Metoda ekstrakcji i analizy lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych w eksperymentach z wieloma próbkami

Celem tego filmu jest opisanie metody zwiększającej przepustowość przy jednoczesnym zachowaniu równowagi między nakładem pracy a dokładnością ekstrakcji lipidów z błon komórkowych mikroorganizmów, stosowanej w celu charakterystyki zarówno lipidów całkowitych, jak i względnej zawartości lipidów wskaźnikowych do określania struktury mikrobiologicznej społeczności glebowej w badaniach obejmujących wiele próbek. W terenie należy uwzględnić heterogeniczność gleby, pobierając próbki w sposób reprezentatywny dla danego stanowiska. Aby zachować stan społeczności mikrobiologicznej w momencie poboru, próbki z terenu powinny być transportowane w lodzie.

Po powrocie do laboratorium usuń korzenie i kamienie, a grudki rozbij za pomocą grubego sita. Pozwoli to również na homogenizację próbki. Przygotuj próbki do liofilizacji, umieszczając podpróbki w odpowiednich pojemnikach, a następnie przeprowadź liofilizację tak szybko, jak to możliwe.

Po liofilizacji gleby należy przechowywać w szczelnym pojemniku z osuszaczem do momentu ekstrakcji. Zaleca się przechowywanie liofilizowanych gleb w temperaturze -80 °C. W ramach przygotowania do ekstrakcji należy wyjąć liofilizowane gleby z przechowywania i je zmielić. Metody mielenia obejmują użycie młyna kulowego, mielnika kulowego lub moździerza z tłuczkiem.

Po ponownym zmieleniu ujednolicić dokładnie próbki gleby i przechowywać je w zamrażarce. Wszystkie naczynia laboratoryjne muszą być skrupulatnie czyste. Jakiekolwiek pozostałości detergentu, tłuszczu lub zanieczyszczeń mogą wpłynąć na wyniki, pojawiając się jako piki na końcowym chromatogramie GC.

Ekstrakcje przeprowadza się w 30 mililitrowych teflonowych probówkach wirówkowych, które należy przepłukać rozpuszczalnikiem. Do probówek należy dodać od dwóch do trzech mililitrów heksanu i mieszać w wortexie przez kilka sekund. Heksan należy przelać do drugiej probówki i ponownie wymieszać w wortexie.

Do seryjnego płukania sześciu probówek można użyć od dwóch do trzech mililitrów heksanu. Płukane heksanem probówki należy przechowywać dnem do góry w dygestorium, a zużyty heksan zutylizować w odpowiednim pojemniku na odpady. Szkło laboratoryjne można wyprażyć lub przepłukać rozpuszczalnikiem bezpośrednio przed użyciem.

Wypalanie w piecu muflowym zapewnia czystość szkła laboratoryjnego poprzez utlenianie pozostałości w wysokiej temperaturze. Owinięto szkło dwiema do trzech warstwami folii aluminiowej i umieszczono w piecu muflowym. Ustawiono temperaturę na 450 °C, a po osiągnięciu przez piec zadanej wartości wypalano szkło przez minimum 4,5 godziny.

Przed wyjęciem z pieca należy odczekać co najmniej godzinę w celu schłodzenia próbek. Należy opisać i zważyć teflonowe probówki przepłukane heksanem. Do teflonowych probówek do wirowania należy dodać glebę, a następnie ponownie zważyć je w celu określenia masy gleby.

Zawsze należy przygotować co najmniej dwie próby ślepe na partię oraz standard kontrolny, najlepiej glebę, która została wcześniej poddana ekstrakcji, jeśli chcą Państwo zweryfikować poprawność przebiegu procesu ekstrakcji. Ekstrakcje lipidów. Przygotować trzy pipety transferowe o pojemności od 5 do 10 ml dla buforu fosforanowego, chloroformu i metanolu.

Chloroform jest bardzo gęstą cieczą o niskim napięciu powierzchniowym. Należy zadbać o to, aby odmierzana ilość była dokładna i powtarzalna. Butelka powinna być wypełniona cieczą co najmniej do połowy.

W dygestorium dodaj odczynniki do gleby w probówce teflonowej w następującej kolejności: bufor fosforanowy, chloroform i metanol. Jest to pierwsza fizyczna ekstrakcja lipidów z materiału próbkowego. Przepisy na roztwory odczynników znajdują się w protokole pisemnym.

Proporcje rozpuszczalników oraz kolejność ich dodawania są istotne dla prawidłowego rozdzielenia fazy organicznej i wodnej. Po dodaniu buforu należy odczekać, aż gleba zostanie zwilżona, przed dodaniem chloroformu. W razie potrzeby ekstrahenty można połączyć i dodać jako jedną porcję podczas drugiej i każdej kolejnej ekstrakcji.

Szczelnie zakręć probówki teflonowe i osłoń je przed światłem. Umieść je poziomo na wytrząsarce, upewniając się, że są dobrze zamocowane. Przy ustawieniu wysokiej prędkości wytrząsaj przez jedną godzinę.

Podczas mieszania probówek, przygotuj dwie długie szklane probówki dla każdej próbki w następujący sposób. Oznacz probówkę, dodaj taką samą objętość chloroformu, jaka została dodana do gleby, oraz równą objętość buforu fosforanowego. Po wyjęciu probówek teflonowych z wytrząsarki w temperaturze 25 °C, odwiruj je przez 10 minut przy 2 500 RPM.

Następnie, w dygestorium przy wyłączonym oświetleniu, przelej nadsącz z probówki teflonowej do jednej z długich probówek. W probówce szklanej powinno być widoczne rozdzielenie faz. Dolna warstwa zawiera rozpuszczalnik organiczny, głównie chloroform, oraz lipidy.

Ekstrakcję tę należy powtórzyć. Przelej nadsącz do drugiej probówki przygotowanej wcześniej. W ten sposób lipidy zostały fizycznie wyekstrahowane z gleby dwukrotnie.

W przypadku większości gleb jest to wystarczające. Szczelnie zamknąć wszystkie probówki typu long class zakrętkami z wyściółką teflonową i odwrócić 10 razy w celu wymieszania. Rozdzielić fazy grawitacyjnie w ciągu nocy.

Pozostaw próbki w spokoju przez noc, aby umożliwić całkowite rozdzielenie dwóch faz. W tym celu przechowuj próbki w ciemnej szafce lub owinięte w folię aluminiową w temperaturze pokojowej. Dopuszczalne jest pozostawienie ekstraktów do rozdzielenia w ciągu weekendu.

Drugi dzień, izolacja lipidów. W drugim dniu warstwę wodną odsysa się, a lipidy zagęszcza poprzez usunięcie rozpuszczalnika w systemie odparowywania próżniowego. Próbki można również osuszyć, umieszczając je w łaźni wodnej lub piaskowej i aplikując łagodny strumień azotu.

ciecz w probówkach powinna być teraz wyraźnie rozdzielona i w dużej mierze przejrzysta. Jeśli tak nie jest lub jeśli granica między dwiema warstwami jest szczególnie gruba, należy pozostawić próbki do dalszego rozdzielania na kolejny dzień. W dygestorium należy przygotować aspirator próżniowy.

Jest to kolba z bocznym wylotem podłączona do pompy próżniowej za pomocą wężyka Tygon i pipety Pasteura. Przy włączonej pompie użyj pipety, aby odessać fazę wodną do kolby. Odessaj górną warstwę oraz fazę graniczną.

Będzie to w przybliżeniu 2/3 wysokości. Powtórz tę czynność dla dwóch lub trzech zestawów szklanych probówek. Górna warstwa może zawierać kilka cząsteczek gleby.

Jeśli to możliwe, usuń te pozostałości. Połącz ekstrakt z drugiego i/lub trzeciego zestawu probówek z ekstraktem z dwóch pierwszych, ostrożnie go przelewając. Staraj się nie przelewać żadnego materiału stałego i wypłucz ścianki probówki poprzez obracanie.

Do każdej próbki należy użyć czystej pipety i powtórzyć ten proces dla pozostałych próbek. Po połączeniu ekstraktów chloroformowych i odczekaniu kilku minut należy sprawdzić powierzchnię cieczy. Często tworzy się na niej cienka warstwa resztkowej wody.

Jeśli jest obecna, należy ją odessać przed kontynuacją. Pozostała woda może reagować z wiązaniami podwójnymi kwasów tłuszczowych, jednak bardzo niewielka jej ilość powinna odparować wraz z rozpuszczalnikami podczas suszenia próbek. Wszystkie próbki należy wysuszyć do całkowitego odparowania za pomocą aparatu do odparowywania próżniowego.

Szczelnie zakręć probówki i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Dzień trzeci, saponifikacja i metylacja. Najpierw włącz łaźnie wodne. Sprawdź poziom wody i ustaw łaźnię pierwszą na 95 °C, a łaźnię drugą na 80 °C. Używając repipety, dodaj 1 ml odczynnika do saponifikacji, Odczynnik 1, do wysuszonych lipidów.

Mocno zakręć nakrętki, krótko wymieszaj w wirówce typu vortex i umieść probówki w statywie. Po wykonaniu tego kroku umieść statyw z probówkami w kąpieli wodnej o temperaturze 95°C na pięć minut. Wyjmij statyw z kąpieli i sprawdź, czy probówki nie przeciekają.

Będzie to widoczne w postaci pęcherzyków unoszących się w probówce, przypominających pianę. Ponownie dokręć lub wymień nakrętki w nieszczelnych probówkach. Kontynuuj ogrzewanie probówek w kąpieli wodnej przez kolejne 10 minut.

Obniż temperaturę kąpieli wodnej do 80 °C i kontynuuj inkubację przez kolejne 15 minut. Wyjmij probówki i schłodź je, umieszczając statyw w kuwecie z wodą z kranu. Nie używaj wody z lodem.

Po ostygnięciu próbek należy dodać do każdej z nich dwa mililitry odczynnika do metylacji, Reagent 2. Ponownie szczelnie zakręcić probówki i wymieszać w wirówce typu vortex przez 5 do 10 sekund. W roztworze mogą pojawić się widoczne ziarniste sole w formie osadu, co zdarza się niekiedy z powodu nadmiaru odczynników.

Umieść statyw w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C i inkubuj przez 10 minut. Wyjmij statyw z probówkami z łaźni wodnej i umieść go w kuwecie z wodą z kranu w celu schłodzenia. Potrząśnij statywem, aby przyspieszyć proces chłodzenia.

Używając repipety, dodaj po 1,25 milliliters heksanu i metylu tercjowo-butylowego eteru, Odczynnik 3, do każdej probówki w celu ekstrakcji fazy. Szczelnie zakręć nakrętki i umieść probówki na shakerze na 10 minutes. Po wytrząsaniu pozostaw statyw z probówkami na 10 minutes, aby fazy mogły się rozdzielić.

Przenieś fazę organiczną, która znajduje się obecnie w górnej warstwie, do krótkiej szklanej probówki za pomocą pipety Pasteura. Należy dążyć do odzyskania jak największej ilości cieczy. Bardzo niewielkie ilości fazy wodnej nie wpłyną negatywnie na ekstrakcję.

Powtórz ekstrakcję w fazie wodnej poprzez dodanie Odczynnika 3, wstrząśnięcie, odczekanie do rozdzielenia się faz i przeniesienie górnej fazy. W zależności od stanu fazy dolnej czynność tę można powtórzyć jeszcze raz, aby uzyskać łącznie trzy transfery. Do ekstraktów w krótkich probówkach dodaj 3 milliliter przemywania zasadowego, Odczynnika 4, który jest rozcieńczonym roztworem wodorotlenku sodu.

Szczelnie zakręć probówki, wymieszaj w wstrząsarze vortex przez 20 do 30 sekund, a następnie wiruj przez trzy minuty przy 2 000 RPM. Po wirowaniu, używając czystej pipety Pasteura, odessij górną fazę organiczną i przenieś ją do czteromililitrowej fiolki bursztynowej. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie odessać fazy wodnej.

Kolejnym krokiem jest odparowanie rozpuszczalnika do suchości w aparaturze do odparowywania próżniowego. Dzień czwarty: przygotowanie ekstraktów do analizy GC. Za pomocą pipetora dodaj 100 µL Odczynnika 3 do każdej z fiolek 4 ml zawierających wysuszoną fazę.

Wymieszaj próbkę na wirówce laboratoryjnej, a następnie pozostaw ją na 10 minut. Używając drugiej pipety, ostrożnie przenieś zawiesinę FAME do fiolki do GC. Do fiolki o pojemności czterech mililitrów dodaj kolejną porcję rozpuszczalnika i krótko wymieszaj na wirówce.

Przetocz fiolkę, aby upewnić się, że pozostałe na jej ściankach FAME zostały rozpuszczone. Używając ponownie drugiej pipety, przenieś rozpuszczalnik do fiolki do GC. Zakończ proces przenoszenia, dodając do fiolki trzecią porcję rozpuszczalnika, mieszając na wirówce typu vortex, a następnie przenosząc zawartość do fiolki do GC.

Zakręć fiolkę do GC i przechowuj w zamrażarce. Przed analizą przechowuj szczelnie zamknięte fiolki do GC w zamrażarce. Analiza GC.

Aby korzystać z tego systemu, analiza musi być przeprowadzona przy użyciu specyficznej kolumny GC. Chromatograf gazowy jest wyposażony w wtryskiwacz typu split/splitless z szklanym linerem o średnicy wewnętrznej 4 mm, zawierającym dezaktywowaną wkładkę z wełny szklanej. Wtryskiwacz jest ustawiony na 250 °C i pracuje w trybie stałego ciśnienia.

Gazem nośnym jest wodór. Azot i powietrze są wymagane jako gazy wspomagające detektor. Użyto kolumny Agilent Ultra 2.

Kolumna ma długość 25 metrów, średnicę wewnętrzną 2 milimetrów oraz grubość filmu fazy stacjonarnej 33 mikrometrów. Faza stacjonarna w tej kolumnie to 5% fenylu i 95% metylopolisiloksanu, znana również jako kolumna typu DB-5. W celu analizy ekstraktów lipidowych wstrzykuje się alikwot o objętości dwóch mikrolitrów przy stosunku podziału 100:1 i temperaturze pieca 170 stopni C. Po wtrysku temperatura pieca jest programowana na wzrost o pięć stopni na minutę do 300 stopni C, a następnie utrzymywana przez 12 minut.

Wykonuje się serię wstrzyknięć zgodnie ze standardem MIDI, a uzyskane wyniki służą do wprowadzenia korekt zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku MIDI. Po przeprowadzeniu kalibracji w ten sposób system może wymagać sporadycznych drobnych korekt, lecz zazwyczaj powinien zapewniać dobre wyniki przy zastosowaniu tych parametrów. System MIDI generuje raport dla każdej próbki, który zawiera tabelę z jednym wierszem dla każdego zidentyfikowanego piku.

Oprogramowanie podaje czas retencji piku, pole piku, identyfikację piku, a także ECL lub szacowaną długość łańcucha (parametr wykorzystywany do identyfikacji piku) oraz współczynnik odpowiedzi (parametr służący do normalizacji wariancji i odpowiedzi detektora w odniesieniu do czasu retencji). ECL określa miejsce elucji każdego nieznanego FAME w serii FAME o prostych łańcuchach. Na przykład, jeśli czas retencji nieznanego związku wypada w połowie między czasami retencji łańcuchów 12 i 13 węglowych, ECL jest raportowany jako łańcuch 12,5 węglowy.

Oprogramowanie porównuje ECL każdego piku z wartościami FAME w bazie danych i w przypadku dopasowania przypisuje odpowiadającą im nazwę do nieznanego związku. W sytuacjach, gdy dwa FAME w bazie danych mają bardzo zbliżone wartości ECL, oprogramowanie podaje obie nazwy, wymieniając w pierwszej kolejności tę najbliższą. Tabele danych z raportów można zebrać w arkuszu kalkulacyjnym lub bazie danych.

Po skorygowaniu o współczynnik odpowiedzi, powierzchnie pików można porównać z powierzchnią piku standardu zewnętrznego lub wewnętrznego, aby wyznaczyć stężenie ekstraktu. Poprzez podzielenie przez masę ekstrahowanej gleby, dane można wyrazić jako masę FAME na gram gleby lub, wykorzystując dodatkowo masę cząsteczkową każdego FAME, jako nanomole na gram gleby. Następnie można zsumować FAME będące biomarkerami, aby uzyskać biomasę grup mikrobiologicznych, a następnie poddać te grupy dalszej analizie.

Na przykład widzimy tutaj, że nienawożone prerie wykazują większą biomasę FAME niż prerie nawożone. W obu przypadkach biomasa jest większa niż na pobliskich polach kukurydzy. Ponadto FAME są powiązane z konkretnymi grupami funkcjonalnymi, takimi jak grzyby lub bakterie.

Powiązania te są specyficzne dla danego ekosystemu, dlatego ważne jest, aby nie wyciągać z nich zbyt ogólnych wniosków. Ten rodzaj analizy pokazuje, czy określone grupy są bardziej liczne w konkretnych środowiskach. W tym przypadku grzyby występują w większej liczbie na nienawożonej prerii niż na polu kukurydzy.

I na koniec, innym sposobem analizy ogólnego składu społeczności mikrobiologicznej jest porównanie względnej obfitości wszystkich FAME jednocześnie przy użyciu metod ordynacji, takich jak niemetryczne skalowanie wielowymiarowe (NMDS) lub analiza głównych składowych (PCA). W ordynacji społeczności mikrobiologiczne, które są bardziej podobne, znajdują się bliżej siebie. Zatem, na podstawie naszych przykładowych danych, kukurydza i nienawożony preriowy obszar trawiasty są od siebie bardzo oddalone, podczas gdy niektóre próbki z nawożonego obszaru preriowego posiadają społeczności mikrobiologiczne przypominające te z kukurydzy, a inne przypominają obszar preriowy nienawożony.

Społeczności drobnoustrojów są często bardzo zmienne nawet w obrębie jednego środowiska, w związku z czym nie zawsze dają się wyraźnie rozdzielić. Po obejrzeniu tego filmu widz powinien mieć dobrą wiedzę na temat procesu ekstrakcji biomarkerów lipidowych z błon komórkowych mikroorganizmów z gleby. Ekstrakcja fosfolipidowych kwasów tłuszczowych jest skutecznym, szybkim i niedrogim sposobem oceny grup funkcjonalnych drobnoustrojów oraz całkowitej biomasy mikrobowej poprzez identyfikację unikalnych biomarkerów mikrobiologicznych.