Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Ogólnym celem tej metody jest odzyskanie i analiza wszystkich głównych jednostek molekularnych, w tym metabolitów polarnych i półpolarnych, lipidów i białek z pojedynczej próbki przy użyciu prostej frakcjonowanej ekstrakcji eterem metylotributylowym. Ogólnie rzecz biorąc, naukowcy mają trudności z analizą wielu klas związków z jednej próbki. Korzystając z ekstrakcji MTBE, którą tutaj przedstawiamy, można wyodrębnić i przeanalizować wiele klas związków, takich jak lipidy, metabolity i białka, z jednej próbki.

Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona solidnie ekstrahować wszystkie klasy związków molekularnych z niewielkiej ilości podwielokrotności pojedynczej próbki. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na podstawowe pytania w biologii systemów, ponieważ stanowi eksperymentalną podstawę do analizy multiomicznej, dostarczając frakcji, które można wykorzystać do analizy przez proteomikę, lipidomikę i metabolomikę. Poniższy protokół przedstawiono przy użyciu tkanki liścia Arabidopsis.

Arabidopsis to małe rośliny kwitnące z rodziny Brassicaceae i są spokrewnione z kapustą. Procedurę tę należy rozpocząć od wstępnego schłodzenia uchwytów probówek do homogenizatora tkanek w ciekłym azocie przez co najmniej 10 minut. Usunąć próbki z ciekłego azotu i umieścić je w uchwytach probówek.

A następnie wyjmij uchwyty probówek z ciekłego azotu. Szybko umieść uchwyty probówek w homogenizatorze tkankowym i ustaw homogenizator tak, aby zmielił materiał biologiczny na drobny i jednorodny proszek. W przypadku liści użyj 20 Hz przez jedną minutę.

Czas i szybkość homogenizacji mogą się różnić w zależności od tkanki. Upewnij się, że homogenizujesz, aż otrzymana próbka będzie bardzo drobnym proszkiem. Próbka powinna być przechowywana w stanie zamrożonym na każdym etapie homogenizacji.

Homogenizować próbki, a następnie wyjąć próbki biologiczne z uchwytów probówek. A jeśli nie zostaną użyte od razu, umieść je w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej ekstrakcji. Oznaczyć cztery dwumililitrowe probówki mikrowirówkowe z okrągłym dnem z bezpiecznym zamkiem numerem próbki.

Wstępnie schłodź probówki i niektóre szpatułki, zanurzając je w ciekłym azocie. Gdy probówki i szpatułki ostygną, umieść jedną z probówek na wadze analitycznej i za pomocą szpatułki wlej 25 miligramów sproszkowanej tkanki do probówki do mikrowirówki. Zapisać dokładną masę każdej próbki, a następnie natychmiast umieścić próbki podwielokrotne w ciekłym azocie.

Wykonaj ten krok szybko, aby uniknąć rozmrożenia materiału roślinnego. Podane próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej ekstrakcji. Aby przygotować się do ekstrakcji, należy wstępnie schłodzić eter metylowo-tert-butylowy lub mieszaninę do ekstrakcji metanolem MTBE, przygotowane zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym, w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Wyjmij podane próbki i dodaj jeden mililitr wstępnie schłodzonej mieszaniny ekstrakcyjnej do każdej probówki z próbką. Wykonaj ten krok szybko. MTBE ma niską lepkość i może kapać z końcówki pipety.

Każdą próbkę należy natychmiast wymieszać w mieszalniku wirowym, aż tkanka będzie dobrze homogenizowana w mieszaninie ekstrakcyjnej. Probówki należy przechowywać w stojaku na stole do czasu ekstrakcji wszystkich próbek. Ten krok ma kluczowe znaczenie.

Tutaj wytrąca białka i dezaktywujemy ich aktywność enzymatyczną. Inkubować wszystkie próbki na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie sonikować próbki przez 15 minut w lodowatej kąpieli sonicznej.

Następnie, aby frakcjonować przez separację faz, dodaj 650 mikrolitrów roztworu wody i metanolu trzy do jednego do każdej probówki z próbką. Następnie mieszaj, wirując przez minutę. Odwirować próbki z prędkością 20 000 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po tym kroku należy obchodzić się z rurkami ostrożnie, aby uniknąć zmieszania dwóch faz ciekłych i nie zakłócić wytrąconego osadu. Na tym etapie na dnie rurki znajdują się dwie dopuszczalne fazy ciekłe ze stałym osadem. Niepolarna górna faza zawiera lipidy.

Dolna faza wodna zawiera metabolity polarne i półpolarne. Osad zawiera białka, skrobię i ścianę komórkową. Przenieść 500 mikrolitrów rozpuszczalnika z górnej fazy zawierającej lipidy do znakowanej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.

Następnie za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów ostrożnie usuń pozostałą fazę lipidową i wyrzuć ją. Następnie przenieś 400 mikrolitrów rozpuszczalnika z dolnej fazy do oznakowanej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Przenieść dodatkową porcję 200 mikrolitrów do probówki z mikrofugą w celu przeprowadzenia dalszej analizy, takiej jak analiza metabolitów oparta na chromatografii gazowej.

Usunąć pozostałą część fazy wodnej i wyrzucić ją, odpipetowując nadmiar objętości. Następnie, aby przepłukać otrzymany granulat białkowo-skrobiowo-komórkowy, dodaj 500 mikrolitrów metanolu, a następnie wiruj go przez minutę. Odwirować próbki z prędkością 10 000 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odparować rozpuszczalnik z próbek lipidów za pomocą parownika przepływowego azotu, aby uniknąć utleniających modyfikacji lipidów. Otrzymane wysuszone próbki należy natychmiast poddać analizie. Odparować rozpuszczalnik z próbek wodnych przez noc w koncentratorze próżniowym bez podgrzewania.

Wysuszone próbki wodne mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed analizą. Ponownie zawiesić wysuszone frakcje lipidowe w 400 mikrolitrach roztworu siedmiu do trzech acetonitrylu do 2-propanolu. Przenieść wystarczającą ilość płynu do szklanych fiolek i szczelnie zakręcić.

Następnie umieść szklane fiolki w schłodzonym automatycznym samplerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wstrzyknąć dwa mikrolitry na próbkę i oddzielić lipidy na kolumnie C8 z odwróconą fazą utrzymywaną w temperaturze 60 stopni Celsjusza przy użyciu systemu UPLC działającego z natężeniem przepływu 400 mikrolitrów na minutę. Do rozdzielania chromatograficznego należy wykorzystać fazy ruchome opisane w tabeli 1 w dokumencie towarzyszącym.

Uzyskać widma masowe w trybie jonizacji dodatniej i ujemnej za pomocą odpowiedniego instrumentu MS obejmującego zakres mas od 150 do 1500 stosunek ładunku do masy. Ponownie zawiesić fazę polarną w 200 mikrolitrach roztworu metanolu klasy jeden do jednego UPLC do wody. Przenieść wystarczającą ilość płynu do szklanych fiolek i szczelnie zakręcić.

Następnie umieść szklane fiolki w schłodzonym automatycznym samplerze o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wstrzyknąć dwa mikrolitry z każdej próbki i oddzielić metabolity na kolumnie RP C-18 utrzymywanej w temperaturze 40 stopni Celsjusza przy użyciu systemu UPLC działającego z natężeniem przepływu 400 mikrolitrów na minutę. Do rozdzielania chromatograficznego należy wykorzystać fazy ruchome o parametrach podanych w tabeli 2 w dokumencie towarzyszącym.

Uzyskaj pełne widma masowe skanowania w trybie jonizacji dodatniej i ujemnej za pomocą odpowiedniego spektrometru mas obejmującego zakres mas od 50 do 1500 stosunek masy do ładunku. Na koniec należy przeprowadzić ekstrakcję, trawienie i analizę białek, zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie. 25 miligramów tkanki liścia Arabidopsis zebrano, zmielono i wyekstrahowano przed poddaniem jej trzem analitycznym platformom UPLC-MS.

Polarne i półpolarne metabolity pierwszorzędowe i wtórne analizowano od fazy polarnej za pomocą C-18 UPLC-MS z odwróconą fazą. Chromatogramy pików zasadowych lipidów, pokazane w górnym panelu, oraz metabolity półpolarne, pokazane w dolnym panelu, analizowano w trybie jonizacji dodatniej. Wykres kołowy w prawym górnym rogu każdego chromatogramu pokazuje liczbę zidentyfikowanych lipidów i metabolitów przypisanych do różnych klas chemicznych.

Na przykład 58 różnych lipidów przypisano do grupy triacyloglicerydów, oznaczonej na górnym wykresie jako TAG. Bardziej hydrofilowe metabolity z tej frakcji, takie jak cukry i aminokwasy polarne, które nie wykazują dobrej retencji na materiale o odwróconych fazach, można analizować innymi metodami analitycznymi, takimi jak GCMS lub chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych. Białka, które zostały odzyskane z ekstrakcji, były w roztworze trawione i analizowane za pomocą LCMS ze strzelbą.

Wykres kołowy pokazany w prawym górnym rogu wskazuje liczbę zidentyfikowanych białek przypisanych do różnych procesów biologicznych. Na przykład 268 białek zostało przypisanych do kategorii lokalizacji. Podsumowując, ponad 200 gatunków lipidów, 50 opatrzonych adnotacjami metabolitów półpolarnych i kilka tysięcy białek można rutynowo zidentyfikować na podstawie próbek takich jak ta użyta w tym przykładzie.

Ponadto metoda wykazała szerokie zastosowanie w różnych tkankach, narządach i materiale hodowli komórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ekstrahować i analizować najważniejsze związki z jednej próbki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wszystkie próbki były zamrożone, odpowiednio zmielił materiał i używał rozpuszczalników i chemikaliów klasy analitycznej.

Zgodnie z tą procedurą można zastosować wszystkie metody analityczne w celu określenia składu molekularnego wyekstrahowanych próbek.