Określanie optymalnej częstości hamowania dla komórek nowotworowych za pomocą pól TTFields (Tumor Treating Fields)
4 maja 2017
Pola do leczenia nowotworów (TTFields) są skuteczną metodą leczenia przeciwnowotworowego dostarczaną poprzez ciągłą, nieinwazyjną aplikację zmiennych pól elektrycznych o niskiej intensywności i częstotliwości pośredniej. Stosowanie pól elektrycznych TTFields na liniach komórkowych za pomocą systemu do nawożenia polami TTFields in vitro pozwala na określenie optymalnej częstotliwości, która prowadzi do największego zmniejszenia liczby komórek.
Ogólnym celem systemu do stosowania pól TTFields do leczenia in vitro jest zbadanie ich wpływu na komórki nowotworowe z różnych typów nowotworów, ukierunkowanie klinicznego podawania pól TTFields i optymalizacja wyników leczenia. Metoda ta może pomóc w określeniu wpływu różnych parametrów pola TTField na komórki nowotworowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na przedkliniczną identyfikację najskuteczniejszej częstotliwości pól TTField, która hamuje wzrost określonej linii komórek nowotworowych, co ostatecznie może być stosowane u ludzi.
Poprzez nieznaczną modyfikację tej techniki możliwe jest przetestowanie skuteczności skojarzonego leczenia polami TTField z innymi metodami leczenia, takimi jak chemioterapia i radioterapia. Procedurę zademonstruje Yaara Porat, badaczka z naszego zespołu. Na początek zainstaluj płytki TTFields z pokrywkami na płycie podstawy i przygotuj dodatkowe osiem szalek, które zostaną wykorzystane do hodowli komórek kontrolnych.
Umieść sterylne dwumilimetrowe szkiełko nakrywkowe na dnie każdego naczynia. Następnie zawieś pięć razy 10 do czwartego U-87 MG komórek w jednym mililitrze pożywki DMEM. Odpowiednia liczba komórek posianych w każdym naczyniu zależy od właściwości używanej linii komórkowej.
Bardzo ważne jest, aby skalibrować go przed eksperymentem, aby uniknąć przerostu komórek. Odpipetować 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na każde szkiełko nakrywkowe tak, aby na jego powierzchni utworzyła się kropla, a następnie przykryć naczynia pokrywkami. Inkubuj wszystkie naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez noc, aby komórki mogły przylegać.
Po połączeniu komórek odessać pożywkę z szkiełek nakrywkowych za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, a następnie ostrożnie odpipetować dwa mililitry kompletnej pożywki wzrostowej na każdą szalkę. Delikatnie postukaj sterylną końcówką pipety w krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby uwolnić pęcherzyki powietrza złapane pod szkiełkiem. Następnie należy inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, aż do rozpoczęcia leczenia polami TTFields.
Aby rozpocząć leczenie polami TTFields, należy wyjąć płytkę podstawy z inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieścić ją w inkubatorze z chłodzeniem dwutlenku węgla. Temperatura inkubatora z chłodzeniem określi natężenie pola elektrycznego. Ważne jest, aby stosować odpowiednią intensywność, która zależy od wrażliwości komórek na pola TTFields.
Następnie podłącz płaskie złącze żeńskie do płyty podstawy i włącz generator pól TTFields. Otwórz oprogramowanie dedykowane dla systemu aplikacji TTFields do in vitro. Po zdefiniowaniu nowego badania poprzez wpisanie nazw eksperymentu i eksperymentatora, dostosuj częstotliwość i temperaturę docelową dla każdej potrawy.
Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć leczenie polami TTFields w oprogramowaniu i sprawdź, czy wszystkie naczynia są wyświetlane na ekranie na jasnoniebiesko, co potwierdza ich prawidłowe połączenie. Aby przywrócić połączenie, delikatnie dociśnij naczynie w dół i powoli obracaj je w przód iw tył, aż naczynie pojawi się na ekranie na jasnoniebiesko. Po 24 godzinach od zabiegu należy przerwać eksperyment w oprogramowaniu, klikając przycisk pauza.
Odłącz złącze płaskiego od płyty podstawy, a następnie umieść płytę podstawy w komorze z przepływem laminarnym, a następnie wyjmij płytę podstawy z naczyniami i komórkami kontrolnymi wyhodowanymi w standardowych warunkach z ich inkubatorów. Zastąp pożywkę we wszystkich naczyniach świeżą, kompletną pożywką wzrostową, a następnie umieść komórki kontrolne w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i włóż płytkę podstawy z powrotem do inkubatora z chłodzeniem. Podłącz ponownie płytę podstawy do generatora.
Kontynuuj zabieg, klikając przycisk kontynuuj. Po zakończeniu zabiegu zakończ eksperyment, klikając przycisk zakończenia eksperymentu w oprogramowaniu, a następnie zapisz dane przesłane z systemu. Po wyłączeniu generatora pól TTFields odłącz płaski przewód od płyty podstawy i wyjmij system z inkubatora.
Dociśnij i obróć ceramiczne naczynie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby odłączyć je od płyty podstawy. Następnie należy w asepcie przenieść szkiełka nakrywkowe poddane działaniu pól TTFields i kontrolnych na sterylne szalki Petriego zawierające świeżą pożywkę w celu dalszej oceny. Aby ocenić efekt leczenia polami TTFields, należy usunąć podłoże z każdego szkiełka nakrywkowego zawierającego szkiełko nakrywkowe, a następnie dodać 0,5 mililitra 0,25% trypsyny/EDTA i inkubować szalki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, aż komórki oderwą się od powierzchni szkiełka nakrywkowego.
Zneutralizuj trypsynę za pomocą 0,5 mililitra kompletnej pożywki wzrostowej i ponownie zawieś komórki, delikatnie pipetując zawiesinę w górę iw dół. Na koniec policz komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiono wyniki skanowania częstotliwości przeprowadzonego w komórkach A2780, ujawniające zależny od częstotliwości wpływ pól TTFields na wzrost i zdolność klonogenną badanych komórek.
Największą skuteczność leczenia zaobserwowano, gdy zastosowano częstotliwość 200 kiloherców. Skuteczność leczenia polami TTFields przeprowadzanego z dwoma różnymi intensywnościami badano w komórkach OVCAR-3. Badanie wykazało wyraźną zależność między zastosowaną intensywnością a wynikiem leczenia, przy czym im większe natężenie pola, tym większa aktywność hamująca wzrost.
Niezależnie od zastosowanego natężenia pola, najsilniejszy efekt leczenia polami TTFields zaobserwowano przy częstotliwości 200 kiloherców. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż 30 minut dziennie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby unikać rozlania pożywki i utrzymywać równowagę naczyń podczas przenoszenia ich z inkubatora do okapu i z powrotem.
Po zastosowaniu pola TTField można zastosować inne metody, takie jak cytometria przepływowa, analiza białka alaniny lub mikroskopia immunofluorescencyjna, w celu dokładniejszego zbadania wyników leczenia i mechanizmu leżącego u podstaw obserwowanej aktywności. Technika ta służy do określenia optymalnych częstości stosowania pól elektrycznych TTFields w warunkach klinicznych w różnych typach nowotworów. Po obejrzeniu tego filmu powinien/powinna Pan/Pani dobrze wiedzieć, jak planować i przeprowadzać eksperymenty z polami TTFields in vitro.
Nie zapominaj, że praca z ludzkimi liniami komórkowymi może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawice i ubrania ochronne.
Przegląd
Pola terapeutyczne (TTFields) to nieinwazyjna metoda leczenia wykorzystująca niskointensywne pola elektryczne o średniej częstotliwości w celu zahamowania wzrostu nowotworu. Niniejsze badanie analizuje zastosowanie TTFields w różnych liniach komórek nowotworowych w celu optymalizacji częstotliwości leczenia i poprawy wyników klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Biologia komórki
- Elektrofizjologia
Wstęp
- Pola TTFields są dostarczane w sposób ciągły do komórek nowotworowych.
- Mogą być one łączone z innymi metodami leczenia, takimi jak chemioterapia.
- Technika ta umożliwia przedkliniczną identyfikację skutecznych częstotliwości.
- Zrozumienie efektów działania TTFields może pomóc w kierowaniu zastosowaniami klinicznymi.
Cel badania
- Zbadanie wpływu pól TTFields na różne typy nowotworów.
- Określenie optymalnych częstotliwości TTFields dla konkretnych linii komórkowych raka.
- Ocena skuteczności terapii skojarzonych z wykorzystaniem TTFields.
Zastosowane metody
- Przygotowanie kultur komórkowych w naczyniach do TTFields.
- Aplikacja TTFields przy użyciu dedykowanego systemu oprogramowania.
- Monitorowanie wzrostu i żywotności komórek po zakończeniu zabiegu.
- Cytometria przepływowa w celu zliczania i analizy komórek.
Główne wyniki
- Optymalna częstotliwość 200 kHz wykazała istotne hamowanie wzrostu.
- Wyższa natężenie pola korelowało z większą skutecznością leczenia.
- Leczenie TTFields wykazało efekty zależne od częstotliwości w badanych liniach komórkowych.
- Technikę tę można efektywnie przeprowadzać w ciągu 30 minut dziennie.
Wnioski
- TTFields mogą skutecznie hamować wzrost komórek nowotworowych.
- Identyfikacja optymalnych częstotliwości jest kluczowa dla zastosowań klinicznych.
- Dalsze badania mogą służyć do eksploracji strategii terapii skojarzonej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wyznaczenie optymalnej częstotliwości dla pól terapeutycznych w leczeniu nowotworów (TTFields) umożliwia przedkliniczną redukcję ryzyka w przypadku tej nieinwazyjnej metody poprzez ustanowienie mechanistycznego związku między parametrami pola elektrycznego a hamowaniem wzrostu komórek rakowych. Taka optymalizacja częstotliwości wspiera walidację celu poprzez wykazanie powtarzalnego, zależnego od dawki efektu w liniach komórkowych jajnika i glejaka, co dostarcza istotnych informacji dla decyzji typu go/no-go na wczesnym etapie odkrywania leków. Podejście to zapewnia skalowalne, ilościowe ramy oceny interwencji biofizycznych w procesach opracowywania terapii onkologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie konkretnych częstotliwości TTFields z mierzalnymi redukcjami proliferacji komórek i przeżywalności klonogenicznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowany system in vitro do screeningu częstotliwości, co zmniejsza niejednoznaczność biologiczną w badaniach nad modulacją celów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu badawczym poprzez identyfikację częstotliwości zapewniających maksymalne hamowanie wzrostu, co pozwala na ustalenie priorytetów dla kandydatów do dalszego rozwoju.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe odczyty zależne od częstotliwości za pomocą zliczania komórek i testów klonogennych, co umożliwia wiarygodną ocenę związku lub modalności.
- Powtarzalność: System aplikacji TTFields in vitro zapewnia spójne dostarczanie zmiennych pól elektrycznych w kierunkach ortogonalnych, co wspiera standaryzację analizy.
- Skalowalność: Kompatybilny z wieloma liniami komórek nowotworowych (np. U-87 MG, A2780, OVCAR-3), co pozwala na równoległe przesiewanie częstotliwości w modelach istotnych dla danej choroby.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Identyfikuje częstotliwość 200 kHz jako optymalną częstotliwość hamującą dla komórek jajnika i glejaka, zapewniając podstawy przedkliniczne dla wyboru parametrów klinicznych TTFields.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wykazuje zależne od częstotliwości efekty wpływu na wzrost komórek nowotworowych, co zmniejsza niepewność w zrozumieniu mechanizmów przed testami in vivo.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji opartych na danych w zakresie parametrów TTFields dla badań kombinowanych z chemioterapią lub radioterapią, zwiększając pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
System aplikacji TTFields in vitro wpisuje się w kontinuum procesu badawczego – od walidacji celu, przez identyfikację wiodących związków, aż po ewaluację przedkliniczną – stanowiąc wielokrotnego użytku platformę do oceny interwencji biofizycznych w onkologii.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie systematycznej zmiany częstotliwości i natężenia TTFields w celu wyjaśnienia zależności dawka-odpowiedź w inhibicji komórek nowotworowych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników gotowych do analizy (liczba komórek, przeżywalność klonogenna), co pozwala na porównanie warunków leczenia w zależności od częstotliwości i natężenia.
- Analityka: Generuje mierzalne, zależne od częstotliwości punkty końcowe, które ułatwiają porównania statystyczne i ranking warunków w badaniach przedklinicznych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki optymalizacji częstotliwości z translacją kliniczną poprzez identyfikację parametrów o maksymalnej skuteczności w odpowiednich modelach nowotworowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia znormalizowany, powtarzalny schemat optymalizacji częstotliwości, który można zastosować w wielu typach nowotworów i modalnościach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną mechanizmu TTFields poprzez ustanowienie wyraźnej zależności między częstotliwością a odpowiedzią w hamowaniu wzrostu komórek nowotworowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji przygotowania naczyń, dostarczania pola oraz kontroli środowiskowej (temperatura, CO₂).
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną identyfikację optymalnych parametrów TTFields, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację interwencji opartych na TTFields z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając przedklinicznych dowodów na skuteczność zależną od częstotliwości.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórkowych, technik sterylnych oraz obsługi urządzeń TTFields, w tym regulacji częstotliwości i natężenia sterowanych programowo.
- Procedura zależy od specjalistycznej aparatury: generatora TTFields, płyty bazowej, płaskiego złącza kablowego, ceramicznych szalek Petri o wysokiej stałej dielektrycznej oraz inkubatora chłodniczego do kontroli natężenia.
- Niezbędna jest standaryzacja pomiędzy zespołami w zakresie gęstości wysiewu komórek, objętości pożywki i czasu trwania zabiegu, aby zapewnić powtarzalność danych odpowiedzi częstotliwościowej.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują walidację kompatybilności szalek ceramicznych oraz adhezji szkiełek nakrywkowych w różnych liniach komórek nowotworowych o zróżnicowanych właściwościach wzrostu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność ostrożnego obchodzenia się z próbkami, aby uniknąć rozlania pożywki i zachować równowagę szalek podczas przenoszenia ich między inkubatorami a komorami z laminarnym przepływem powietrza.
