnymi grupami funkcjonalnymi, takimi jak grzyby lub bakterie.Powiązania te są specyficzne dla danego ekosystemu, dlatego ważne jest, aby nie wyciągać z nich zbyt ogólnych wniosków. Ten rodzaj analizy pokazuje, czy określone grupy są bardziej liczne w konkretnych środowiskach. W tym przypadku grzyby występują w większej liczbie na nienawożonej prerii niż na polu kukurydzy.I na koniec, innym sposobem analizy ogólnego składu społeczności mikrobiologicznej jest porównanie względnej obfitości wszystkich FAME jednocześnie przy użyciu metod ordynacji, takich jak niemetryczne skalowanie wielowymiarowe (NMDS) lub analiza głównych składowych (PCA). W ordynacji społeczności mikrobiologiczne, które są bardziej podobne, znajdują się bliżej siebie. Zatem, na podstawie naszych przykładowych danych, kukurydza i nienawożony preriowy obszar trawiasty są od siebie bardzo oddalone, podczas gdy niektóre próbki z nawożonego obszaru preriowego posiadają społeczności mikrobiologiczne przypominające te z kukurydzy, a inne przypominają obszar preriowy nienawożony.Społeczności drobnoustrojów są często bardzo zmienne nawet w obrębie jednego środowiska, w związku z czym nie zawsze dają się wyraźnie rozdzielić. Po obejrzeniu tego filmu widz powinien mieć dobrą wiedzę na temat procesu ekstrakcji biomarkerów lipidowych z błon komórkowych mikroorganizmów z gleby. Ekstrakcja fosfolipidowych kwasów tłuszczowych jest skutecznym, szybkim i niedrogim sposobem oceny grup funkcjonalnych drobnoustrojów oraz całkowitej biomasy mikrobowej poprzez identyfikację unikalnych biomarkerów mikrobiologicznych.

a-lipid-extraction-analysis-method-for-characterizing-soil-microbes

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Fosfolipidowe kwasy tłuszczowe dostarczają informacji o strukturze zbiorowisk mikroorganizmów glebowych. Przedstawiono metody ekstrakcji z próbek glebowych za pomocą jednofazowej mieszaniny chloroformu, frakcjonowania wyekstrahowanych lipidów za pomocą kolumn ekstrakcyjnych do fazy stałej oraz metalizy do produkcji estrów metylowych kwasów tłuszczowych, które są analizowane za pomocą kapilarnej chromatografii gazowej.

Ekstrakcja i analiza mikrobiologicznych fosfolipidowych kwasów tłuszczowych w glebie

To badanie przedstawia metodę wykopaliskową do badania podpowierzchniowej hydrologicznej, geochemicznej i mikrobiologicznej heterogeniczności lizymetru glebowego. Lizymetr symuluje sztuczne zbocze wzgórza, które początkowo było w jednorodnym stanie i zostało poddane działaniu około 5000 mm wody w ciągu ośmiu cykli nawadniania w okresie 18 miesięcy.

Wykopy lizymetryczne gleby do sprzężonych badań hydrologicznych, geochemicznych i mikrobiologicznych

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Przedstawiono protokół jednoczesnej ekstrakcji metabolitów, białek i lipidów z pojedynczej próbki gleby, co pozwala na skrócenie czasu przygotowania próbki i umożliwia analizy multiomiczną spektrometrią mas próbek o ograniczonych ilościach.

Protokół MPLEx do analiz multiomicznych próbek gleby

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Ten protokół służy do oznaczania lipidów w wodzie morskiej i próbkach biologicznych. Lipidy w filtratach ekstrahuje się chloroformem lub mieszaninami chloroformu i metanolu w przypadku ciał stałych. Klasy lipidów mierzy się za pomocą pręcikowej chromatografii cienkowarstwowej z detekcją płomieniowo-jonizacyjną, a ich suma daje całkowitą zawartość lipidów.

Oznaczanie całkowitej zawartości lipidów i klas lipidów w próbkach morskich

Przedstawiono protokół ekstrakcji i wstępnego zatężania estradiolu z próbek wody za pomocą zautomatyzowanego i zminiaturyzowanego systemu.

Prosta metoda automatycznej ekstrakcji próbek wody do fazy stałej do analizy immunologicznej małych zanieczyszczeń

Przedstawiono metodologię uzyskiwania wizualnych i ilościowych informacji o strukturze korzeni z danych rentgenowskiej tomografii komputerowej uzyskanych w glebie.

Wyodrębnianie metryk dla trójwymiarowych systemów korzeniowych: analiza objętości i powierzchni z danych rentgenowskiej tomografii komputerowej w glebie

Opisujemy protokół filtracji próbek wody za pomocą wkładu filtrującego i ekstrakcji środowiskowego DNA (eDNA) bez konieczności rozcinania obudowy w celu wyjęcia filtra. Protokół ten został opracowany do metabarkodowania eDNA ryb, ale ma również zastosowanie do eDNA z innych organizmów.

Zastosowanie wkładu filtracyjnego do filtracji próbek wody i ekstrakcji środowiskowego DNA

Technologia nanoporowa do sekwencjonowania biomolekuł ma szerokie zastosowanie w naukach przyrodniczych, w tym do identyfikacji patogenów, monitorowania bezpieczeństwa żywności, analizy genomicznej, metagenomicznego monitorowania środowiska i charakterystyki oporności bakterii na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę metagenomicznego sekwencjonowania DNA gleby w celu identyfikacji gatunków z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania nanoporowego.

Sekwencjonowanie DNA w nanoporach do metagenomicznej analizy gleby

Poznaj metodę ekstrakcji lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych. Technika ta zapewnia równowagę między przepustowością a dokładnością w badaniach ekologii mikrobowej.

Metoda ekstrakcji i analizy lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych w eksperymentach z wieloma próbkami

Przeglądaj więcej filmów