Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Protokół ten opisuje metodę kompleksowej, bezstronnej charakterystyki molekularnej pojedynczej próbki przy użyciu zarówno spektrometrii mas, metabolomiki, proteomiki i lipidomiki, jak i platform spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. Znaczenie tego podejścia polega na tym, że możemy scharakteryzować system biologiczny za genomem, identyfikując różne typy cząsteczek, co pozwala nam wywnioskować szlaki metaboliczne i rozkładu. Technika ekstrakcji sekwencyjnej umożliwia ekstrakcję biodostępnych, polarnych związków za pomocą wody, a następnie MPLEx w celu wychwycenia wszelkich dodatkowych związków polarnych lub metabolitów, a także białek i lipidów z jednej próbki.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ prowadzi naukowca przez oddzielenie trzech warstw podczas drugiego etapu ekstrakcji i rozdzielenie ekstraktów między różne instrumenty analityczne. Zintegrowane analizy multiomiczne umożliwiają skuteczniejsze prowadzenie badań i pełne zrozumienie złożonych systemów biologicznych. Ta niezawodna metoda pozwala na ekstrakcję szerokiej gamy cząsteczek i ma zastosowanie do różnych typów próbek.

Procedurę tę należy rozpocząć od pobrania i przygotowania próbek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Używając naczynia ze stali nierdzewnej mytego etanolem, podziel 50 miligramów każdej z wysuszonych próbek na pojedyncze dwumililitrowe szklane probówki. Do każdej próbki dodać jeden mililitr destylowanej, odgazowanej wody.

Następnie zakręć fiolki i wstrząsaj przez dwie godziny na stole do wytrząsania. Odwirować próbki pod ciśnieniem 15 tysięcy razy większym niż grawitacja przez 30 minut. A następnie pozostaw roztwory w temperaturze pokojowej na 20 minut.

Zdekantować i zapisać supernatant z każdej próbki. Przeprowadź ekstrakcję MPLEx na pozostałościach wyekstrahowanych wodą, powtarzając te kroki ekstrakcji. Z wyjątkiem zastąpienia mieszaniny chloroformu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza cztery do trzech do metanolu w miejsce destylowanej, odgazowanej wody.

Ostrożnie oddzielić dwie powstałe warstwy rozpuszczalnika, które będą wizualnie widoczne po usunięciu górnej warstwy przez staranne pipetowanie. Wysuszyć dolną warstwę niepolarną w liofilizatorze. Jak tylko wyschnie, dodaj pięć mikrolitrów chloroformu i 195 mikrolitrów metanolu, jeśli analizujesz w ciągu najbliższych kilku dni.

Aby poprawić wydajność jonizacji elektrorozpylania dla spektrometrii mas rezonansu cyklotronowego jonów z transformacją Fouriera, w skrócie FTICR-MS przez bezpośrednie wstrzyknięcie. Rozcieńczyć ekstrakt chloroformowy jeden do jednego w metanolu, a ekstrakt wodny dwa do jednego w metanolu. Skalibrować spektrometr FTICR poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie 100 mikrolitrów roztworu strojeniowego, obejmującego zakres mas około 100 do 1 300 daltonów, do FTICR-MS.

Bezpośrednio wstrzyknąć 100 mikrolitrów wzorca kwasu fulwowego z rzeki Suwannee do źródła jonizacji elektrorozpylania. Sprzężony ze spektrometrem FTICR za pomocą pompy strzykawkowej ustawionej na natężenie przepływu 3,0 mikrolitrów na minutę. Ustaw napięcie igły na dodatnie 4,4 kilowolta.

Ustaw w kolejce stosunek masy do ładunku od jednego do 100 i szklaną kapilarnę o temperaturze 180 stopni Celsjusza. Sprawdź uzyskane widma za pomocą oprogramowania analitycznego, aby potwierdzić jakość danych. Teraz wprowadź 100 mikrolitrów każdego ekstraktu poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie do źródła jonizacji elektrorozpylania, sprzężonego ze spektrometrem FTICR za pomocą pompy strzykawkowej ustawionej na natężenie przepływu 3,0 mikrolitrów na minutę.

Ustaw parametry jak poprzednio. Dostosuj czas akumulacji jonów dla każdej próbki lub grupy próbek, aby uwzględnić zmiany w stężeniu węgla. Zbierz 144 skany dla każdej próbki, uśrednij skany, a następnie przeprowadź wewnętrzną kalibrację przy użyciu homologicznej serii CH2.

Wysuszyć ekstrakty za pomocą koncentratora i zachować pozostałą część ekstraktów do późniejszej chromatografii gazowej, spektrometrii mas, chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i analizy spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. Aby przygotować się do GC-MS, należy najpierw przygotować ślepe próby kontrolne zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W celu ochrony grup karbinolowych dodać 20 mikrolitrów po 30 miligramów na mililitr chlorowodorku metoksaminy w Paradyne do każdej z próbek, w tym ekstraktów metanolowych, ekstraktów wodnych, ślepych prób i próbek kalibracyjnych FAME.

Zamknij fiolki nakrętkami. Wiruj ekstrakty przez 20 sekund, a następnie sonikuj ekstrakty przez 60 sekund. Odwiruj ekstrakty w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut przy 100-krotności grawitacji.

Do każdej próbki dodać 80 mikrolitrów MSTFA z 1% trimetylochlorosilanem. Po wirowaniu i sonikacji ekstraktów jak poprzednio, ponownie odwiruj ekstrakty w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut przy 100-krotnej grawitacji. Po schłodzeniu ekstraktów do temperatury pokojowej przenieść do fiolek z automatycznym podajnikiem próbek GC-MS.

Przejdź do analizy GC-MS i przetwarzania danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować się do analizy NMR w stanie ciekłym, rozcieńczyć pozostałą część ekstraktów wodnych o 10% za pomocą pięciomilimolowego wzorca wewnętrznego DSS. Przenieś mieszaninę do wysokiej jakości rurki NMR ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej trzech milimetrów.

Przejdź do analizy NMR i przetwarzania danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić analizę lipidomiczną LC-MS, wstrzyknij 10 mikrolitrów każdego ekstraktu do ultra wydajnego systemu chromatografii cieczowej, sprzężonego ze spektrometrem masowym Orbitrap za pomocą hybrydowej kolumny z odwróconą powierzchnią naładowaną fazą. Ustaw 34-minutowy gradient zgodnie z podaniem w protokole tekstowym przy natężeniu przepływu 250 mikrolitrów na minutę.

Używaj zarówno ujemnych, jak i dodatnich trybów jonizacji z dysocjacją zderzeń o wyższej energii i dysocjacją wywołaną zderzeniem. Aby przeprowadzić analizę proteomiczną, najpierw wyekstrahuj białka zgodnie z protokołem MPLEx przez pozostałą część fazy metanolu, jak opisano w protokole tekstowym. Torf porównano z głębokością torfowiska S1 na stanowisku Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments lub SPRUCE w Minnesocie w USA.

W analizie proteomicznej zidentyfikowano 3 312 enzymów. Dogłębna analiza aktywności enzymów pokazuje, że liczba enzymów gwałtownie spada od 15 do 45 centymetrów w torfowisku świerkowym. Aby pokazać, w jaki sposób miejsca mogą różnić się pod względem aktywności metabolitów i enzymów, wyniki SPRUCE porównano z wynikami z torfowisk i torfowisk wiecznej zmarzliny w północnej Szwecji.

Ogółem zidentyfikowano 67 040 metabolitów we wszystkich próbkach torfu SPRUCE z połączenia analiz FTICR-MS, NMR, GC-MS i LC-MS. Pokazano tutaj względny ułamek różnych klas chemicznych zidentyfikowanych za pomocą różnych technik na różnych głębokościach. Podczas gdy aminokwasy i cukry zmniejszają się wraz z głębokością, nie obserwuje się tego w przypadku lipidów.

Poprzez walidację krzyżową metabolitów zidentyfikowanych we wszystkich analizach w oparciu o bazę danych KEGG ustalono, że zidentyfikowane związki są zaangażowane we wspólne szlaki metaboliczne, takie jak cykl kwasów trikarboksylowych, glikoliza i metabolizm cukrów. Podczas całej tej procedury bardzo ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z potencjalnych źródeł zanieczyszczenia. Począwszy od pobrania próbki poprzez analizę, próbki nie powinny mieć kontaktu z powiązanymi tworzywami sztucznymi, które mogą negatywnie wpływać na jonizację.

Wiele rozpuszczalników używanych podczas procedury ekstrakcji jest niebezpiecznych lub łatwopalnych. Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej, aby uniknąć kontaktu ze skórą i oczami, a także uniknąć zanieczyszczenia próbek.