Name: Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Poznaj frakcjonowaną ekstrakcję MTBE do analizy lipidów, metabolitów i białek z jednej próbki tkanki Arabidopsis. Ta metoda umożliwia kompleksowe badania multiomikowe w biologii systemów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.S. jest wspierany przez pełne stypendium doktoranckie z programu GERLS-DAAD. Dziękujemy dr. Andrzejowi Wiszniewskiemu za korektę i komentarz do manuskryptu. Jesteśmy bardzo wdzięczni wszystkim członkom laboratorium Giavalisco w Instytucie Molekularnej Fizjologii Roślin im. Maxa Plancka w Golm w Niemczech za ich pomoc.

Uwaga: Metanol (MeOH) i eter metylowo-tert-butylowy (MTBE), używane podczas ekstrakcji, są łatwopalne i mogą mieć, przy długotrwałym narażeniu i/lub kontakcie, podrażnienie dróg oddechowych, oczu lub skóry. Należy obchodzić się z nimi ostrożnie tylko w dygestoriach i stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa podczas ekstrakcji (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, rękawice itp.). Ciekły azot i suchy lód, stosowane w kilku etapach tego protokołu, mogą powodować poważne oparzenia przy długotrwałym kontakcie ze skórą. Należy obchodzić się z nimi ostrożnie, nosząc rękawice i okulary ochronne. Użytkownicy mogą używać różnych chemikaliów, odczynników lub wewnętrznych wzorców do analizy próbek, z których niektóre mogą być toksyczne. Prosimy o zapoznanie się z odpowiednimi kartami charakterystyki chemicznej dla wszystkich użytych materiałów.
1. Pobieranie i pobieranie próbek biologicznych
<ol>
	<li>Przygotuj oznakowane probówki do zbioru. 
	UWAGA: Tutaj należy pobrać próbki biologiczne w oznakowanych, okrągłodennych probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamkiem, zawierających dwie metalowe kulki o średnicy 5 mm do homogenizatora tkanek.</li>
	<li>Przygotuj napełniony dewara ciekłym azotem.</li>
	<li>Zbierz próbkę biologiczną i błyskawicznie zamroź tkankę w ciekłym azocie. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, w ciągu kilku sekund, aby uniknąć zmian metabolicznych wywołanych zranieniem. 
	Uwaga: Do celów demonstracyjnych użyj liści rozety z 30-dniowej parówki pospolitej (Col-0) typu dzikiego (Col-0) uprawianej na glebie w warunkach długiego dnia.</li>
	<li>Pobrane próbki należy przechowywać w suchym lodzie przez krótkie przerwy lub przechowywać je w temperaturze -80 °C przez dłuższy czas.</li>
</ol>
2. Mielenie i niszczenie tkanek
<ol>
	<li>Schłodzić wstępnie uchwyty probówek homogenizatora tkankowego w ciekłym azocie przez co najmniej 10 minut. Jeśli homogenizator tkankowy nie jest dostępny, użyj czystych i wstępnie schłodzonych moździerzy i tłuczków.</li>
	<li>Pobrać próbki z zamrażarki z ciekłym azotem, suchym lodem lub w temperaturze -80 °C i umieścić je w wstępnie schłodzonych uchwytach probówek.</li>
	<li>Szybko umieść uchwyty probówek w homogenizatorze tkankowym.</li>
	<li>Zmiel materiał biologiczny na drobny i jednorodny proszek. Użyj 20 Hz przez 1 minutę dla liści. 
	Nuta; Czas i szybkość homogenizacji mogą się różnić w zależności od tkanki, należy upewnić się, że próbka jest homogenizowana do drobnego proszku i że proszek ten jest zamrożony na każdym etapie homogenizacji.</li>
	<li>Pobrać próbki biologiczne z uchwytów probówek i przechowywać je w stanie zamrożonym do czasu dalszej ekstrakcji.</li>
</ol>
3. Ważenie tkanek
<ol>
	<li>Użyć wagi analitycznej z wystarczającą precyzją dla wymaganych ilości próbki.</li>
	<li>Przygotować oznakowaną probówkę wirówkową z okrągłym dnem o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamkiem.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić probówki i szpatułki w ciekłym azocie.</li>
	<li>Porcję potrzebnej ilości sproszkowanej tkanki umieścić w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamknięciem. 
	Ostrzeżenie: Należy unikać rozmrażania materiału roślinnego, minimalizując czas potrzebny na zważenie próbek.</li>
	<li>Podane próbki należy natychmiast po zważeniu umieścić w ciekłym azocie.</li>
	<li>Dla każdej próbki należy zanotować dokładną masę. Stosuj 10-50 mg ± 10% dla większości tkanek roślinnych.</li>
	<li>Przechowywać podane próbki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej ekstrakcji.</li>
</ol>
4. Konfiguracja odczynnika
<ol>
	<li>Użyć mieszaniny ekstrakcyjnej eteru metylowo-tert-butylowego (MTBE)/ metanolu (MeOH).
	<ol>
		<li>W celu przygotowania 100 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego dodać 75 ml MTBE do 25 ml MeOH, aby uzyskać mieszaninę MTBE: MeOH (3:1, obj./obj.).</li>
		<li>Dodawanie wewnętrznych standardów normalizacji po analizie zgodnie z potrzebami analitycznymi. Zazwyczaj dodaje się 50 μl 1,2-diheptadecanoilo-sn-glycero-3-fosfocholiny (1 mg/ml w chloroformie) jako wzorzec wewnętrzny do analizy lipidów na podstawie UPLC-MS, dodając jednocześnie 50 μl sorbitolu 13C (1 mg/ml w wodzie) jako wzorce wewnętrzne do analizy pierwotnych metabolitów opartej na GC-MS. Wzorce wewnętrzne do analizy metabolitów na podstawie UPLC-MS to 50 μl kortykosteronu (1 mg/ml w metanolu) i 25 μl ampicyliny (1 mg/ml w metanolu).</li>
		<li>Przenieść rozpuszczalnik do czystej szklanej butelki, która została przepłukana mieszaniną MTBE: MeOH.</li>
		<li>Mieszaninę ekstrakcyjną należy przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Nie przechowuj mieszaniny ekstrakcyjnej przez dłuższy czas, aby zachować powtarzalne wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wywołać separację faz, użyj wody (H2O)/ metanolu (MeOH).
	<ol>
		<li>Do przygotowania 100 ml H2O: MeOH dodaj 75 ml H2O do 25 ml MeOH, aby uzyskać H2O: MeOH (3:1, obj. / obj.).</li>
		<li>Przenieść rozpuszczalnik do czystej szklanej butelki, która została przepłukana mieszaninąH2O: MeOH. Rozpuszczalnik ten można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Mieszaninę ekstrakcyjną (MTBE: MeOH, 3:1, obj./obj.) należy schłodzić do temperatury -20 °C za pomocą systemu chłodzenia cieczą lub zamrażarki o temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wyjąć podane próbki jedna po drugiej i dodać 1 ml wstępnie schłodzonej mieszaniny ekstrakcyjnej do każdej probówki z próbką. Uwaga: Wykonaj ten krok szybko ze względu na niską lepkość MTBE.</li>
	<li>Natychmiast wymieszać w mieszalniku wirowym, aż tkanka będzie dobrze homogenizowana w mieszaninie ekstrakcyjnej. 
	UWAGA: Ten krok jest bardzo ważny, ponieważ jest wymagany do wytrącenia białek i dezaktywacji ich aktywności enzymatycznej.</li>
	<li>Inkubować wszystkie próbki na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 45 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Sonikować próbki przez 15 minut w kąpieli sonizacyjnej chłodzonej lodem.</li>
</ol>
6. Frakcjonowanie przez separację faz
<ol>
	<li>Dodać 650 μlH2O: MeOH (3:1, obj./obj.) do każdej probówki z próbką.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj, wirując przez 1 minutę.</li>
	<li>Odwirować próbki z prędkością 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Po tym kroku na dnie rurki znajdują się dwie niemieszające się fazy ciekłe ze stałym osadem. 
	Ostrzeżenie: Z rurkami należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć zmieszania dwóch faz ciekłych i nie zakłócić wytrąconego osadu.</li>
</ol>
7. Podział frakcji polarnych i hydrofobowych
<ol>
	<li>Przenieść 500 μl rozpuszczalnika z górnej, zawierającej lipidy, fazy do znakowanej 1,5 ml probówki mikrowirówkowej. 
	UWAGA: Podane próbki lipidów mogą być bezpośrednio zagęszczone do natychmiastowej analizy UPLC-MS (krok 8.1) lub przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Po usunięciu 500 μl z próbki należy usunąć pozostałą fazę lipidową za pomocą pipety o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Przenieść 400 μl rozpuszczalnika z dolnej fazy (metabolity polarne i półpolarne) do znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Podane próbki polarne mogą być bezpośrednio zagęszczane do natychmiastowej analizy UPLC-MS (etap 8.2) lub przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Weź dodatkową podwielokrotność 200 μl, aby przeprowadzić dodatkową analizę, np. analizę metabolitów opartą na chromatografii gazowej, zgodnie z opisem Preciously16.</li>
	<li>Usunąć pozostałą część fazy wodnej, odpipetowując nadmiar objętości.</li>
	<li>Otrzymane białko, skrobię, osad ściany komórkowej przemyć 500 μl metanolu, dokładnie wirując go przez 1 min.</li>
	<li>Odwirować próbki z prędkością 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Wykonaj ekstrakcję i trawienie białka (krok 11) lub analizę skrobi/ściany komórkowej zgodnie z wcześniejszym opisem16. 
	UWAGA: Jeśli nie zostaną natychmiast wykorzystane, granulki te można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
8. Koncentracja i przechowywanie frakcji
<ol>
	<li>Odparować rozpuszczalnik z próbek lipidów (od kroku 7.1) w koncentratorze próżniowym bez ogrzewania (przez 1-2 godziny) lub najlepiej użyć parownika przepływowego azotu, aby uniknąć modyfikacji oksydacyjnej lipidów. 
	UWAGA: Wysuszone próbki należy natychmiast przeanalizować. Do przechowywania należy pozostawić próbki w roztworze MTBE, najlepiej w szklanych fiolkach (etap 7.1).</li>
	<li>Odparować rozpuszczalnik z próbek wodnych (z etapu 7.3 lub 7.4) przez noc w koncentratorze próżniowym bez podgrzewania. UWAGA: wysuszone próbki mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C przed analizą.</li>
</ol>
9. Analiza lipidów za pomocą UPLC-MS24
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić wysuszone frakcje lipidowe (z kroku 8.1) w 400 μl acetonitrylu: 2-propanolu (7:3, obj./obj.).</li>
	<li>Przenieść wystarczającą ilość płynu do szklanych fiolek i szczelnie zakręcić.</li>
	<li>Umieścić szklane fiolki w schłodzonym podajniku próbek (4 °C).</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl na próbkę i oddzielić lipidy w kolumnie C8 z odwróconą fazą (RP) utrzymywaną w temperaturze 60 °C przy użyciu systemu UPLC pracującego z natężeniem przepływu 400 μl/min.</li>
	<li>Do rozdzielania chromatograficznego należy użyć faz ruchomych opisanych w tabeli 1.</li>
	<li>Uzyskać widma masowe w trybie jonizacji dodatniej i ujemnej za pomocą odpowiedniego przyrządu MS obejmującego zakres mas od 150 do 1,500 m/z.</li>
</ol>
10. Analiza metabolitów polarnych i półpolarnych za pomocą UPLC-MS25.
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić fazę polarną (od kroku 8.2) w 200 μl metanolu klasy UPLC: woda (1:1, obj./obj.).</li>
	<li>Przenieść wystarczającą ilość płynu do szklanych fiolek i szczelnie zakręcić.</li>
	<li>Umieścić szklane fiolki w schłodzonym podajniku próbek (4 °C).</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl z każdej próbki i oddzielić metabolity w kolumnie RP C18 utrzymywanej w temperaturze 40 °C przy użyciu systemu UPLC pracującego z natężeniem przepływu 400 μl/min.</li>
	<li>Do rozdzielania chromatograficznego wykorzystuje się fazy ruchome o parametrach podanych w tabeli 2.</li>
	<li>Uzyskaj pełne widma masowe skanowania w trybie jonizacji dodatniej i ujemnej za pomocą odpowiedniego spektrometru mas obejmującego zakres mas od 50 do 1 500 m/z.</li>
</ol>
11. Ekstrakcja, trawienie i analiza białek16
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić przemyty osad białka/skrobi/ściany komórkowej (od kroku 7.8) w 200 μl wybranego buforu do ekstrakcji białek. Uwaga: Używamy buforu mocznikowego/tiomocznikowego (5 M mocznika, 2 mM tiomocznika, 15 mM DTT, 2% CHAPS oraz inhibitory proteazy i fosfatazy)27.</li>
	<li>Sonikować próbki przez 10 minut w chłodzonej lodem kąpieli sonicznej.</li>
	<li>Inkubować próbki przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować rozpuszczone białka w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Zebrać supernatant białkowy do nowej probówki.</li>
	<li>Określ stężenie białka z zebranego supernatantu28.</li>
	<li>Trawić 50 μg białka w roztworze według wybranego protokołu. Zazwyczaj należy stosować mieszankę Trypsyny/Lys-C zgodnie z instrukcją obsługi.</li>
	<li>Po mineralizacji należy przeprowadzić odsalanie peptydów przed spektrometrią mas za pomocą końcówek stopnia C18 i wymyć strawione peptydy 29.</li>
	<li>Zagęścić próbki do temperatury bliskiej suchości w koncentratorze próżniowym bez podgrzewania.</li>
	<li>Ponownie zawiesić próbki w odpowiednim buforze ładującym (np. 5% acetonitrylu, 0,5% kwasu mrówkowego) i przeanalizować mieszaniny peptydów za pomocą LC-MS/MS przy użyciu spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości podłączonego do systemu nano LC. 
	UWAGA: W przykładowym zestawie danych proteomicznych przedstawionym w tym protokole zastosowaliśmy gradient opisany w Tabeli 3.</li>
	<li>Ustaw spektrometr mas, stosując strategię 15 najlepszych, w której po jednym pełnym skanowaniu (FS) następowało do 15 skanów MS/MS zależnych od danych, na następujące parametry: FS mieścił się w zakresie mas 200 - 2 000 m/z przy rozdzielczości 70 000 z wartością docelową 3x106 jonów. Uzyskaj zależne od danych skany MS/MS za pomocą dysocjacji kolizyjnej o wyższej energii (HCD). Ustaw wartości docelowe dla MS/MS na 1e5 jonów, z maksymalnym czasem napełniania jonami 50 ms, oknem izolacyjnym 4,0 m/z, znormalizowaną energią zderzenia (NCE) wynoszącą 30% i współczynnikiem niedopełnienia wynoszącym 1%. Zmierz jony MS/MS w rozdzielczości 17.500, a wyłączenie dynamiczne zostało ustawione na 60 s.</li>
</ol>

<ol><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> J Physiol. 117 (4), 500-544 (1952).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Yang, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+genomics+and+systems+biology+research+lead+to+systems+genomics+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The emerging genomics and systems biology research lead to systems genomics studies.</a> BMC Genomics. 15, Suppl 11 1(2014).</li>
<li>Sheth, B. P., Thaker, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+systems+biology%3A+insights%2C+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plant systems biology: insights, advances and challenges.</a> Planta. 240 (1), 33-54 (2014).</li>
<li>Ideker, T., Galitski, T., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+decoding+life%3A+Systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genom+Hum+G%22%5BJournal%5D)">A new approach to decoding life: Systems biology.</a> Annu Rev Genom Hum G. 2, 343-372 (2001).</li>
<li>Somvanshi, P. R., Venkatesh, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conceptual+review+on+systems+biology+in+health+and+diseases%3A+from+biological+networks+to+modern+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Syst+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">A conceptual review on systems biology in health and diseases: from biological networks to modern therapeutics.</a> Syst Synth Biol. 8 (1), 99-116 (2014).</li>
<li>Oliver, S. G., Winson, M. K., Kell, D. B., Baganz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the yeast genome.</a> Trends Biotechnol. 16 (9), 373-378 (1998).</li>
<li>Tweeddale, H., Notley-McRobb, L., Ferenci, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+slow+growth+on+metabolism+of+Escherichia+coli%2C+as+revealed+by+global+metabolite+pool+%28%22metabolome%22%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool ("metabolome") analysis.</a> J Bacteriol. 180 (19), 5109-5116 (1998).</li>
<li>Kim, H. K., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+plant+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+analysis+%3A+PCA%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for plant metabolomics.</a> Phytochemical analysis : PCA. 21 (1), 4-13 (2010).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+for+the+Isolation+and+Purification+of+Total+Lipides+from+Animal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Weckwerth, W., Wenzel, K., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+for+the+integrated+extraction%2C+identification+and+quantification+of+metabolites%2C+proteins+and+RNA+to+reveal+their+co-regulation+in+biochemical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Process for the integrated extraction, identification and quantification of metabolites, proteins and RNA to reveal their co-regulation in biochemical networks.</a> Proteomics. 4 (1), 78-83 (2004).</li>
<li>Wienkoop, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+metabolomic+and+proteomic+phenotypes%3A+analysis+of+data+covariance+dissects+starch+and+RFO+metabolism+from+low+and+high+temperature+compensation+response+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Integration of metabolomic and proteomic phenotypes: analysis of data covariance dissects starch and RFO metabolism from low and high temperature compensation response in Arabidopsis thaliana.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1725-1736 (2008).</li>
<li>Valledor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+protocol+for+the+combined+isolation+of+metabolites%2C+DNA%2C+long+RNAs%2C+small+RNAs%2C+and+proteins+from+plants+and+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A universal protocol for the combined isolation of metabolites, DNA, long RNAs, small RNAs, and proteins from plants and microorganisms.</a> Plant J. 79 (1), 173-180 (2014).</li>
<li>Nakayasu, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPLEx%3A+a+Robust+and+Universal+Protocol+for+Single-Sample+Integrative+Proteomic%2C+Metabolomic%2C+and+Lipidomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses.</a> mSystems. 1 (3), (2016).</li>
<li>Alfonsi, K., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2008/GC/b711717e#!divAbstract">Green chemistry tools to influence a medicinal chemistry and research chemistry based organisation.</a> Green Chem. 10 (1), 31-36 (2008).</li>
<li>Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+a+fast%2C+comprehensive+and+reproducible+one-step+extraction+method+for+the+rapid+preparation+of+polar+and+semi-polar+metabolites%2C+lipids%2C+proteins%2C+starch+and+cell+wall+polymers+from+a+single+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample.</a> Plant Methods. 12, 45(2016).</li>
<li>Hemme, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-wide+analysis+of+acclimation+responses+to+long-term+heat+stress+and+recovery+in+the+photosynthetic+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).</li>
<li>Sharma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s10811-014-0407-2">UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles.</a> J Appl Phycol. 27 (3), 1149-1159 (2015).</li>
<li>Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li>
<li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+evolution+of+brain+lipidome+revealed+by+large-scale+analysis+of+human%2C+chimpanzee%2C+macaque%2C+and+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues.</a> Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).</li>
<li>Khrameeva, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neanderthal+ancestry+drives+evolution+of+lipid+catabolism+in+contemporary+Europeans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans.</a> Nat Commun. 5, 3584(2014).</li>
<li>Bozek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exceptional+evolutionary+divergence+of+human+muscle+and+brain+metabolomes+parallels+human+cognitive+and+physical+uniqueness%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness.</a> PLoS Biol. 12 (5), 1001871(2014).</li>
<li>Krueger, S., Steinhauser, D., Lisec, J., Giavalisco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+subcellular+metabolite+distributions+within+Arabidopsis+thaliana+leaf+tissue%3A+a+primer+for+subcellular+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of subcellular metabolite distributions within Arabidopsis thaliana leaf tissue: a primer for subcellular metabolomics.</a> Methods Mol Biol. 1062, 575-596 (2014).</li>
<li>Hummel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatography+and+high+resolution+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+plant+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22FrontPlant+Sci%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids.</a> FrontPlant Sci. 2, 54(2011).</li>
<li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+formula+annotation+of+polar+and+lipophilic+metabolites+using+%2813%29+C%2C+%2815%29+N+and+%2834%29+S+isotope+labelling%2C+in+combination+with+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> Plant J. 68 (2), 364-376 (2011).</li>
<li>Caldana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+analysis+of+inducible+target+of+rapamycin+mutants+reveal+a+general+metabolic+switch+controlling+growth+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 73 (6), 897-909 (2013).</li>
<li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+by+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation-time+of+flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry.</a> Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Spagou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+coupled+to+MS+for+metabonomic%2Fmetabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies.</a> J Sep Sci. 33 (6-7), 716-727 (2010).</li>
<li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li>
<li>Avin-Wittenberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+the+role+of+autophagy+in+cellular+metabolism+and+energy+homeostasis+in+Arabidopsis+seedlings+under+carbon+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation.</a> Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).</li>
<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+dissection+of+spatiotemporal+metabolic+shifts+in+primary%2C+secondary%2C+and+lipid+metabolism+during+developmental+senescence+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis.</a> Plant physiol. 162 (3), 1290-1310 (2013).</li>
<li>Lambers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteaceae+from+severely+phosphorus-impoverished+soils+extensively+replace+phospholipids+with+galactolipids+and+sulfolipids+during+leaf+development+to+achieve+a+high+photosynthetic+phosphorus-use-efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency.</a> New Phytol. 196 (4), 1098-1108 (2012).</li>
<li>Degenkolbe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+remodeling+of+the+lipidome+during+cold+acclimation+in+natural+accessions+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 70, 972-982 (2012).</li>
<li>Bromke, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography+high-resolution+mass+spectrometry+for+fatty+acid+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling.</a> Plant J. 81 (3), 529-536 (2015).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAX1%2C+a+novel+membrane+protein+mediating+plastid+fatty+acid+export%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export.</a> PLoS Biol. 13 (2), 1002053(2015).</li>
<li>Kueger, S., Steinhauser, D., Willmitzer, L., Giavalisco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+plant+metabolomics%3A+from+mass+spectral+features+to+metabolites+and+from+whole-cell+analysis+to+subcellular+metabolite+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-resolution plant metabolomics: from mass spectral features to metabolites and from whole-cell analysis to subcellular metabolite distributions.</a> Plant J. 70 (1), 39-50 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

W tym artykule opisujemy i ilustrujemy prosty i wysoce przydatny protokół ekstrakcji do kompleksowej analizy lipidomicznej, metabolomicznej i proteomicznej z pojedynczej próbki liści o sile 50 mg. Metoda ta była wcześniej stosowana w kilku badaniach, które zostały opublikowane w różnych artykułach 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,31,32,33,34,35,36 ,37i udowodnione, że oprócz prostego przepływu pracy i wysokiej możliwości zastosowania są solidne i powtarzalne.
Przedstawione tutaj aplikacje pokazują niektóre rutynowe metody wstępnego badania przesiewowego złożonej próbki biologicznej. Te ilustrowane zestawy danych metabolomicznych i lipidomicznych na dużą skalę mogą dostarczyć wyczerpujących informacji na temat szerokich lub specyficznych zmian w metabolizmie analizowanego systemu biologicznego, podczas gdy dane uzyskane z analizy białek dostarczają wglądu w ilościowe (obfitość) i jakościowe (modyfikacje) zmiany enzymów, białek strukturalnych lub czynników transkrypcyjnych (TF) kontrolujących funkcje komórkowe i maszynerię. W związku z tym dane z zakresu integracji omicznej mogą potencjalnie ujawnić wstępne informacje na temat możliwych zmian wywołanych przez genetyczne lub biotyczne i/lub abiotyczne perturbacje systemu biologicznego, poprzez wyjaśnienie zmian molekularnych różnych cząsteczek związanych z określonymi szlakami metabolicznymi lub procesami komórkowymi.
Oczywiście, w dłuższej perspektywie, dla udanej analizy biologii systemowej, bardzo ważne jest, aby zmaksymalizować liczbę analizowanych i opisywanych jednostek molekularnych, co pozwala na jak najpełniejsze monitorowanie funkcji i aktywności komórek. W tym celu otrzymane frakcje mogą być dodatkowo stosowane w różnych metodach analitycznych, ukierunkowanych na kolejne związki lub klasy związków (ryc. 4).
To powiedziawszy, należy wspomnieć, że globalna strategia analizy uzyskanych danych może być realizowana przez dwie różne strategie: z jednej strony kładziemy nacisk na wyjaśnienie funkcji komórkowych poprzez kwantyfikację znanych związków. Z drugiej strony, wiele z mierzonych metabolitów i lipidów nie jest jeszcze znanych ani opisanych. Te, jeszcze nieopatrzone adnotacjami, złożone pomiary zawierają również wiele istotnych informacji, które mogą być wykorzystane przez metody statystyczne do klasyfikacji lub dyskryminacji między grupami lub terapiami 20,21,22.
Mimo to te nieznane związki, zwłaszcza te istotne dla klasyfikacji grupowej lub służące jako biomarkery, muszą zostać zidentyfikowane. Ten proces identyfikacji jest niestety dość żmudny i nie można go osiągnąć bez dodatkowych pomiarów analitycznychlub strategii 38. Jak widać na rysunku 4, liczba związków bez adnotacji jest dość duża (w rzeczywistości jest to zdecydowana większość). Niemniej jednak, jak wspomniano powyżej, te piki chromatograficzne mogą być obsługiwane w ramach analizy danych, a zatem istotnie dotknięte jednostki mogą zostać wyjaśnione i poddane dalszym strategiom identyfikacji.
Podsumowując, możemy stwierdzić, że wprowadzony tutaj protokół zapewnia kilka korzyści zarówno dla biologii systemów eksperymentalnych, jak i dla klasycznych zastosowań statystycznych.
Po pierwsze, ponieważ wszystkie frakcje są ekstrahowane z jednej próbki, różnica między różnymi zestawami danych doświadczalnych (lipidy, metabolity, białka) jest znacznie zmniejszona, ponieważ każdy zestaw danych pochodzi z tej samej podwielokrotności próbki. Prowadzi to w oczywisty sposób do zwiększenia porównywalności uzyskanych wyników.
Po drugie, metoda jest łatwo skalowalna, dzięki czemu jest wysoce kompatybilna z małymi i dużymi ilościami próbek. Rutynowo używamy 10-100 mg próbek tkanek, ale udane badania lipidomiczne przeprowadzono również na zaledwie 20 nasionach Arabidopsis31. Zwłaszcza kompatybilność z małymi ilościami próbek sprawia, że metoda ta ma zastosowanie, jeśli dostępne są ograniczone ilości tkanek biologicznych lub próbek. Mimo to, nawet jeśli dostępna jest wystarczająca ilość materiału próbki, przedstawiona tutaj metoda ma tę zaletę, że pozwala na wykorzystanie tych próbek w większej liczbie powtórzeń eksperymentalnych zamiast wykorzystywania ich do różnych procedur ekstrakcji. Pozwala to na lepszą i dopracowaną analizę danych statystycznych.
Po trzecie, ponieważ metoda ta opiera się na frakcjonowaniu cząsteczek polarnych i niepolarnych cieczą, zapewnia ona, w przeciwieństwie do prostych metod ekstrakcji jednofazowej (np. ekstrakcji metanolem), istotny etap dekompleksowania w procedurze. To skuteczne odkompleksowanie próbki prowadzi do częściowego oczyszczenia poszczególnych frakcji w wyniku oddzielenia od siebie cząsteczek zakłócających działanie chemiczne. W związku z tym proces podziału chemicznego nie tylko zapewnia praktyczną korzyść w zakresie systematycznego dzielenia wyekstrahowanych próbek na różne klasy chemiczne, ale także usprawnia indywidualne pomiary analityczne, ponieważ usuwa związki zanieczyszczające z różnych frakcji. Wyraźnie możemy zaobserwować, że zwłaszcza lipidy, które są podzielone na fazę organiczną i które zwykle negatywnie wpływają na analizę chromatograficzną związków polarnych, będą prawie całkowicie nieobecne we frakcji polarnej. To samo dotyczy analizy lipidów hydrofobowych, które zostaną zubożone ze związków polarnych. Oprócz oczyszczania ze związków polarnych i niepolarnych od siebie, zubożamy i zbieramy białka i inne makrocząsteczki z próbki, co nie tylko zapewnia oddzielną frakcję, którą można wykorzystać do analizy białek, skrobi i ścian komórkowych16, ale także prowadzi do czystszej próbki w poszczególnych frakcjach. Jest to szczególnie istotne, ponieważ wiadomo, że obecność dużych makrocząsteczek prowadzi do uszkodzenia lub przynajmniej skrócenia żywotności kolumn analitycznych.
Wreszcie, opisana metoda ekstrakcji MTBE, która opiera się na mniej niebezpiecznym i korzystniejszym rozpuszczalniku zastępującymchloroform15, została już wykazana w kilku badaniach naszej grupy, że ma szerokie zastosowanie do różnych próbek biologicznych z roślin16, glonów17,18, much19, ale także kilku tkanek, narządów lub komórek ssaków20, Rozdział 21,22.

Biologia systemów, która pojawiła się w połowie ubiegłego wieku1 i została rozwinięta przez analizę na dużą skalę zestawów danych genomicznych i transkryptomicznych2,3, rozwinęła się w nowe i niezbędne podejście do analizy złożonych systemów biologicznych4,5. Głównym celem biologii systemowej jest rozszyfrowanie interakcji i zależności składowych w systemach biologicznych oraz połączenie między genotypami, ich realizacją, przemianami molekularnymi i wynikającymi z nich fenotypami. W związku z tym integracja kompleksowych zbiorów danych, uzyskanych za pomocą różnych podejść analitycznych na dużą skalę, a mianowicie genomiki, transkryptomiki, metabolomiki, lipidomiki i proteomiki, oraz ich analiza obliczeniowa stała się warunkiem wstępnym dla opisu i zrozumienia złożonych systemów biologicznych.
Opierając się na ogromnej różnorodności chemicznej i złożoności składników biologicznych w każdym systemie żywym, tworzenie dużych i kompleksowych zestawów danych 'omicznych' w dużym stopniu zależy od jakości zastosowanej metody ekstrakcji9. Oprócz jakości metody ekstrakcji ważna jest ekonomia metody; Oznacza to, że pożądane byłoby uzyskanie jak największej ilości informacji molekularnych z jak najmniejszej ilości danych wejściowych do próbki. Często ilości próbek mogą być ograniczające i dlatego wysoce pożądane jest stosowanie metody ekstrakcji, która pozwala uzyskać jak najwięcej klas molekularnych z jednej ekstrakcji danej próbki. Oznacza to, że zamiast stosować kilka specjalistycznych metod ekstrakcji do ekstrakcji różnych klas związków z różnych podwielokrotności próbki tej samej próbki, stosuje się metodę ekstrakcji sekwencyjnej, która frakcjonuje składniki molekularne pojedynczej podwielokrotności na różne frakcje molekularne.
Powszechna metoda stosowana do tych metod ekstrakcji frakcjonowanej opiera się na dwufazowej metodzie ekstrakcji lipidów od Folch et al., opracowanej w 1957 roku10. Metoda ta opiera się na podziale metabolitów polarnych i hydrofobowych chloroform: metanol/woda i miała na celu oczyszczenie i rozkompleksienie próbek w celu przeprowadzenia wysokiej jakości analizy lipidów. Wraz z ewolucją biologii systemów multiomicznych, metoda Folcha została jeszcze bardziej stopniowo ulepszona, wykorzystując ją do partycjonowania próbek białek i polarnych metabolitów oraz lipidów w metabolomice i lipidomice związków polarnych i hydrofobowych opartych na chromatografii gazowej i cieczowej, a także proteomiki opartej na chromatografii cieczowej11,12,13,14. Niestety, wszystkie te metody opierają się na metodzie ekstrakcji opartej na chloroformie, która nie tylko prowadzi do niepożądanego tworzenia się osadu białkowego jako interfazy między fazą polarną a fazą lipidową, ale jest również niepożądanym rozpuszczalnikiem z punktu widzenia zielonej chemii15,16. Jednak rozpuszczalnik eter metylowo-tert-butylowy (MTBE) przezwycięża oba te wyżej wymienione problemy i jest odpowiednim zamiennikiem chloroformu. Opierając się na tych wymaganiach, zdecydowaliśmy się na opracowanie metody ekstrakcji MTBE: metanol : na bazie wody, która spełnia wszystkie wyżej wymienione specyfikacje i dlatego funkcjonuje jako idealny punkt wyjścia do kompleksowej analizy multiomicznej16.
Ten protokół prowadzi użytkownika krok po kroku przez prosty, szybki i powtarzalny przebieg przygotowania próbki, w tym rozwiązywanie często obserwowanych problemów. Ponadto pokrótce przedstawimy przykładowe dane analityczne z lipidomiki, metabolomiki i profilowania proteomicznego opartych na ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS) na próbkach tkanek roślinnych. Mimo że podane przykłady pochodzą z 50 mg próbki tkanki liścia Arabidopsis thaliana, protokół ten został zastosowany w przypadku kilku innych próbek biologicznych i tkanek, w tym glonów17,18, insects19 oraz komórki, narządy i tkanki ssaków20,21,22. Zakres przedstawionego protokołu ekstrakcji polega na zapewnieniu jasnego i szczegółowego opisu postępowania z próbką przed ekstrakcją oraz samej procedury ekstrakcji. Mimo że podajemy trzy krótkie przykłady zastosowań analitycznych, szczegółowe informacje na temat obsługi danych przed i po analizie można uzyskać z naszych poprzednich publikacji 16,23,24,25,26.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki i wzorce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9393-5G</td><td>Wewnętrzny wzorzec metabolitów</td></tr><tr><td>Kortykosteron&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27840-500MG</td><td>Wzorzec wewnętrzny metabolitów, klasa HPLC</td></tr><tr><td>13C Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605514</td><td>Wzorzec wewnętrzny dla metabolitów, ISOTEC&reg; &nbsp; Stabilne izotopy</td></tr><tr><td>1,2-diheptadekanoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (17:0 PC)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850360P</td><td>Wewnętrzny wzorzec lipidów</td></tr><tr><td>Metanol (MeOH)&nbsp;</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>13684102</td> Woda <td>klasy ULC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Chemikalia Biosolve</td><td>23214102</td> Eter metylowo-tert-butylowy <td>klasy ULC-MS</td></tr><tr><td>(MTBE)&nbsp;</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>13890602</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina trypsyny/Lys-C klasy HPLC&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5072</td><td>Enzymatyczne trawienie białek</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balance&nbsp;</td><td>Korporacja Sartorius&nbsp;</td><td>14 557 572</td><td></td></tr><tr><td>Młynek do mielenia tkanek i młynka&nbsp;</td><td>Retsch, Młynek miksujący MM 300</td><td>20.746.0001</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek&nbsp;</td><td>Mieszalnik wirowy Sigma Aldrich</td><td>Z247464-1EA</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Vortex-Genie 2, Model G560</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator</td><td>próżniowy Prędkość skanowania Maxi Vac Alpha Parowniki</td><td>7.008.500.002</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Probówki do mikrowirówek z bezpiecznym zamkiem&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td>Służy do ekstracji próbek</td></tr><tr><td>1,5 ml probówek mikrowirówkowych Safe-lock&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>Używany do frakcji</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Eppendorf Thermomixer 5436</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator&nbsp;</td><td>USC 300&nbsp;TH</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf, model 5427R</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>system UPLC&nbsp;</td><td>System Waters Acquity UPLC (Waters, Machester, Wielka Brytania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;System MS&nbsp;</td><td>Exactive, typu Orbitrap, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Brema, Niemcy).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna C8 z odwróconą fazą (RP) z mostkiem hybrydowym etylowym (BEH) (100 mm i razy 2,1 mm zawierające 1,7 &mu; m średnica cząstek)</td><td>Waters, Machester, Wielka Brytania</td><td>186002878</td><td>Analiza lipidów</td></tr><tr><td>RP Kolumna T3 z krzemionki o wysokiej wytrzymałości (HSS) (100 mm i razy 2,1 mm zawierające 1,8 &mu; m średnica cząstek)&nbsp;</td><td>Waters, Machester, Wielka Brytania</td><td>186003539</td><td>Analiza metabolitów</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy wysokiej rozdzielczości Q ExactivePlus podłączony do systemu EASY-nLC 1000&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher, Brema, Niemcy</td><td></td><td>Analiza peptydów</td></tr></tbody></table>

prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Zrozumienie złożonych systemów biologicznych wymaga pomiaru, analizy i integracji wielu klas związków żywej komórki, zwykle określanych za pomocą pomiarów transkryptomicznych, proteomicznych, metabolomicznych i lipidomicznych. W tym protokole wprowadzamy prostą metodę odtwarzalnej ekstrakcji metabolitów, lipidów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu pojedynczej podwielokrotności na próbkę. Metoda ekstrakcji opiera się na eterze metylowo-tert-butylowym: metanol: system wodny do cieczy: ciecz podział metabolitów hydrofobowych i polarnych na dwie niemieszające się fazy wraz z wytrącaniem białek i innych makrocząsteczek w postaci stałego osadu. W związku z tym metoda ta zapewnia trzy różne frakcje o określonym składzie molekularnym, które są w pełni kompatybilne z powszechnymi technologiami "omicznymi" o wysokiej przepustowości, takimi jak chromatografia cieczowa (LC) lub chromatografia gazowa (GC) sprzężona ze spektrometrami masowymi. Mimo że metoda ta została początkowo opracowana do analizy różnych próbek tkanek roślinnych, okazała się w pełni kompatybilna z ekstrakcją i analizą próbek biologicznych z systemów tak różnych, jak glony, owady oraz tkanki i kultury komórkowe ssaków.

Kompleksowe zestawy danych multiomicznych są nieocenione dla zrozumienia złożonych systemów biologicznych. Strategia udanego eksperymentu biologicznego zazwyczaj rozpoczyna się od odpowiedniego projektu eksperymentalnego, przygotowania i przeprowadzenia doświadczenia, a następnie obejmuje pobieranie próbek, ekstrakcję, pozyskiwanie danych analitycznych, przetwarzanie danych surowych, statystyczną analizę danych, identyfikację istotnych metabolitów oraz interpretację danych biologicznych, w tym mapowanie i wizualizację szlaków (Rysunek 1).
W przedstawionym tutaj protokole ekstrakcji skupiamy się na etapach pobierania, przygotowania i ekstrakcji próbek, które zostały przedstawione na szczegółowym schemacie przepływu pracy na Rysunku 2. Do celów demonstracyjnych wybrano 50 mg tkanki liściowej Arabidopsis. Materiał ten został zebrany, zmielony i poddany ekstrakcji, a następnie przekazany do trzech przykładowych platform analitycznych UPLC-MS, dostarczając danych, które mogą być wykorzystane w celowanej i niecelowanej analizie lipidomicznej, metabolomicznej oraz proteomicznej. Rysunki 2 i 6 zawierają dodatkowo reprezentatywne zdjęcia pokazujące, jak w standardowych warunkach powinien wyglądać rozpuszczalnik ekstrakcyjny. Ponadto przedstawiono przykłady próbek zawierających nadmierne ilości wytrąconych makrocząsteczek (białek i skrobi) oraz próbek z niewłaściwą homogenizacją (Rysunek 3). Rozwiązywanie tych dwóch powszechnych problemów zostało krótko opisane na Rysunku 3, ale jest ono również szczegółowo omówione w naszej poprzedniej publikacji16.
Rysunki 4 i 5 przedstawiają przykłady trzech chromatogramów analitycznych uzyskanych z analiz lipidów, metabolitów polarnych/semipolarnych oraz białek. Lipidy, pobrane z górnej fazy MTBE (Rysunek 2), analizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) w fazie odwróconej (RP) na kolumnie C8 sprzężonej z wysokorozdzielczą spektrometrią mas. Lipidy można wykrywać przy użyciu dodatniego i ujemnego trybu jonizacji MS (Rysunek 4, górny panel)16,24.
Polarnie i półpolarnie pierwotne oraz wtórne metabolity z fazy polarnej (woda/metanol) (Rysunek 2) analizowano za pomocą UPLC-MS w odwróconej fazie (RP) na kolumnie C1825. Przedstawiona metoda, wykorzystująca chromatografię w odwróconej fazie, jest wysoce odpowiednia do analizy metabolitów półpolarnych (w szczególności metabolitów z wtórnego metabolizmu roślin), które można analizować w trybach jonizacji pozytywnej i negatywnej w MS (Rysunek 4, dolny panel)16. Bardziej hydrofilowe metabolity z tej frakcji (cukry, polarne aminokwasy itp.), które nie wykazują dobrej retencji na materiale w odwróconej fazie, mogą być analizowane za pomocą innych metod analitycznych, takich jak GC-MS16 lub chromatografia cieczowa z oddziaływaniem hydrofilowym30.
Białka, które odzyskano z osadu znajdującego się na dnie probówki do ekstrakcji (Rycina 2), poddano trawieniu w roztworze, a następnie analizowano za pomocą metody shotgun LC-MS (Rycina 5); protokół ekstrakcji skrobi oraz materiału ściany komórkowej można znaleźć w naszym poprzednio opublikowanym protokole16.
Podsumowując, w próbkach typu stosowanego w naszym przykładzie można rutynowo zidentyfikować ponad 200 gatunków lipidów, 50 adnotowanych metabolitów półpolarnych oraz kilka tysięcy białek. Dodatkowo metoda wykazała szeroką zastosowalność z użyciem różnych tkanek, organów i materiałów z hodowli komórkowych (Rysunek 6).
<img alt="Schemat procesu metabolomiki: pobieranie próbek, ekstrakcja, akwizycja danych, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ogólny schemat analizy omiki niecelowanej na dużą skalę. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu ekstrakcji metabolitów; przedstawia etapy przygotowania próbki, mieszania w wortexie i wirowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat przygotowania próbki i ekstrakcji do analizy lipidów, metabolitów i białek z jednej alikwoty próbki biologicznej. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces ekstrakcji cząstek; metoda mielenia, ponownej ekstrakcji i wirowania; schemat eksperymentu, przygotowanie próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ilustracyjne przykłady problemów często obserwowanych podczas stosowania protokołów ekstrakcji z wykorzystaniem dwufazowego rozdziału. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza spektrometrią mas; chromatogram, wykresy kołowe; profilowanie lipidów, względna liczność, identyfikacja związków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne chromatogramy lipidów i metabolitów półpolarnych z ekstraktów z liści Arabidopsis thaliana. Chromatogramy pików podstawowych dla lipidów (górny panel) i metabolitów półpolarnych (dolny panel) analizowane w trybie jonizacji pozytywnej16. Wykresy kołowe w prawym górnym rogu każdego chromatogramu przedstawiają liczbę zidentyfikowanych lipidów i metabolitów przypisanych do różnych klas chemicznych. Chl, chlorofile; DAG, diacyloglicerydy; DGDG, digalaktosyldiacyloglicerol; FA, kwasy tłuszczowe; LysoPC, lizofosfatydylocholina; MGDG, monogalaktosyldiacyloglicerol; PC, fosfatydylocholina; PE, fosfatydyloetanoloamina; PG, fosfatydyloglicerol; PI, fosfatydyloinositol; PS, fosfatydyloseryna; SP, sfingolipidy; SQDG, sulfochinowosyldiacyloglicerol; TAG, triacyloglicerydy. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig4large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres danych chromatograficznych i wykres kołowy; piki spektrometrii mas; analiza względnej obfitości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywny chromatogram pików podstawowych peptydów z ekstraktów liści Arabidopsis thaliana. 
Wykres kołowy w prawym górnym rogu wskazuje liczbę zidentyfikowanych białek przypisanych do różnych procesów biologicznych16. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces ekstrakcji tkanek roślinnych; schemat; liście, kwiaty, strąki, nasiona; analiza pigmentów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Reprezentatywne przykłady ekstrakcji z różnych typów tkanek z dzikiego typu Arabidopsis thaliana. 
Wszystkie próbki zostały ekstrahowane z 50 mg masy świeżej wskazanych tkanek. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas (min)</td>
			<td>% Bufor A do Buforu B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 do 1 min</td>
			<td>45% A </td>
			<td>Bufor A: 1% 1M octanu NH4, 0,1% kwasu octowego w wodzie klasy UPLC MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>od 1 do 4 min </td>
			<td>Gradient liniowy od 45% A do 25% A</td>
			<td>Bufor B: 1% 1M octanu NH4, 0,1% kwasu octowego w acetonitrylu/izopropanolu 7:3 (v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>od 4 do 12 min </td>
			<td>Gradient liniowy od 25% A do 11% A</td>
			<td>Przepływ 400 µL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 do 15 min </td>
			<td>Gradient liniowy od 11% A do 0% A</td>
			<td>Objętość iniekcji 2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 do 19,5 min</td>
			<td>Przemyć kolumnę przez 4,5 min przy 0% A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:50–19:51 min</td>
			<td>Ustaw z powrotem na 45% A </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19,51 do 24 min</td>
			<td>Równoważyć za pomocą 45% A </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry gradientu dla rozdziału lipidów metodą RP-UPLC. RP, faza odwrócona. UPLC, ultra-wydajna chromatografia cieczowa.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Czas (min)</td>
			<td >% Buforu A do Buforu B</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >0 do 1 min</td >
			<td >99% A</td >
			<td >Bufor A: 0.1% kwasu mrówkowego w wodzie klasy UPLC</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1 do 11 min</td >
			<td >Gradient liniowy od 99% A do 60% A</td >
			<td >Bufor B: 0.1% kwasu mrówkowego w acetonitylu klasy UPLC</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >11 do 13 min</td >
			<td >Gradient liniowy od 60% A do 30% A</td >
			<td >Przepływ 400 µL/min</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >13 do 15 min</td >
			<td >Gradient liniowy od 30% A do 1% A</td >
			<td >Objętość wtrysku 2 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >15 do 16 min</td >
			<td >Płukanie kolumny przez 1 min przy 1% A</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >16 do 17 min</td >
			<td >Gradient liniowy od 1% A do 99% A</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >17 do 20 min</td >
			<td >Równoważenie przez 3 min przy 99% A</td >
			<td ></td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Parametry gradientu dla rozdziału metabolitów polarnych i półpolarnych metodą RP-UPLC. RP, faza odwrócona. UPLC, ultra-wydajna chromatografia cieczowa.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas (min)</td>
			<td>% buforu B do buforu A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 do 5 min</td>
			<td>Gradient liniowy od 0 do 10%</td>
			<td>Bufor A: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie klasy UPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>od 5 do 80 min</td>
			<td>Gradient liniowy od 10% do 40%</td>
			<td>Bufor B: 0,1% kwasu mrówkowego w 60% acetonitrylu klasy UPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 do 85 min</td>
			<td>Gradient liniowy od 40% do 60% </td>
			<td>Przepływ 300 nL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85 do 86 min</td>
			<td>Gradient liniowy od 60% do 95% </td>
			<td>Objętość iniekcji 5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>86 do 91 min</td>
			<td>Przemywać kolumnę przez 5 min roztworem 95% </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>91 do 92 min</td>
			<td>Gradient liniowy od 95% do 0% </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>93–110 min</td>
			<td>Równoważyć kolumnę przez 17 min przy 0%</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Parametry gradientu dla rozdziału peptydów metodą nano-LC. LC, chromatografia cieczowa.

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Ogólnym celem tej metody jest odzyskanie i analiza wszystkich głównych jednostek molekularnych, w tym metabolitów polarnych i półpolarnych, lipidów oraz białek z jednej próbki, przy użyciu prostej frakcjonowanej ekstrakcji metylo-t-butyltlenkiem (MTBE). Zazwyczaj naukowcom trudno jest analizować wiele klas związków z jednej próbki. Stosując przedstawioną tutaj ekstrakcję MTBE, można wyekstrahować i przeanalizować wiele klas związków, takich jak lipidy, metabolity i białka, z jednej próbki.Główną zaletą tej techniki jest możliwość skutecznej ekstrakcji wszystkich klas związków molekularnych z niewielkiej ilości pojedynczej alikwoty próbki. Metoda ta pomaga w odpowiedzi na fundamentalne pytania w biologii systemowej, ponieważ stanowi podstawę eksperymentalną dla analiz multiomicznych, dostarczając frakcji, które mogą być wykorzystane w proteomice, lipidomice i metabolomice. Poniższy protokół został zademonstrowany na tkance liściowej Arabidopsis.Arabidopsis to małe rośliny kwitnące z rodziny kapustowatych (Brassicaceae), spokrewnione z kapustą. Procedurę należy rozpocząć od schłodzenia uchwytów probówek do homogenizatora tkanek w ciekłym azocie przez co najmniej 10 minut. Następnie należy wyjąć próbki z ciekłego azotu i umieścić je w uchwytach do probówek.Następnie wyjmij uchwyty do probówek z ciekłego azotu. Szybko umieść uchwyty w homogenizatorze do tkanek i ustaw urządzenie tak, aby zmielić materiał biologiczny na drobny i jednorodny proszek. W przypadku liści zastosuj częstotliwość 20 hertz przez jedną minutę.Czas i prędkość homogenizacji mogą się różnić w zależności od rodzaju tkanki. Należy prowadzić homogenizację do momentu, aż otrzymana próbka stanie się bardzo drobnym proszkiem. Ponadto próbka powinna pozostawać zamrożona na każdym etapie homogenizacji.Zhomogenizuj próbki, a następnie wyjmij próbki biologiczne z uchwytów do probówek. Jeśli nie będą one użyte natychmiast, umieść je w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu dalszej ekstrakcji. Oznacz cztery 2 ml okrągłodenne probówki do mikrowirówki z bezpiecznym zamknięciem numerem próbki.Wstępnie ochłodź probówki oraz kilka szpatułek, zanurzając je w ciekłym azocie. Po schłodzeniu probówek i szpatułek, umieść jedną z probówek na wadze analitycznej i za pomocą szpatułki odważ 25 mg proszku z tkanki do probówki do mikrowirówki. Zapisz dokładną wagę każdej próbki, a następnie natychmiast umieść odważone próbki w ciekłym azocie.Krok ten należy wykonać szybko, aby uniknąć rozmrożenia materiału roślinnego. Alikwoty próbek należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia dalszej ekstrakcji. W ramach przygotowań do ekstrakcji należy schłodzić w zamrażarce w temperaturze -20 °C metylotretylobutyloeter lub mieszaninę do ekstrakcji MTBE-metanol, przygotowaną zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie.Wyjmij podzielone próbki i dodaj jeden mililitr schłodzonej wcześniej mieszaniny do ekstrakcji do każdej probówki z próbką. Wykonaj ten krok szybko. MTBE ma niską lepkość i może wyciekać z końcówki pipety.Każdą próbkę należy niezwłocznie wymieszać na mieszalniku wortexowym, aż tkanka zostanie dobrze zhomogenizowana w mieszaninie do ekstrakcji. Probówki należy przechowywać w statywie na blacie, dopóki wszystkie próbki nie zostaną wyekstrahowane. Krok ten jest krytyczny.W tym etapie wytrąca się białka i inaktywuje ich aktywność enzymatyczną. Wszystkie próbki należy inkubować na wytrząsarce orbitalnej przy 100 RPM przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie próbki poddaje się sonikacji przez 15 minut w lodowatej kąpieli sonikacyjnej.Następnie, aby przeprowadzić frakcjonowanie poprzez rozdział faz, należy dodać 650 µL roztworu wody i metanolu w stosunku trzy do jednego do każdej probówki z próbką. Następnie wymieszać zawartość za pomocą wirówki vortex przez jedną minutę. Próbki odwirować z prędkością 20 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Po tym kroku należy ostrożnie obchodzić się z probówkami, aby uniknąć wymieszania dwóch faz ciekłych oraz nie naruszyć wytrąconego osadu. Na tym etapie w probówce znajdują się dwie dopuszczalne fazy ciekłe oraz ciało stałe w postaci osadu na dnie. Niepolarna faza górna zawiera lipidy.Dolna faza wodna zawiera metabolity polarne i półpolarne. Osad zawiera białka, skrobię oraz ścianę komórkową. Przenieś 500 µL rozpuszczalnika z górnej fazy zawierającej lipidy do oznakowanej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.Następnie, używając pipety 200 µL, ostrożnie usuń pozostałą fazę lipidową i ją odrzuć. Następnie przenieś 400 µL rozpuszczalnika z dolnej fazy do oznakowanej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Przenieś dodatkową alykwotę 200 µL do probówki do mikrocentryfugi w celu przeprowadzenia dalszych analiz, takich jak analiza metabolitów oparta na chromatografii gazowej.Usuń i odrzuć pozostałą część fazy wodnej, odpipetowując nadmiar objętości. Następnie, aby wyprać otrzymany osad białkowo-skrobiowo-ściankomórkowy, dodaj 500 µL metanolu, a następnie mieszaj w vortexie przez jedną minutę. Wirowarkuj próbki z prędkością 10 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Odparuj rozpuszczalnik z próbek lipidów za pomocą ewaporatora z przepływem azotu, aby uniknąć modyfikacji oksydacyjnych lipidów. Powstałe suche próbki należy przeanalizować niezwłocznie. Odparuj rozpuszczalnik z próbek wodnych przez noc w koncentratorze próżniowym bez podgrzewania.Wysuszone próbki wodne mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C przed analizą. Ponownie zawiesić wysuszone frakcje lipidowe w 400 µL roztworu acetonitrylu i 2-propanolu w stosunku 7:3. Przenieść odpowiednią ilość cieczy do szklanych fiolek i szczelnie zakręcić.Następnie umieść szklane fiolki w chłodzonym autosamplerze w temperaturze 4°C. Wstrzyknij 2 µL każdej próbki i rozdziel lipidy na kolumnie C8 w fazie odwróconej utrzymywanej w temperaturze 60°C, korzystając z systemu UPLC przy szybkości przepływu 400 µL/min. Do rozdziału chromatograficznego zastosuj fazy ruchome opisane w Tabeli 1 dołączonego dokumentu.Należy zebrać widma mas w dodatnim i ujemnym trybie jonizacji przy użyciu odpowiedniego instrumentu MS, obejmując zakres mas między 150 a 1500 stosunku ładunku do masy. Fazę polarną należy ponownie zawiesić w 200 µL roztworu metanolu i wody w stosunku jeden do jednego (klasy UPLC). Odpowiednią ilość cieczy należy przenieść do szklanych fiolek i szczelnie zakręcić.Następnie umieść fiolki szklane w schłodzonym autopróbniku w temperaturze 4 °C. Wstrzyknij 2 µL z każdej próbki i rozdziel metabolity na kolumnie RP C-18 utrzymywanej w temperaturze 40 °C przy użyciu systemu UPLC z przepływem 400 µL/min. Do rozdziału chromatograficznego zastosuj fazy ruchome o parametrach podanych w tabeli 2 dołączonego dokumentu.Należy zarejestrować pełne widma mas w trybie jonizacji dodatniej i ujemnej, korzystając z odpowiedniego spektrometru mas w zakresie stosunku masy do ładunku od 50 do 1500. Na koniec należy przeprowadzić ekstrakcję, trawienie i analizę białek, zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie. Zebrano, rozcierano i ekstrahowano 25 milligrams tkanki liścia Arabidopsis, a następnie poddano ją analizie na trzech platformach UPLC-MS.Polarne i półpolarne metabolity pierwotne oraz wtórne z fazy polarnej przeanalizowano za pomocą UPLC-MS w odwróconej fazie C-18. Chromatogramy szczytów podstawowych lipidów, przedstawione w górnym panelu, oraz metabolitów półpolarnych, przedstawione w dolnym panelu, przeanalizowano w trybie jonizacji dodatniej. Wykres kołowy w prawym górnym rogu każdego chromatogramu pokazuje liczbę zidentyfikowanych lipidów i metabolitów przypisanych do różnych klas chemicznych.Na przykład 58 różnych lipidów przypisano do grupy triacyliglicerydów, oznaczonej na górnym wykresie jako TAG. Bardziej hydrofilowe metabolity z tej frakcji, takie jak cukry i polarne aminokwasy, które nie wykazują dobrej retencji na materiale w fazie odwróconej, mogą być analizowane za pomocą innych metod analitycznych, takich jak GCMS lub cieczowa chromatografia oddziaływań hydrofilowych. Białka odzyskane z ekstrakcji poddano trawieniu w roztworze, a następnie analizowano za pomocą techniki shotgun LCMS.Wykres kołowy widoczny w prawym górnym rogu wskazuje liczbę zidentyfikowanych białek przypisanych do różnych procesów biologicznych. Na przykład 268 białek przypisano do kategorii lokalizacji. Podsumowując, z próbek takich jak ta użyta w niniejszym przykładzie, można rutynowo zidentyfikować ponad 200 gatunków lipidów, 50 adnotowanych metabolitów półpolarnych oraz kilka tysięcy białek.Dodatkowo metoda wykazała szeroką stosowalność z użyciem różnych tkanek, organów oraz materiału z hodowli komórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak ekstrahować i analizować najważniejsze związki z jednej próbki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wszystkie próbki pozostawały zamrożone, materiał został odpowiednio rozdrobniony, a użyte rozpuszczalniki i odczynniki chemiczne posiadały czystość analityczną.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać wszystkie metody analityczne w celu określenia składu molekularnego wyekstrahowanych próbek.

a-simple-fractionated-extraction-method-for-comprehensive-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy nową ilościową metodę lipidomiki służącą do identyfikacji licznych gatunków lipidów w drożdżach z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją przez elektroryś spray w trybie skanowania przeglądowego (ESI/MS). Metoda ta przewyższa obecnie dostępne metody identyfikacji i oznaczania ilościowego lipidów pod względem zdolności do rozdzielania różnych form cząsteczkowych lipidów, czułości oraz szybkości analizy.

Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Wiarygodność wyników eksperymentów metabolomicznych zależy od skuteczności i powtarzalności przygotowania próbki. Opisana jest rygorystyczna i dogłębna metoda, która umożliwia ekstrakcję metabolitów z płynów biologicznych z możliwością późniejszej analizy do tysięcy związków lub tylko klas związków będących przedmiotem zainteresowania.

Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej

Artykuł opisuje metodę, która zwiększa przepustowość, jednocześnie równoważąc wysiłek i dokładność ekstrakcji lipidów z błon komórkowych mikroorganizmów do wykorzystania w charakterystyce zarówno lipidów całkowitych, jak i względnej obfitości lipidów wskaźnikowych w celu określenia struktury społeczności mikroorganizmów glebowych w badaniach z wieloma próbkami.

Metoda ekstrakcji i analizy lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych w eksperymentach z wieloma próbkami

Przedstawiono protokół jednoczesnej ekstrakcji metabolitów, białek i lipidów z pojedynczej próbki gleby, co pozwala na skrócenie czasu przygotowania próbki i umożliwia analizy multiomiczną spektrometrią mas próbek o ograniczonych ilościach.

Protokół MPLEx do analiz multiomicznych próbek gleby

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Celem tego artykułu jest opisanie protokołu ekstrakcji wodnych metabolitów z hodowanych komórek przylegających do analizy metabolomicznej, w szczególności elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas.

Ekstrakcja metabolitów wodnych z hodowanych komórek adherentnych do analizy metabolomicznej za pomocą elektroforezy kapilarnej ze spektrometrią mas

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Lipidomika oparta na spektrometrii mas typu shotgun dostarcza czuły ilościowy obraz szerokiego spektrum klas lipidów jednocześnie w jednym pomiarze z różnych tkanek gryzoni.

Lipidomika tkanek gryzoni

Poznaj frakcjonowaną ekstrakcję MTBE do analizy lipidów, metabolitów i białek z jednej próbki tkanki Arabidopsis. Ta metoda umożliwia kompleksowe badania multiomikowe w biologii systemów.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Przeglądaj więcej filmów