Określanie optymalnej częstości hamowania dla komórek nowotworowych za pomocą pól TTFields (Tumor Treating Fields)

Ogólnym celem systemu do stosowania pól TTFields do leczenia in vitro jest zbadanie ich wpływu na komórki nowotworowe z różnych typów nowotworów, ukierunkowanie klinicznego podawania pól TTFields i optymalizacja wyników leczenia. Metoda ta może pomóc w określeniu wpływu różnych parametrów pola TTField na komórki nowotworowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na przedkliniczną identyfikację najskuteczniejszej częstotliwości pól TTField, która hamuje wzrost określonej linii komórek nowotworowych, co ostatecznie może być stosowane u ludzi.

Poprzez nieznaczną modyfikację tej techniki możliwe jest przetestowanie skuteczności skojarzonego leczenia polami TTField z innymi metodami leczenia, takimi jak chemioterapia i radioterapia. Procedurę zademonstruje Yaara Porat, badaczka z naszego zespołu. Na początek zainstaluj płytki TTFields z pokrywkami na płycie podstawy i przygotuj dodatkowe osiem szalek, które zostaną wykorzystane do hodowli komórek kontrolnych.

Umieść sterylne dwumilimetrowe szkiełko nakrywkowe na dnie każdego naczynia. Następnie zawieś pięć razy 10 do czwartego U-87 MG komórek w jednym mililitrze pożywki DMEM. Odpowiednia liczba komórek posianych w każdym naczyniu zależy od właściwości używanej linii komórkowej.

Bardzo ważne jest, aby skalibrować go przed eksperymentem, aby uniknąć przerostu komórek. Odpipetować 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na każde szkiełko nakrywkowe tak, aby na jego powierzchni utworzyła się kropla, a następnie przykryć naczynia pokrywkami. Inkubuj wszystkie naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez noc, aby komórki mogły przylegać.

Po połączeniu komórek odessać pożywkę z szkiełek nakrywkowych za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, a następnie ostrożnie odpipetować dwa mililitry kompletnej pożywki wzrostowej na każdą szalkę. Delikatnie postukaj sterylną końcówką pipety w krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby uwolnić pęcherzyki powietrza złapane pod szkiełkiem. Następnie należy inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, aż do rozpoczęcia leczenia polami TTFields.

Aby rozpocząć leczenie polami TTFields, należy wyjąć płytkę podstawy z inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieścić ją w inkubatorze z chłodzeniem dwutlenku węgla. Temperatura inkubatora z chłodzeniem określi natężenie pola elektrycznego. Ważne jest, aby stosować odpowiednią intensywność, która zależy od wrażliwości komórek na pola TTFields.

Następnie podłącz płaskie złącze żeńskie do płyty podstawy i włącz generator pól TTFields. Otwórz oprogramowanie dedykowane dla systemu aplikacji TTFields do in vitro. Po zdefiniowaniu nowego badania poprzez wpisanie nazw eksperymentu i eksperymentatora, dostosuj częstotliwość i temperaturę docelową dla każdej potrawy.

Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć leczenie polami TTFields w oprogramowaniu i sprawdź, czy wszystkie naczynia są wyświetlane na ekranie na jasnoniebiesko, co potwierdza ich prawidłowe połączenie. Aby przywrócić połączenie, delikatnie dociśnij naczynie w dół i powoli obracaj je w przód iw tył, aż naczynie pojawi się na ekranie na jasnoniebiesko. Po 24 godzinach od zabiegu należy przerwać eksperyment w oprogramowaniu, klikając przycisk pauza.

Odłącz złącze płaskiego od płyty podstawy, a następnie umieść płytę podstawy w komorze z przepływem laminarnym, a następnie wyjmij płytę podstawy z naczyniami i komórkami kontrolnymi wyhodowanymi w standardowych warunkach z ich inkubatorów. Zastąp pożywkę we wszystkich naczyniach świeżą, kompletną pożywką wzrostową, a następnie umieść komórki kontrolne w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i włóż płytkę podstawy z powrotem do inkubatora z chłodzeniem. Podłącz ponownie płytę podstawy do generatora.

Kontynuuj zabieg, klikając przycisk kontynuuj. Po zakończeniu zabiegu zakończ eksperyment, klikając przycisk zakończenia eksperymentu w oprogramowaniu, a następnie zapisz dane przesłane z systemu. Po wyłączeniu generatora pól TTFields odłącz płaski przewód od płyty podstawy i wyjmij system z inkubatora.

Dociśnij i obróć ceramiczne naczynie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby odłączyć je od płyty podstawy. Następnie należy w asepcie przenieść szkiełka nakrywkowe poddane działaniu pól TTFields i kontrolnych na sterylne szalki Petriego zawierające świeżą pożywkę w celu dalszej oceny. Aby ocenić efekt leczenia polami TTFields, należy usunąć podłoże z każdego szkiełka nakrywkowego zawierającego szkiełko nakrywkowe, a następnie dodać 0,5 mililitra 0,25% trypsyny/EDTA i inkubować szalki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, aż komórki oderwą się od powierzchni szkiełka nakrywkowego.

Zneutralizuj trypsynę za pomocą 0,5 mililitra kompletnej pożywki wzrostowej i ponownie zawieś komórki, delikatnie pipetując zawiesinę w górę iw dół. Na koniec policz komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiono wyniki skanowania częstotliwości przeprowadzonego w komórkach A2780, ujawniające zależny od częstotliwości wpływ pól TTFields na wzrost i zdolność klonogenną badanych komórek.

Największą skuteczność leczenia zaobserwowano, gdy zastosowano częstotliwość 200 kiloherców. Skuteczność leczenia polami TTFields przeprowadzanego z dwoma różnymi intensywnościami badano w komórkach OVCAR-3. Badanie wykazało wyraźną zależność między zastosowaną intensywnością a wynikiem leczenia, przy czym im większe natężenie pola, tym większa aktywność hamująca wzrost.

Niezależnie od zastosowanego natężenia pola, najsilniejszy efekt leczenia polami TTFields zaobserwowano przy częstotliwości 200 kiloherców. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż 30 minut dziennie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby unikać rozlania pożywki i utrzymywać równowagę naczyń podczas przenoszenia ich z inkubatora do okapu i z powrotem.

Po zastosowaniu pola TTField można zastosować inne metody, takie jak cytometria przepływowa, analiza białka alaniny lub mikroskopia immunofluorescencyjna, w celu dokładniejszego zbadania wyników leczenia i mechanizmu leżącego u podstaw obserwowanej aktywności. Technika ta służy do określenia optymalnych częstości stosowania pól elektrycznych TTFields w warunkach klinicznych w różnych typach nowotworów. Po obejrzeniu tego filmu powinien/powinna Pan/Pani dobrze wiedzieć, jak planować i przeprowadzać eksperymenty z polami TTFields in vitro.

Nie zapominaj, że praca z ludzkimi liniami komórkowymi może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawice i ubrania ochronne.