Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Ogólnym celem tej metody jest odzyskanie i analiza wszystkich głównych jednostek molekularnych, w tym metabolitów polarnych i półpolarnych, lipidów oraz białek z jednej próbki, przy użyciu prostej frakcjonowanej ekstrakcji metylo-t-butyltlenkiem (MTBE). Zazwyczaj naukowcom trudno jest analizować wiele klas związków z jednej próbki. Stosując przedstawioną tutaj ekstrakcję MTBE, można wyekstrahować i przeanalizować wiele klas związków, takich jak lipidy, metabolity i białka, z jednej próbki.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość skutecznej ekstrakcji wszystkich klas związków molekularnych z niewielkiej ilości pojedynczej alikwoty próbki. Metoda ta pomaga w odpowiedzi na fundamentalne pytania w biologii systemowej, ponieważ stanowi podstawę eksperymentalną dla analiz multiomicznych, dostarczając frakcji, które mogą być wykorzystane w proteomice, lipidomice i metabolomice. Poniższy protokół został zademonstrowany na tkance liściowej Arabidopsis.

Arabidopsis to małe rośliny kwitnące z rodziny kapustowatych (Brassicaceae), spokrewnione z kapustą. Procedurę należy rozpocząć od schłodzenia uchwytów probówek do homogenizatora tkanek w ciekłym azocie przez co najmniej 10 minut. Następnie należy wyjąć próbki z ciekłego azotu i umieścić je w uchwytach do probówek.

Następnie wyjmij uchwyty do probówek z ciekłego azotu. Szybko umieść uchwyty w homogenizatorze do tkanek i ustaw urządzenie tak, aby zmielić materiał biologiczny na drobny i jednorodny proszek. W przypadku liści zastosuj częstotliwość 20 hertz przez jedną minutę.

Czas i prędkość homogenizacji mogą się różnić w zależności od rodzaju tkanki. Należy prowadzić homogenizację do momentu, aż otrzymana próbka stanie się bardzo drobnym proszkiem. Ponadto próbka powinna pozostawać zamrożona na każdym etapie homogenizacji.

Zhomogenizuj próbki, a następnie wyjmij próbki biologiczne z uchwytów do probówek. Jeśli nie będą one użyte natychmiast, umieść je w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu dalszej ekstrakcji. Oznacz cztery 2 ml okrągłodenne probówki do mikrowirówki z bezpiecznym zamknięciem numerem próbki.

Wstępnie ochłodź probówki oraz kilka szpatułek, zanurzając je w ciekłym azocie. Po schłodzeniu probówek i szpatułek, umieść jedną z probówek na wadze analitycznej i za pomocą szpatułki odważ 25 mg proszku z tkanki do probówki do mikrowirówki. Zapisz dokładną wagę każdej próbki, a następnie natychmiast umieść odważone próbki w ciekłym azocie.

Krok ten należy wykonać szybko, aby uniknąć rozmrożenia materiału roślinnego. Alikwoty próbek należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia dalszej ekstrakcji. W ramach przygotowań do ekstrakcji należy schłodzić w zamrażarce w temperaturze -20 °C metylotretylobutyloeter lub mieszaninę do ekstrakcji MTBE-metanol, przygotowaną zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie.

Wyjmij podzielone próbki i dodaj jeden mililitr schłodzonej wcześniej mieszaniny do ekstrakcji do każdej probówki z próbką. Wykonaj ten krok szybko. MTBE ma niską lepkość i może wyciekać z końcówki pipety.

Każdą próbkę należy niezwłocznie wymieszać na mieszalniku wortexowym, aż tkanka zostanie dobrze zhomogenizowana w mieszaninie do ekstrakcji. Probówki należy przechowywać w statywie na blacie, dopóki wszystkie próbki nie zostaną wyekstrahowane. Krok ten jest krytyczny.

W tym etapie wytrąca się białka i inaktywuje ich aktywność enzymatyczną. Wszystkie próbki należy inkubować na wytrząsarce orbitalnej przy 100 RPM przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie próbki poddaje się sonikacji przez 15 minut w lodowatej kąpieli sonikacyjnej.

Następnie, aby przeprowadzić frakcjonowanie poprzez rozdział faz, należy dodać 650 µL roztworu wody i metanolu w stosunku trzy do jednego do każdej probówki z próbką. Następnie wymieszać zawartość za pomocą wirówki vortex przez jedną minutę. Próbki odwirować z prędkością 20 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.

Po tym kroku należy ostrożnie obchodzić się z probówkami, aby uniknąć wymieszania dwóch faz ciekłych oraz nie naruszyć wytrąconego osadu. Na tym etapie w probówce znajdują się dwie dopuszczalne fazy ciekłe oraz ciało stałe w postaci osadu na dnie. Niepolarna faza górna zawiera lipidy.

Dolna faza wodna zawiera metabolity polarne i półpolarne. Osad zawiera białka, skrobię oraz ścianę komórkową. Przenieś 500 µL rozpuszczalnika z górnej fazy zawierającej lipidy do oznakowanej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.

Następnie, używając pipety 200 µL, ostrożnie usuń pozostałą fazę lipidową i ją odrzuć. Następnie przenieś 400 µL rozpuszczalnika z dolnej fazy do oznakowanej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Przenieś dodatkową alykwotę 200 µL do probówki do mikrocentryfugi w celu przeprowadzenia dalszych analiz, takich jak analiza metabolitów oparta na chromatografii gazowej.

Usuń i odrzuć pozostałą część fazy wodnej, odpipetowując nadmiar objętości. Następnie, aby wyprać otrzymany osad białkowo-skrobiowo-ściankomórkowy, dodaj 500 µL metanolu, a następnie mieszaj w vortexie przez jedną minutę. Wirowarkuj próbki z prędkością 10 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.

Odparuj rozpuszczalnik z próbek lipidów za pomocą ewaporatora z przepływem azotu, aby uniknąć modyfikacji oksydacyjnych lipidów. Powstałe suche próbki należy przeanalizować niezwłocznie. Odparuj rozpuszczalnik z próbek wodnych przez noc w koncentratorze próżniowym bez podgrzewania.

Wysuszone próbki wodne mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C przed analizą. Ponownie zawiesić wysuszone frakcje lipidowe w 400 µL roztworu acetonitrylu i 2-propanolu w stosunku 7:3. Przenieść odpowiednią ilość cieczy do szklanych fiolek i szczelnie zakręcić.

Następnie umieść szklane fiolki w chłodzonym autosamplerze w temperaturze 4°C. Wstrzyknij 2 µL każdej próbki i rozdziel lipidy na kolumnie C8 w fazie odwróconej utrzymywanej w temperaturze 60°C, korzystając z systemu UPLC przy szybkości przepływu 400 µL/min. Do rozdziału chromatograficznego zastosuj fazy ruchome opisane w Tabeli 1 dołączonego dokumentu.

Należy zebrać widma mas w dodatnim i ujemnym trybie jonizacji przy użyciu odpowiedniego instrumentu MS, obejmując zakres mas między 150 a 1500 stosunku ładunku do masy. Fazę polarną należy ponownie zawiesić w 200 µL roztworu metanolu i wody w stosunku jeden do jednego (klasy UPLC). Odpowiednią ilość cieczy należy przenieść do szklanych fiolek i szczelnie zakręcić.

Następnie umieść fiolki szklane w schłodzonym autopróbniku w temperaturze 4 °C. Wstrzyknij 2 µL z każdej próbki i rozdziel metabolity na kolumnie RP C-18 utrzymywanej w temperaturze 40 °C przy użyciu systemu UPLC z przepływem 400 µL/min. Do rozdziału chromatograficznego zastosuj fazy ruchome o parametrach podanych w tabeli 2 dołączonego dokumentu.

Należy zarejestrować pełne widma mas w trybie jonizacji dodatniej i ujemnej, korzystając z odpowiedniego spektrometru mas w zakresie stosunku masy do ładunku od 50 do 1500. Na koniec należy przeprowadzić ekstrakcję, trawienie i analizę białek, zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie. Zebrano, rozcierano i ekstrahowano 25 milligrams tkanki liścia Arabidopsis, a następnie poddano ją analizie na trzech platformach UPLC-MS.

Polarne i półpolarne metabolity pierwotne oraz wtórne z fazy polarnej przeanalizowano za pomocą UPLC-MS w odwróconej fazie C-18. Chromatogramy szczytów podstawowych lipidów, przedstawione w górnym panelu, oraz metabolitów półpolarnych, przedstawione w dolnym panelu, przeanalizowano w trybie jonizacji dodatniej. Wykres kołowy w prawym górnym rogu każdego chromatogramu pokazuje liczbę zidentyfikowanych lipidów i metabolitów przypisanych do różnych klas chemicznych.

Na przykład 58 różnych lipidów przypisano do grupy triacyliglicerydów, oznaczonej na górnym wykresie jako TAG. Bardziej hydrofilowe metabolity z tej frakcji, takie jak cukry i polarne aminokwasy, które nie wykazują dobrej retencji na materiale w fazie odwróconej, mogą być analizowane za pomocą innych metod analitycznych, takich jak GCMS lub cieczowa chromatografia oddziaływań hydrofilowych. Białka odzyskane z ekstrakcji poddano trawieniu w roztworze, a następnie analizowano za pomocą techniki shotgun LCMS.

Wykres kołowy widoczny w prawym górnym rogu wskazuje liczbę zidentyfikowanych białek przypisanych do różnych procesów biologicznych. Na przykład 268 białek przypisano do kategorii lokalizacji. Podsumowując, z próbek takich jak ta użyta w niniejszym przykładzie, można rutynowo zidentyfikować ponad 200 gatunków lipidów, 50 adnotowanych metabolitów półpolarnych oraz kilka tysięcy białek.

Dodatkowo metoda wykazała szeroką stosowalność z użyciem różnych tkanek, organów oraz materiału z hodowli komórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak ekstrahować i analizować najważniejsze związki z jednej próbki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wszystkie próbki pozostawały zamrożone, materiał został odpowiednio rozdrobniony, a użyte rozpuszczalniki i odczynniki chemiczne posiadały czystość analityczną.

Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać wszystkie metody analityczne w celu określenia składu molekularnego wyekstrahowanych próbek.