Metoda ekstrakcji i analizy lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych w eksperymentach z wieloma próbkami

Celem tego filmu jest opisanie metody, która zwiększa przepustowość przy jednoczesnym zrównoważeniu wysiłku i dokładności ekstrakcji lipidów z błon komórkowych mikroorganizmów w celu scharakteryzowania zarówno lipidów całkowitych, jak i względnej obfitości lipidów wskaźnikowych w celu określenia struktury zbiorowiska drobnoustrojów glebowych i badań z wieloma próbkami. W terenie należy wziąć pod uwagę niejednorodność gleby, pobierając próbki gleby w sposób, który będzie reprezentował Twoje miejsce. W celu zachowania społeczności mikrobiologicznej w czasie pobierania próbek, próbki powinny być transportowane z pola na lodzie.

Po powrocie do laboratorium usuń korzenie i kamienie oraz rozbij bryły przez grube przesiewanie. Służy to również do homogenizacji próbki. Przygotować się do liofilizacji, umieszczając próbki cząstkowe w odpowiednich pojemnikach i jak najszybciej liofilizować.

Po wysuszeniu gleby liofilizuj ją w szczelnie zamkniętym pojemniku ze środkiem osuszającym do czasu ekstrakcji. Suszone gleby liofilizowane najlepiej przechowywać w temperaturze 80 stopni C.As przygotowaniu do ekstrakcji, usunąć liofilizowane gleby z magazynu i zmielić. Metody mielenia obejmują młyn kulowy, miernik kulowy lub moździerz i tłuczek.

Po zmieleniu gleby ponownie dokładnie homogenizuj próbki gleby i przechowuj je w zamrażarce. Wszystkie przybory laboratoryjne muszą być skrupulatnie czyste. Wszelkie pozostałości detergentu, tłuszczu lub brudu mogą mieć wpływ na wyniki, pojawiając się jako pik na końcowym chromatogramie GC.

Ekstrakcje przeprowadza się w 30-mililitrowych teflonowych probówkach wirówkowych, które należy przepłukać rozpuszczalnikiem. Dodaj dwa do trzech mililitrów heksanu do probówek i wiruj przez kilka sekund. Zdekantować heksan do innej rurki i odwirować.

Dwa do trzech mililitrów heksanu można użyć do seryjnego płukania sześciu probówek. Przechowuj rurki płukane heksanem do góry nogami w dygestoriach, a zużyty heksan wyrzuć do odpowiedniego pojemnika na odpady. Naczynia szklane można stłumić lub spłukać rozpuszczalnikiem bezpośrednio przed użyciem.

Tłumienie zapewnia, że szkło jest czyste poprzez utlenianie pozostałości w wysokiej temperaturze. Zawiń szkło w dwie do trzech warstw folii aluminiowej i umieść w piecu muflowym. Ustaw na 450 stopni C, a gdy piec osiągnie nastawę, piecz przez co najmniej 4 1/2 godziny.

Odczekaj co najmniej godzinę do ostygnięcia przed wyjęciem z pieca. Oznaczyć i zważyć probówki teflonowe płukane heksanem. Dodaj ziemię do probówek wirowych teflonowych i ponownie zważ masę gleby.

Zawsze wykonuj co najmniej dwie półfabrykaty na partię i dołączaj wzorzec kontrolny, najlepiej glebę, która została wcześniej wyekstrahowana, jeśli chcesz sprawdzić, czy ekstrakcja przebiegła prawidłowo. Ekstrakcje lipidów. Przygotuj trzy pipety o pojemności od 5 do 10 mililitrów do buforu fosforanowego, chloroformu i metanolu.

Chloroform jest bardzo gęstą cieczą o niskim napięciu powierzchniowym. Uważaj, aby dozowana ilość była dokładna i spójna. Utrzymuj butelkę wypełnioną płynem co najmniej do połowy.

W dygestorii dodaj odczynniki do gleby w rurce teflonowej w następującej kolejności: bufor fosforanowy, chloroform i metanol. Jest to pierwsza fizyczna ekstrakcja lipidów z materiału próbki. Receptury roztworów odczynników zawarte są w pisemnym protokole.

Proporcje rozpuszczalnika i kolejność dodawania są ważne dla prawidłowego oddzielenia fazy organicznej i wodnej. Odczekać, aż gleba zwilży się po dodaniu buforu przed dodaniem chloroformu. Jeśli jest to wygodne, ekstraktory można łączyć i dodawać jako pojedynczą podwielokrotność do drugiej i wszelkich kolejnych ekstrakcji.

Szczelnie przykryj rurki teflonowe i przykryj, aby chronić przed światłem. Umieść je na wytrząsarce poziomo, upewniając się, że są dobrze zabezpieczone. Przy ustawieniu prędkości na wysoką potrząsaj przez godzinę.

Podczas gdy probówki się trzęsą, przygotuj dwie długie szklane probówki dla każdej próbki w następujący sposób. Oznacz probówkę, dodaj taką samą objętość chloroformu, jaka została dodana do gleby i równą objętość buforu fosforanowego. Po wyjęciu probówek teflonowych z wytrząsarki w temperaturze 25 stopni C należy odwirować probówki przez 10 minut przy 2 500 obr./min.

Następnie w dygestorium przy wyłączonych światłach zdekantować supernatant z rurki teflonowej do jednej z długich rurek. Separacja faz powinna być widoczna w szklanej rurce. Dolna warstwa zawiera rozpuszczalnik organiczny, głównie chloroform, oraz lipidy.

Ta ekstrakcja jest powtarzana. Wlać sklaratant do drugiej przygotowanej wcześniej probówki. Teraz fizycznie wyekstrahowałeś lipidy z gleby dwukrotnie.

W przypadku większości gleb jest to wystarczające. Bezpiecznie przykryj wszystkie długie probówki nakrętkami wyłożonymi teflonem i odwróć 10 razy, aby wymieszać. Oddziel fazy grawitacyjnie przez noc.

Pozostawić próbki w spokoju przez noc do całkowitego rozdzielenia dwóch faz. W tym celu należy przechowywać próbki w ciemnej szafce lub przykryć folią aluminiową w temperaturze pokojowej. Nie ma nic złego w tym, że ekstrakty rozdzielą się w weekend.

Dzień drugi, izolacja lipidów. Drugiego dnia warstwa wodna jest zasysana, a lipidy zagęszczane poprzez usunięcie rozpuszczalnika w systemie odparowywania próżniowego. Próbki można również wysuszyć, umieszczając je w kąpieli wodnej lub piaskowej i stosując delikatny strumień azotu.

Ciecz w probówkach powinna być teraz dobrze oddzielona i w dużej mierze klarowna. Jeśli tak nie lub jeśli powierzchnia styku między dwiema warstwami jest szczególnie gruba, pozwól, aby separacja trwała przez kolejny dzień. Ustaw aspirator próżniowy w okapie.

Jest to kolba z ramieniem bocznym podłączona do pompy próżniowej z rurką Tygon liściastą i pipetą pastwiskową. Przy pracującej pompie, za pomocą pipety odciągnąć fazę wodną do kolby. Zassać górną warstwę i interfejs.

Będzie to około 2/3 drogi w dół. Zrób to z dwoma lub trzema zestawami szklanych rurek. Wierzchnia warstwa może zawierać kilka cząstek gleby.

Usuń je, jeśli to możliwe. Połącz ekstrakt z drugiego i/lub trzeciego zestawu probówek z ekstraktem z pierwszych dwóch, ostrożnie dekantując. Staraj się wykluczyć z nalewania jakiegokolwiek materiału stałego i spłucz ścianki rurki, obracając.

Użyj czystej pipety do każdej próbki i powtórz ten proces dla pozostałych próbek. Gdy ekstrakty chloroformowe zostaną połączone i pozostaną w pozycji przez kilka minut, należy sprawdzić powierzchnię cieczy. Często tworzy się cienka warstwa resztkowej wody.

Jeśli tak jest, zaaspiruj przed kontynuowaniem. Woda resztkowa może atakować podwójne wiązania kwasów tłuszczowych, ale bardzo mała ilość powinna współparować z rozpuszczalnikami podczas suszenia próbek. Wysuszyć wszystkie próbki za pomocą aparatu do odparowywania próżniowego.

Szczelnie zamknij probówki i przechowuj w zamrażarce w temperaturze 80 stopni C. Dzień trzeci, zmydlenie i metylacja. Najpierw włącz kąpiele wodne. Sprawdź poziom wody i ustaw kąpiel od jednej do 95 stopni C i kąpiel od dwóch do 80 stopni C. Za pomocą ponownej pipety dodaj jeden mililitr odczynnika do zmydlania, odczynnika 1, do wysuszonych lipidów.

Zakręć szczelnie, krótko zwiruj i umieść na stojaku. Po wykonaniu tego kroku umieść stojak z rurkami w łaźni wodnej o temperaturze 95 stopni C i odczekaj pięć minut. Wyjmij stojak na rurki z wanny i sprawdź, czy rurki nie przeciekają.

Będzie to sygnalizowane przez bąbelki unoszące się w rurce jak piana. Dokręć lub załóż zaślepki nieszczelnych rurek. Kontynuuj podgrzewanie rurek w łaźni wodnej przez kolejne 10 minut.

Zmniejsz ustawienie temperatury na łaźni wodnej do 80 stopni C i kontynuuj inkubację przez kolejne 15 minut. Wyjmij rurki i ostudź, umieszczając ruszt w garnku z wodą z kranu. Nie używaj lodowatej wody.

Po ostygnięciu próbek dodać dwa mililitry odczynnika do metylacji, odczynnika 2, do każdej próbki. Ponownie szczelnie zakryj i wiruj przez pięć do 10 sekund. Granulowane sole mogą stać się widoczne jako środek strącający w roztworze, co czasami zdarza się z powodu nadmiaru odczynników.

Umieść ruszt w łaźni wodnej o temperaturze 80 stopni C i inkubuj przez 10 minut. Wyjmij stojak z rurkami z łaźni wodnej i włóż go do garnka z wodą z kranu w celu schłodzenia. Porusz stojak, aby przyspieszyć proces chłodzenia.

Za pomocą ponownej pipety dodaj jeden 1,25 mililitra heksanu i tert-t-metylowego eteru butylowego, odczynnika 3, do każdej probówki, aby wyekstrahować fazę. Szczelnie zamknij nakrętki i umieść probówki na shakerze na 10 minut. Po wstrząśnięciu pozostaw stojak z probówkami na 10 minut, aby fazy się rozdzieliły.

Przenieś fazę organiczną, która jest teraz górną warstwą, do krótkiej szklanej rurki za pomocą pipety pastwiskowej. Najlepiej jest odzyskać większość płynu. Bardzo małe ilości fazy wodnej nie zagrożą ekstrakcji.

Powtórzyć ekstrakcję do fazy wodnej, dodając odczynnik 3, wstrząsając, pozwalając fazom się rozdzielić i przenosząc fazę górną. W zależności od stanu dolnej fazy, możesz powtórzyć to jeszcze raz, w sumie trzy transfery. Dodaj 3 mililitry płukania bazy, odczynnika 4, który jest rozcieńczonym roztworem wodorotlenku sodu, do ekstraktów w krótkich probówkach.

Szczelnie zakryj probówki i wiruj przez 20 do 30 sekund, a następnie odwiruj przez trzy minuty z prędkością 2 000 obr./min. Po odwirowaniu, za pomocą czystej pipety pastwiskowej, odessać górną fazę organiczną i przenieść do czteromililitrowej bursztynowej fiolki. Bądź bardzo ostrożny, aby nie zassać żadnej fazy wodnej.

Następnym krokiem jest odparowanie rozpuszczalnika do sucha w aparacie do odparowywania próżniowego. Dzień czwarty, przygotowanie ekstraktów do analizy GC. Za pomocą pipetera dodać 100 mikrolitrów odczynnika 3 do każdej z 4-mililitrowych fiolek zawierających wysuszoną fazę.

Odwirować próbkę, a następnie odstawić ją na 10 minut. Używając drugiego pipetera, ostrożnie przenieść zawieszone FAME do fiolki GC. Dodać kolejną porcję rozpuszczalnika do czteromililitrowej fiolki i krótko odwirować.

Zwinąć fiolkę, aby upewnić się, że pozostałości FAME na ściankach fiolki zostały rozpuszczone. Używając ponownie drugiego pipetera, przenieść rozpuszczalnik do fiolki z chromatą chromatyczną. Zakończyć przenoszenie, dodając trzecią porcję rozpuszczalnika do fiolki, wirując i przenosząc do fiolki GC.

Zakręć fiolkę GC i przechowuj w zamrażarce. Przechowywać szczelnie zamknięte fiolki GC w zamrażarce przed analizą. Analiza GC.

Aby skorzystać z tego systemu, analiza musi być przeprowadzona przy użyciu określonej kolumny GC. Chromatograf gazowy jest wyposażony w dzielony wlot bez podziału, wyposażony w czteromilimetrową wkładkę wlotową ze szkła ID z dezaktywowaną zatyczką z waty szklanej. Wlot jest ustawiony na 250 stopni C i pracuje w trybie stałego ciśnienia.

Gakiem nośnym jest wodór. Azot i powietrze są potrzebne jako gazy pomocnicze detektora. Używana jest kolumna Agilent Ultra 2.

Kolumna ma 25 metrów długości, 2 milimetry średnicy wewnętrznej i 33 mikrometry grubości warstwy fazy stacjonarnej. Faza stacjonarna w tej kolumnie to 5% fenylu, 95% metylopolisiloksan, znany również jako kolumna typu DB-5. Aby przeanalizować ekstrakty lipidowe, wstrzykuje się dwulitrową porcję w proporcji 100:1 z temperaturą piekarnika 170 stopni C.Post wstrzyknięciu, piekarnik jest zaprogramowany na wzrost z prędkością pięciu stopni na minutę do 300 stopni C, a następnie utrzymuje się przez 12 minut.

Wykonywana jest seria iniekcji standardu MIDI, a wyniki są wykorzystywane do dokonywania regulacji zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji MIDI. Po skalibrowaniu w ten sposób system może czasami wymagać drobnych regulacji, ale generalnie powinien osiągać dobre wyniki przy użyciu tych parametrów. System MIDI generuje raport dla każdej próbki zawierający tabelę z jedną linią na każdy zrealizowany pik.

Oprogramowanie raportuje czas utrzymania piku, obszar piku, identyfikację piku, wraz z ECL lub szacowaną długością łańcucha, parametrem używanym do identyfikacji piku oraz współczynnikiem odpowiedzi, parametrem używanym do normalizacji zmian i odpowiedzi detektora w odniesieniu do czasu retencji. ECL wyraża, gdzie wśród serii FAME o prostym łańcuchu wymywa się każdy nieznany FAME. Na przykład, jeśli czas retencji nieznanego elementu wymywa się w połowie drogi między czasem łańcucha węglowego 12 i 13, ECL jest podawany jako łańcuch węglowy 12,5.

Oprogramowanie porównuje ECL każdego piku z tymi FAME w bazie danych, a w miejscu, w którym występują dopasowania, przypisuje odpowiednią nazwę nieznanemu. W przypadkach, gdy dwie nazwy FAME w bazie danych mają bardzo zbliżone ECL, oprogramowanie zgłasza obie nazwy, wymieniając najbliższą jako pierwszą. Tabele danych z raportów można sortować w arkuszu kalkulacyjnym lub bazie danych.

Po skorygowaniu o współczynnik odpowiedzi, obszary pików można następnie porównać z powierzchnią piku wzorca zewnętrznego lub wewnętrznego, aby uzyskać stężenie ekstraktu. Dzieląc się przez masę wydobytej gleby, dane można wyrazić jako masę FAME na gram gleby lub, wykorzystując również masę cząsteczkową każdego FAME, jako nanomole na gram gleby. Biomarkery FAME można następnie zsumować, aby uzyskać biomasę cechów mikrobiologicznych, a gildie te mogą być dalej analizowane.

Na przykład widzimy tutaj nienawożone prerie z większą biomasą FAME niż prerie nawożone. Oba mają więcej biomasy niż pobliskie pola kukurydzy. Ponadto FAME są powiązane z określonymi grupami funkcjonalnymi, takimi jak grzyby lub bakterie.

Powiązania te są specyficzne dla ekosystemu, dlatego ważne jest, aby nie uogólniać ich nadmiernie. Ten rodzaj analizy pokazuje, czy pewne grupy są bardziej liczne w określonych środowiskach. Tutaj grzyby są liczniejsze na nienawożonej prerii niż na polu kukurydzy.

I wreszcie, innym sposobem spojrzenia na ogólny skład społeczności drobnoustrojów jest porównanie, patrząc na względną liczebność wszystkich FAME jednocześnie przy użyciu metod porządkowania, takich jak niemetryczne skalowanie wielowymiarowe, NMDS lub analiza głównych składników, PCA. Podczas ordynacji społeczności mikrobiologiczne, które są bardziej podobne, będą bliżej siebie. Tak więc, z naszych przykładowych danych, kukurydza i niezapłodniona preria są bardzo daleko od siebie, podczas gdy niektóre nawożone próbki prerii mają społeczności mikroorganizmów przypominające te z kukurydzy, a inne przypominają nienawożoną prerię.

Społeczności drobnoustrojów są często bardzo zmienne nawet w obrębie środowiska, więc nie zawsze będą się starannie rozdzielać. Po obejrzeniu tego filmu należy dobrze zrozumieć proces, w którym biomarkery lipidowe z błon komórkowych mikroorganizmów są ekstrahowane z gleby. Ekstrakcja fosfolipidowych kwasów tłuszczowych jest skutecznym, szybkim i niedrogim sposobem oceny cech mikrobiologicznych i całkowitej biomasy mikrobiologicznej poprzez identyfikację unikalnych biomarkerów mikrobiologicznych.