Name: Prosta metoda automatycznej ekstrakcji próbek wody do fazy stałej do analizy immunologicznej małych zanieczyszczeń (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę ekstrakcji SPE do analizy zanieczyszczeń organicznych w próbkach wody. Technika ta zastępuje tradycyjne procesy SPE, oferując niższe koszty i mniejsze zużycie rozpuszczalników przy zachowaniu wysokiej wydajności prekoncentracji dla immunodetekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Siódmy Program Ramowy Unii Europejskiej FP7/2007-2013 na podstawie umowy o grant nr 265721. Autorzy dziękują Instytutowi Bezpieczeństwa Żywności RIKILT (NL) za wsparcie w tym projekcie.

Uwaga: Poniższy protokół opisuje SPE przeprowadzoną na 100 ml próbki wody z sorbentem C18 i elucją, z 50% v/v metanolem. Wzbogaconą próbkę rozcieńcza się do 10% v/v metanolu przed analizą za pomocą zestawu do testu immunoenzymatycznego (ELISA).
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotuj próbki wody
	<ol>
		<li>Przed przystąpieniem do jakiegokolwiek innego kroku przefiltrować każdą 100 ml próbki wody za pomocą filtrów o wielkości porów 0,2 μm.</li>
		<li>Zwiększyć próbkę o pożądanym stężeniu, rozcieńczając odpowiednią objętość roztworu odniesienia w objętości wody. Na przykład, przygotować 100 ml próbki wody z 100 ng/l E2, rozcieńczając 3,3 μl roztworu odniesienia E2 o stężeniu 300 μg/l. Rozcieńczyć ten roztwór dziesięć razy, aby otrzymać próbkę wzbogaconą o 10 ng/l E2. Rozcieńczyć ten ostatni jeszcze dziesięć razy, aby otrzymać próbkę o objętości 100 ml z 1 ng/l E2.</li>
		<li>Przefiltrowaną próbkę (niezmodyfikowaną lub wzbogaconą) umieścić w szklanej butelce z gwintem GL45. Próbkę należy zużyć tego samego dnia. Weź małą frakcję do analizy za pomocą testu ELISA, aby oszacować początkowe stężenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 300 μl eluentu, rozcieńczając metanol w wodzie dejonizowanej (di-) do 50% v/v w szczelnej probówce.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kolumny SPE
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę 20 mg/ml cząstek sorbentu oktadecylowo-krzemionkowego, dodając najpierw 1 600 μl metanolu, a następnie 400 μl di-wody do 40 mg sorbentu z odwróconymi fazami. Szczelnie zamknij pokrywkę i zamieszaj wirem.</li>
	<li>Montaż dolnej membrany w kolumnie
	<ol>
		<li>Wybierz jedną membranę nylonową o wielkości porów 11 μm i umieść ją na podwójnej warstwie chusteczki przeciwkurzowej. Za pomocą stempla o średnicy 3 mm wytnij dwie małe części w membranie.</li>
		<li>Chwyć jedną z małych membran za pomocą płaskich kleszczyków filtracyjnych i umieść ją po jednej stronie kolumny.</li>
		<li>Przykręć łącznik z płaskim dnem z rurką i dokręć. Membrana jest teraz na swoim miejscu, a sorbent można bezpiecznie dodać. Narysuj strzałkę na korpusie kolumny skierowaną w stronę końca, na którym umieszczono membranę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wypełnionej kolumny sorbentowej
	<ol>
		<li>Przymocuj kolumnę do uchwytu strzałką skierowaną w dół. Kolumna musi być ustawiona jak najbardziej pionowo.</li>
		<li>Podłączyć pustą jednorazową strzykawkę o pojemności 10 ml do końca rurki kolumny za pomocą złączy Luer-Lock.</li>
		<li>Przygotuj mikropipetę z końcówką o pojemności 20-200 μl, ustaw objętość na 100 μl. Ten format końcówki do pipet jest dostosowany do wielkości przygotowywanej kolumny sorbentowej. Procedura byłaby trudniejsza w przypadku większych końcówek do pipet, takich jak te używane z pipetami o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Wymieszać zawiesinę sorbentu za pomocą wiru i szybko odpipetować 100 μl w środek kolumny. Podczas wstrzykiwania należy delikatnie odessać cały odpipetowany roztwór przez membranę, używając strzykawki drugą ręką. Na tym etapie roztwór wypełniający strzykawkę musi być wolny od cząstek, a w kolumnie można ostatecznie zaobserwować złoże cząstek.</li>
		<li>Powtórzyć ten proces jeszcze 2 razy, mieszając zawiesinę podstawową między wszystkimi etapami pipetowania, aby zapewnić jednorodną zawiesinę cząstek w roztworze. Otrzymana kolumna zawiera 6 mg sorbentu.</li>
		<li>Po załadowaniu i wysuszeniu 300 μl zawiesiny poprzez zasysanie strzykawką, należy utrzymać strzykawkę na miejscu i umieścić drugą membranę nylonową na górze, używając kleszczy drugą ręką.</li>
		<li>Przykręcić drugi łącznik z rurką i wyrzucić strzykawkę. Kolumna SPE jest gotowa do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie systemu
<ol>
	<li>Dokręć kolumnę SPE na urządzeniu za pomocą złączy Luer-Lock. Strzałka musi być skierowana w tym samym kierunku, co strzałka pokazana na urządzeniu.</li>
	<li>Podłącz butelkę zawierającą próbkę do urządzenia, przykręcając do niej dołączoną nasadkę zabezpieczającą GL45.</li>
	<li>Załadować 200 μl eluentu do zbiornika "Eluent".</li>
	<li>Załadować 800 μl wody dwuwodnej do zbiornika "Rozcieńczenia".</li>
	<li>Umieść butelkę na wylocie odpadów, aby zebrać przetworzoną wodę podczas etapu ekstrakcji. Format nie jest ważny, ale objętość musi być wystarczająco duża w stosunku do objętości próbki.</li>
	<li>Umieścić małą fiolkę o minimalnej objętości 1,5 ml w otworze czujnika. Maksymalna objętość 1 ml będzie zbyt mała, ponieważ na tym wylocie utworzą się pęcherzyki podczas zbierania wzbogaconego eluentu i buforu rozcieńczającego.</li>
	<li>Sprawdź, czy regulator ciśnienia jest w pozycji zamkniętej, obracając go ręcznie, w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż dalszy ruch nie będzie możliwy.</li>
</ol>
4. SPE z prototypem
<ol>
	<li>Włącz prototyp, naciskając przycisk z tyłu.</li>
	<li>Przygotowanie interfejsu użytkownika i wybór programu
	<ol>
		<li>Otwórz interfejs użytkownika. Wybierz z listy port komunikacyjny komputera, do którego podłączone jest urządzenie, a następnie kliknij przycisk "Dalej".</li>
		<li>Wprowadź wartości 580 dla pset i 30 dla dpset. Pompa dostosuje się, aby utrzymać ciśnienie w układzie ciśnieniowym i zbiornikach na poziomie 580 ± 30 mbar podczas pracy.</li>
		<li>Wybierz tryb automatyczny.</li>
		<li>W kąciku trybu automatycznego załaduj plik programu w polu "ścieżka do pliku konfiguracyjnego".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regulacja regulatora ciśnienia
	<ol>
		<li>Uruchom pompę.</li>
		<li>Przekręć ręcznie regulator ciśnienia, aż wartość odczytana dla preg będzie mniejsza, ale bliska 320 mbar.</li>
		<li>Zatrzymaj pompę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wszczęcie procedury SPE
	<ol>
		<li>Naciśnij "start" w kąciku trybu automatycznego. Pompa włączy się, a etapy ekstrakcji, elucji i rozcieńczania będą automatycznie następować po sobie. Cała procedura dla próbki o objętości 100 ml wykonywana jest w ciągu 50 minut.</li>
		<li>Sprawdź wartość preg. Na etapie ekstrakcji musi mieścić się w zakresie 320 - 350 mbar, aby zapewnić optymalne natężenie przepływu.</li>
		<li>Zamknąć małą fiolkę i przechowywać w temperaturze 4-5 °C w ciemności do czasu analizy. Wykonaj analizę w ciągu następnych 30 godzin, aby zapobiec degradacji analitu.</li>
		<li>Uzdatnioną wodę należy wyrzucić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie systemu 
	Uwaga: Po każdej procedurze ekstrakcji system należy wyczyścić, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
	<ol>
		<li>Przygotować 10 ml roztworu metanolu 70% v/v w szklanej butelce GL 45.</li>
		<li>Odłącz kolumnę SPE i podłącz rurkę ze złączami.</li>
		<li>W trybie automatycznym wybierz plik "czyszczenie" i uruchom go z tymi samymi ustawieniami ciśnienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wykrywanie stężenia estradiolu za pomocą testu ELISA
<ol>
	<li>Przygotować próbki kalibracyjne o stężeniach wskazanych w protokole dostarczonym z używanym zestawem ELISA. Przygotować jeden zestaw kalibracyjny z tą samą matrycą co próbka i jeden zestaw kalibracyjny z metanolem 10% v/v.</li>
	<li>Dozować niezbędną ilość próbki do dołków na płytce, zgodnie z instrukcjami producenta. Należy użyć próbek kalibracyjnych, niemodyfikowanych i wzbogaconych próbek wody, które zostały przefiltrowane, ale nie zostały przetworzone za pomocą SPE, oraz próbek wzbogaconych w metanolu 10% v/v. Użyj 3 dołków na próbkę, aby zmniejszyć błąd związany z testem.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze wskazaniami protokołu dołączonego do zestawu dotyczącego dodawania reagentów, czasu inkubacji, mycia i dalszej reakcji z enzymem.</li>
	<li>Odczytaj sygnał optyczny w każdej studzience zgodnie z instrukcjami producenta zestawu za pomocą czytnika płytek i zbierz dane.</li>
	<li>Użyj oprogramowania czytnika płytek, aby dopasować krzywe kalibracyjne i określić stężenie E2 w próbce początkowej o tej samej matrycy oraz w próbkach wzbogaconych metanolem o stężeniu 10% v/v.</li>
</ol>

<ol><li>Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methods+of+identification%2C+analysis+and+removal+of+endocrine+disrupting+compounds+%28EDCs%29+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hazard.+Matter%22%5BJournal%5D)">The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water.</a> J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).</li>
<li>Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+solid-phase+extraction+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+determination+of+pharmaceuticals+and+hormones+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).</li>
<li>Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+analysis+of+female-steroid+hormones+in+environ-mental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples.</a> Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).</li>
<li>Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+on-line+solid+phase+extraction+coupled+to+high-performance+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometric+analysis+at+sub-ng%2FL+levels+of+selected+estrogens+in+surface+water+and+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater.</a> J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).</li>
<li>Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-residue+method+for+the+determination+of+over+400+priority+and+emerging+pollutants+in+water+and+wastewater+by+solid-phase+extraction+and+liquid+chromatography-time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).</li>
<li>Huang, C. H., Sedlak, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+estrogenic+hormones+in+municipal+waste+water+effluent+and+surface+water+using+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+gas+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).</li>
<li>Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+study+using+two+immunoassays+for+the+determination+of+estradiol+and+ethinylestradiol+in+the+aquatic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment.</a> Water Res. 40, 2287-2294 (2006).</li>
<li>Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+an+estradiol+enzyme-linked+immunosorbent+assay+kit%2C+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%2C+and+ultra-performance+liquid+chromatography-quadrupole+time+of+flight+mass+spectrometry+for+part-per-trillion+analysis+of+estrogens+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples.</a> J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).</li>
<li>Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+analysis+of+contraceptive+drug+levonorgestrel+in+waste+water+samples+by+a+newly+developed+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29+coupled+with+solid+phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction.</a> Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).</li>
<li>Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+status+report+on+field-portable+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">A status report on field-portable immunoassay.</a> Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).</li>
<li>Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+water+for+pollutants+using+biological+techniques+under+European+Union+funding+during+the+last+10+years%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years.</a> Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).</li>
<li>Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ethinylestradiol+using+a+long-chain+biotinylated+EE2+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative.</a> Steroids. 69, 245-253 (2004).</li>
<li>Heub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+and+portable+solid+phase+extraction+platform+for+immuno-detection+of+17%CE%B2-estradiol+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chrom.+A%22%5BJournal%5D)">Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water.</a> J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).</li>
<li>Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disrupting+compounds+and+other+merging+contaminants+in+the+environment%3A+a+new+survey+on+new+monitoring+strategies+and+occurrence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data.</a> Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).</li>
<li>Richardson, S. D., Ternes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+analysis%3A+Emerging+contaminants+and+current+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Water analysis: Emerging contaminants and current issues.</a> Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zaproponowano nową metodę przygotowania próbek wody, a następnie analizy za pomocą testu immunologicznego. Urządzenie umożliwia przeprowadzenie ekstrakcji fazy stałej w sposób zautomatyzowany i przyjazny dla użytkownika.
Filtracja próbki wody przed jej wstrzyknięciem do systemu ma kluczowe znaczenie. Wszelkie cząstki stałe nadal obecne w roztworze mogłyby potencjalnie spowodować zatkanie sieci płynów i zatkać kolumnę SPE. Kolejnym ważnym krokiem jest przygotowanie kolumny SPE. Ilość cząstek w ...

Przygotowanie próbki jest ważnym krokiem w każdym procesie analitycznym. W szczególności usunięcie efektów matrycowych, zmniejszenie zakłóceń i wzbogacenie analitu są niezbędne do uzyskania precyzyjnych wyników i osiągnięcia niskich granic wykrywalności. Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) budzą szczególne obawy ze względu na ich działanie na organizmy żywe, nawet jeśli są obecne w bardzo niskich stężeniach w środowisku. Naturalny hormon 17β-estradiol znajduje się na unijnej liście obserwacyjnej zanieczyszczenia wody i może zostać dodany do listy substancji priorytetowych regulowanych przez Europejską Ramową Dyrektywę Wodną. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) jest powszechnie stosowana do analizy małych zanieczyszczeń w wodzie, zarówno metodami wykrywania chemicznego 1-5 (chromatografia, spektrometria mas), jak i immunologicznego 6-9. Te ostatnie zyskały zainteresowanie w dziedzinie monitorowania środowiska, ponieważ testy immunologiczne są dostępne w wielu różnych formatach, są specyficzne dla docelowego analitu i osiągają niskie granice wykrywalności. 6, 7, 10, 11 Na rynku dostępne są różne testy immunoenzymatyczne (ELISA), które umożliwiają analizę wielu próbek jednocześnie na płytce wielodołkowej. Zabieg składa się z następujących po sobie etapów reakcji, które mogą trwać kilka godzin. Końcowy produkt reakcji można wykryć optycznie w celu określenia stężenia cząsteczki docelowej na podstawie krzywej kalibracyjnej.
Klasyczne procedury SPE obejmują wstępne kondycjonowanie sorbentu, ekstrakcję próbki, mycie, elucję i zagęszczanie przez odparowanie eluentu. Rozpuszczalnik używany do rozcieńczania tego ekstraktu dobiera się w zależności od metody wykrywania. W przypadku metod immunologicznych ilość rozpuszczalnika organicznego ma duży wpływ na czułość metody. 12
Oprócz wydajności odzysku i wstępnego zagęszczenia, metoda musi być również prosta i opłacalna. Automatyzacja procedury pomaga zmniejszyć liczbę błędów związanych z ludźmi. W naszej poprzedniej pracy 13 przedstawiliśmy nasz prototyp zautomatyzowanego SPE, a nasza metoda została zastosowana do analizy naturalnego hormonu 17β-estradiolu w próbkach wody morskiej. W prezentowanym filmie chcielibyśmy podkreślić techniczne zalety naszej metody w porównaniu z tradycyjnym SPE off-line i on-line oraz jej szczególną kompatybilność z detekcją za pomocą reakcji immunologicznych. Opisujemy protokół stosowany do próbek wody w celu wykrycia 17β-estradiolu. SPE przeprowadza się za pomocą fazy sorbentowej oktadecylokrzemionki (C18), a elucję przeprowadza się za pomocą rozcieńczonego metanolu.

<table><tbody><tr><td>Membrana filtracyjna 0,2 &mu; m wielkość porów</td><td>Merck Millipore</td><td>GNWP04700</td><td>Do filtracji próbek</td></tr><tr><td>Membrana nylonowa 11 &mu; m wielkość porów</td><td>Merck Millipore</td><td>NY1104700</td><td>Do kolumny SPE</td></tr><tr><td>Jednorazowy dziurkacz do biopsji 5 mm</td><td>Budżet medyczny</td><td>39302439</td><td></td></tr><tr><td>Nucleodur C18 ec&nbsp;</td><td>Macherey Nagel</td><td>713550.01</td><td>50 &mu; m średnica cząstek</td></tr><tr><td>Syntetyczna woda morska</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SSWS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17beta-estradiol standard</td><td>Enzo Life Science</td><td></td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>17beta-estradiol Zestaw ELISA</td><td>Enzo Life Science</td><td>ADI-900-008</td><td>96 studzienek, zakres 30 - 3,000 ng/L</td></tr></tbody></table>

prosta metoda automatycznej ekstrakcji próbek wody do fazy stałej do analizy immunologicznej małych zanieczyszczeń

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

Zaproponowano nową metodę ekstrakcji do fazy stałej (SPE) próbek wody ze środowiska. Opracowany prototyp jest ekonomiczny i przyjazny dla użytkownika, a także umożliwia szybkie, zautomatyzowane i proste wykonanie SPE. Wstępnie stężony roztwór jest zgodny z analizą za pomocą testu immunologicznego, o niskiej zawartości rozpuszczalnika organicznego. Opisano metodę ekstrakcji i wstępnego zatężania naturalnego hormonu 17β-estradiolu w 100 ml próbek wody. SPE z odwróconą fazą przeprowadza się za pomocą sorbentu oktadecylokrzemionkowego, a elucję przeprowadza się za pomocą 200 μl metanolu 50% v/v. Eluent rozcieńcza się przez dodanie dwuwody w celu zmniejszenia ilości metanolu. Po ręcznym przygotowaniu kolumny SPE, cała procedura jest wykonywana automatycznie w ciągu 1 godziny. Pod koniec procesu stężenie estradiolu mierzy się za pomocą komercyjnego testu immunoenzymatycznego i sorbentowego (ELISA). Osiągane jest 100-krotne stężenie wstępne, a zawartość metanolu wynosi zaledwie 10% v/v. Pełne odzyski cząsteczki uzyskuje się za pomocą 1 ng/l wzbogaconych, dejonizowanych i syntetycznych próbek wody morskiej.

Powtarzalność pakowania sorbentu oceniono poprzez suszenie i ważenie pipetowanego sorbentu w szklanych fiolkach, a wynik przedstawiono na Rysunku 1. Powtarzalność czasu wstrzykiwania przetestowano dla próbek o objętości 100 ml, co przedstawiono na Rysunku 2. Stężenia w początkowych i wstępnie zagęszczonych próbkach wzbogaconych określono przy użyciu komercyjnego zestawu ELISA do 17β-estradiolu, a wyniki przedstawiono na Rysunku 3.
<p ...

Przedstawiono protokół ekstrakcji i wstępnego zatężania estradiolu z próbek wody za pomocą zautomatyzowanego i zminiaturyzowanego systemu.

Prosta metoda automatycznej ekstrakcji próbek wody do fazy stałej do analizy immunologicznej małych zanieczyszczeń

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Ogólnym celem tej metody przygotowania próbek jest wstępne zagęszczenie małych zanieczyszczeń organicznych z próbek wody w sposób przyjazny dla użytkownika, efektywny kosztowo i zautomatyzowany. Metoda ta może zastąpić standardowe procesy SPE podczas badania zanieczyszczenia próbek wody przy użyciu metod immunodetekcji, takich jak immunoanalizy w płytkach mikrotytrowych lub biosensory. Głównymi zaletami tej techniki są automatyzacja procedury SPE oraz niewielka powierzchnia zajmowana przez urządzenia i niskie koszty w porównaniu do tradycyjnych podejść.Dodatkowo, wydajność procesu wzbogacania spełnia wymagania analizy testów immunologicznych, zarówno pod kątem niskiej zawartości rozpuszczalnika, jak i efektywności wstępnego zagęszczania. Najpierw przefiltruj 100 mL próbki wody za pomocą filtra o rozmiarze porów 0,2 µm. Przenieś przefiltrowaną próbkę do szklanej butelki z gwintem GL 45.Przygotuj 300 µL eluentu, rozcieńczając metanol w wodzie dejonizowanej do stężenia 50% objętościowo w szczelnej probówce. Następnie przygotuj zawiesinę cząstek sorbentu z krzemionki oktyldecylowej o stężeniu 20 mg/mL, dodając 1 600 µL metanolu, a następnie 400 µL wody dejonizowanej do 40 mg sorbentu w fazie odwróconej w szklanej fiolce. Szczelnie zamknij korek i wymieszaj za pomocą mieszadła wortex.Umieść membranę nylonową o rozmiarze porów 11 micrometers na podwójnej warstwie chusteczek przeciwpyłowych. Wycięcie dwóch małych fragmentów membrany za pomocą wycinaka o średnicy 3 millimeters. Następnie, chwyć jedną z małych membran płaskimi pęsetami do filtrów i umieść ją po jednej stronie kolumny.Następnie przykręć konektor z płaskim dnem do rurki i mocno go dociśnij. Potem narysuj na korpusie kolumny strzałkę skierowaną w stronę końca, w którym umieszczono membranę. W tym momencie zamocuj kolumnę w uchwycie tak, aby strzałka była skierowana w dół.Do końcówki rurki kolumny przymocuj pustą jednorazową strzykawkę o pojemności 10 mililitrów, korzystając z dolnych złączy blokujących. Wymieszaj zawiesinę sorbentu za pomocą wstrząsarki typu vortex, a następnie szybko nanieś 100 mikrolitrów w centrum kolumny. Podczas wstrzykiwania delikatnie odsysaj naniesiony roztwór przez membranę, używając strzykawki drugą ręką.Przygotowanie kolumny SPE jest bardzo ważne. Należy upewnić się, że roztwór jest prawidłowo odsysany przez membranę za pomocą strzykawki podczas wstrzykiwania zawiesiny cząsteczek do kolumny. W przeciwnym razie cząsteczki nie zostaną upakowane gęsto.Powtórz poprzedni proces jeszcze dwa razy, mieszając zawiesinę stokową pomiędzy wszystkimi etapami pipetowania, aby zapewnić jednorodną suspensję cząsteczek w roztworze. Po naniesieniu całej zawiesiny i jej osuszeniu poprzez aspirację strzykawką, pozostaw strzykawkę w pozycji i za pomocą pęsety w drugiej ręce nałóż na wierzch drugą membranę nylonową. Następnie przykręć drugi konektor za pomocą probówki i zutylizuj strzykawkę.W tym momencie należy dokręcić kolumnę w urządzeniu SPE za pomocą dolnych złączy blokujących. Podłączyć butelkę z próbką do urządzenia, nakręcając na nią dołączoną nakrętkę zabezpieczającą GL 45. Napełnić zbiornik na eluent 200 µL eluentu.Następnie należy nalać 800 µL wody dejonizowanej do zbiornika rozcieńczającego. Należy upewnić się, że regulator ciśnienia znajduje się w pozycji zamkniętej, obracając go przeciwnie do ruchu wskazówek zegara do momentu zablokowania. Po włączeniu prototypu należy wprowadzić wartość 580 dla pset oraz 30 dla delta pset.Aby wyregulować regulator ciśnienia, uruchom pompę. Następnie ręcznie obracaj regulator ciśnienia, aż wartość odczytana dla preg będzie mniejsza, ale bliska 320 millibar. Po zatrzymaniu pompy rozpoczynaj procedurę SPE, naciskając przycisk start w sekcji trybu automatycznego.Po zakończeniu procedury SPE, zamknąć małą fiolkę z próbką i przechowywać w temperaturze od czterech do pięciu stopni Celsius w ciemności do czasu przeprowadzenia analizy ELISA. Aby oczyścić system, przygotować w szklanej butelce z gwintem GL 45 10 mililitrów 70 procentowego roztworu metanolu (objętościowo). Odłączyć kolumnę SPE i zakryć rurki za pomocą łączników.W trybie automatycznym wybierz plik Czyszczenie (Cleaning) i uruchom go z tymi samymi ustawieniami ciśnienia, które zostały wcześniej zastosowane dla pset, delta pset oraz preg. Powtarzalność upakowania sorbentu oceniono poprzez suszenie i ważenie pipetowanego sorbentu w fiolkach szklanych. Powtarzalność czasu iniekcji przetestowano dla próbek o objętości 100 mililitrów.Stężenia próbek wyjściowych i wstępnie zagęszczonych z dodatkiem wzorca określono przy użyciu komercyjnego zestawu ELISA do oznaczania 17 beta-estradiolu. Z krzywych kalibracyjnych wynika jednoznacznie, że udział metanolu w próbce wzbogaconej nie wpływa na czułość testu immunoenzymatycznego. Odzyski obliczone dla wody dejonizowanej i sztucznej wody morskiej wyniosły odpowiednio 128 ± 22% oraz 107 ± 6%.Po opanowaniu techniki, przygotowanie kolumny SPE może zająć mniej niż pięć minut, jeśli jest przeprowadzone prawidłowo. Cała procedura SPE może zostać ukończona w czasie krótszym niż jedna godzina. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu nauk o środowisku do eksploracji metod immunodetekcji służących do monitorowania niewielkich zanieczyszczeń organicznych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania próbek wody przy użyciu naszego kosztowo efektywnego, zautomatyzowanego urządzenia do analizy zanieczyszczeń za pomocą testów immunoenzymatycznych. Należy pamiętać, że praca z zanieczyszczeniami organicznymi i rozpuszczalnikami może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tego procesu należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odpowiednich rękawic i okularów ochronnych.

a-simple-method-for-automated-solid-phase-extraction-water-samples

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie systemu zagęszczania próbek z wykorzystaniem ultrafiltracji stycznoprzepływowej z pustymi włóknami oraz dysocjacji termicznej jako alternatywnych kroków w wykrywaniu gatunków Cryptosporidium i Giardia przenoszonych przez wodę zgodnie z metodą EPA 1623.

Zmodyfikowana metoda EPA 1623 wykorzystująca ultrafiltrację przezroświećną z przepływem stycznym oraz etapy dysocjacji termicznej do wykrywania wodnych Cryptosporidium i Giardia spp.

W tym filmie demonstrujemy ekstrakcję metabolitów z nerki dawcy za pomocą sondy SPME. Wyekstrahowane metabolity można wykorzystać do przeprowadzenia analizy metabolomicznej i lipidomicznej w celu oceny jakości narządu do przeszczepu.

Pobieranie próbek mikroekstrakcji do fazy stałej: technika ekstrakcji próbki z tkanek przeszczepu oparta na sondzie

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Przedstawiono protokół produkcji mikrochipa do ekstrakcji do fazy stałej wspomaganego dipolem do analizy metali śladowych.

Wytwarzanie mikrochipa do ekstrakcji do fazy stałej wspomaganego dipolem do analizy metali śladowych w próbkach wody

Przedstawiono protokół dotyczący charakterystyki i zastosowania pięciu różnych pasywnych urządzeń do próbkowania.

Charakterystyka i zastosowanie próbników pasywnych do monitorowania pestycydów w wodzie

Wymagana jest szczególna ostrożność przy użyciu "czystych technik" do prawidłowego pobierania i przetwarzania próbek wody do badań metali śladowych w środowisku wodnym. Przedstawiono protokół pobierania próbek, przetwarzania i procedur analitycznych w celu uzyskania wiarygodnych danych i wyników z monitoringu środowiskowego o wysokiej czułości dla szczegółowych badań metali śladowych.

Czyste pobieranie próbek i analiza wód rzecznych i ujść rzek do badań metali śladowych

Wprowadzamy VacuSIP, prostą, nieinwazyjną i niezawodną metodę czystego i dokładnego punktowego pobierania próbek wody. System został opracowany i oceniony pod kątem jednoczesnego zbierania wody wdychanej i wydychanej przez dozowniki zawiesiny bentosowej in situ, w celu czystego pomiaru usuwania i wydalania cząstek stałych i rozpuszczonych związków.

VacuSIP, ulepszona metoda InEx do pomiaru in situ cząstek stałych i rozpuszczonych związków przetwarzanych przez aktywne podajniki zawiesiny

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Tutaj prezentujemy protokół sekwencyjnej celowanej kwantyfikacji i nieukierunkowanej analizy związków fluorowanych w wodzie za pomocą spektrometrii mas. Metodologia ta zapewnia ilościowe poziomy znanych związków fluorochemicznych i identyfikuje nieznane substancje chemiczne w powiązanych próbkach wraz z półilościowymi oszacowaniami ich obfitości.

Identyfikacja per- i polifluorowanych związków chemicznych za pomocą połączonego przepływu pracy spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z ukierunkowanymi i nieukierunkowanymi badaniami przesiewowymi

Ten protokół przedstawia w pełni zautomatyzowany przepływ pracy do ekstrakcji geosminy i 2-metyloizoborneolu z wody i bogatych w lipidy tkanek ryb. Metoda pozwala na wczesne wykrycie tych cząsteczek, zanim osiągną one progi zapachowe. Przedstawiono reprezentatywne dane z otoczenia akwakultury.

Ekstrakcja i wykrywanie geosminy i 2-metyloizoborneolu w wodzie i rybach przy użyciu sond do ekstrakcji sorpcyjnej o dużej pojemności i GC-MS

Poznaj zautomatyzowaną metodę ekstrakcji SPE do analizy zanieczyszczeń organicznych w próbkach wody. Technika ta zastępuje tradycyjne procesy SPE, oferując niższe koszty i mniejsze zużycie rozpuszczalników przy zachowaniu wysokiej wydajności prekoncentracji dla immunodetekcji.

Prosta metoda automatycznej ekstrakcji próbek wody do fazy stałej do analizy immunologicznej małych zanieczyszczeń

Przeglądaj więcej filmów