Name: Określanie optymalnej częstości hamowania dla komórek nowotworowych za pomocą pól TTFields (Tumor Treating Fields) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę zastosowania pól TTFields do hamowania wzrostu komórek nowotworowych in vitro. Technika umożliwia identyfikację optymalnej częstotliwości 200 kHz dla różnych linii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. System aplikacji pól TTFields in vitro — konserwacja płyty bazowej i naczynia
<ol>
	<li>Opłucz naczynia i pokrywki naczyń pod bieżącą bieżącą wodą. Następnie spłucz wodą dejonizowaną i wysusz na powietrzu twarzą w dół.</li>
	<li>Jeśli w poprzednim eksperymencie do potraw dodano chemioterapeutyk/lek, napełnij każde naczynie 5% lekkim roztworem detergentu i pozostaw na noc.
	<ol>
		<li>Dokładnie opłucz naczynia pod bieżącą bieżącą wodą, aby uniknąć śladów detergentu wewnątrz naczynia. Opłucz naczynia i pokrywki naczyń wodą dejonizowaną i wysusz na powietrzu twarzą w dół.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włóż czyste i suche naczynia wraz z pokrywkami do worków sterylizacyjnych. Zamknij i umieść worki w autoklawie, naczyniami skierowanymi do dołu. Autoklaw przez 30 minut w temperaturze nie wyższej niż 121 °C.</li>
	<li>Ustaw autoklaw na program suszenia, częściowo otwórz drzwiczki autoklawu i susz naczynia przez 30 minut.</li>
	<li>Przetrzyj płytę podstawy szmatką lekko zwilżoną 70% etanolem.</li>
</ol>
2. Konfiguracja eksperymentu
UWAGA: Wszystkie urządzenia i materiały użyte w tym protokole są opisane na Liście Materiałów. Wszystkie poniższe czynności należy wykonywać w komorze z przepływem laminarnym, przy zachowaniu sterylnych warunków.
<ol>
	<li>Należy przygotować czyste i sterylne naczynia i pokrywki pól TTFields, zgodnie z opisem w punkcie 1. Przetrzyj płytę podstawy szmatką lekko zwilżoną 70% etanolem.</li>
	<li>Zamontuj naczynia TTFields z pokrywami na płycie podstawy, delikatnie dociskając naczynie i obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara o około 5 mm, aż krawędź naczynia zablokuje się na trzech kołkach na płycie podstawy. Umieść sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm (plastik lub szkło poddane obróbce) na dnie każdego naczynia.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórkową w kompletnym pożywce wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco dla U-87 MG i F98; RPMI dla A2780 i OVCAR-3; uzupełnione zgodnie z opisem w Wykazie materiałów). 
	nuta: Koncentracje komórek zależą od typów komórek i czasu trwania eksperymentu, 80%-90% zlewającego się wzrostu komórek nie powinno zostać przekroczone do końca eksperymentu. 
	ostrożność: Ludzkie linie komórkowe mogą stanowić zagrożenie biologiczne i powinny być traktowane z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa.</li>
	<li>Umieść 200 μl zawiesiny komórek (zwykle 5 000-20 000 komórek w 200 μl na 72-godzinny eksperyment, w zależności od czasu podwojenia) jako kroplę na środku każdego szkiełka nakrywkowego i przykryj pokrywkami naczynia.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 do momentu, gdy komórki się zgrzebią; na tym etapie możliwa jest inkubacja przez noc.</li>
	<li>Odessać płyny z kropli za pomocą pipety o pojemności 200 lub 1 000 μl.</li>
	<li>Delikatnie odpipetuj 2 ml kompletnego podłoża wzrostowego, aby napełnić każde naczynie. Użyj sterylnej końcówki do pipetowania i delikatnie postukaj w krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby uwolnić pęcherzyki powietrza, które od czasu do czasu wpadają pod szkiełko.</li>
	<li>Przykryć naczynia pokrywkami i umieścić je w inkubatorze wykorzystującym CO2 w temperaturze 37 °C do czasu rozpoczęcia leczenia polami TTFields.</li>
</ol>
3. Aplikacja pól TTFields
<ol>
	<li>Przenieść płytki podstawy z dołączonymi szalkami TTFields do inkubatoraCO2 z chłodzeniem. 
	UWAGA: Stosowanie pól elektrycznych TTFields in vitro powoduje wytwarzanie ciepła; Dlatego wymagany jest inkubator z chłodzeniem, aby skompensować nagrzewanie się potraw. Wyższe intensywności pól TTFields będą wytwarzać więcej ciepła i będą wymagały niższych temperatur otoczenia w inkubatorze (patrz Tabela 1). Klinicznie istotne natężenia pól TTFields uzyskuje się, gdy temperatura w inkubatorze do stosowania pól TTFields mieści się w zakresie 18–30 °C.</li>
	<li>Podłącz złącze żeńskie płaskiego do płyty podstawy. Włączyć generator pól TTFields.</li>
	<li>Uruchomić oprogramowanie systemowe do stosowania pól TTFields do stosowania in vitro i wybrać ustawienia eksperymentu.
	<ol>
		<li>Zdefiniuj nowy eksperyment. Wpisz nazwę eksperymentu i właściciela eksperymentu w interfejsie użytkownika oprogramowania na ekranie komputera. Dostosuj częstotliwość i temperaturę docelową dla każdego naczynia lub płyty podstawy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom aplikację TTFields za pomocą oprogramowania.</li>
	<li>Sprawdź, czy wszystkie naczynia są prawidłowo podłączone i są wyświetlane na niebiesko na monitorze. Jeśli antena jest otoczona czerwoną ramką (co oznacza, że nie jest prawidłowo podłączona), delikatnie ją dociśnij i powoli obracaj w przód iw tył, aż styki zostaną przywrócone, a antena zmieni kolor na jasnoniebieski.</li>
	<li>Pozostawić uruchomione pola elektryczne TTFields do stosowania in vitro na okres do 24 godzin.</li>
	<li>Jeśli eksperyment osiągnie punkt końcowy, przerwij go, klikając przycisk ZAKOŃCZ EKSPERYMENT w oprogramowaniu i przejdź do kroku 5. Jeśli nie, kliknij PAUZA eksperyment.</li>
	<li>Odłącz złącze płaskiego od płyty podstawy. Wyjmij płytę podstawy z naczyniami z inkubatora do komory z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Wymieniaj pożywkę we wszystkich naczyniach co 24 godziny i włóż płytę podstawy z powrotem do inkubatora z chłodzeniem. Podłącz płytę podstawy do generatora za pomocą płaskiego. Kontynuuj eksperyment, klikając przycisk KONTYNUUJ.</li>
</ol>
4. Próbki kontrolne
Uwaga: Hoduj komórki kontrolne w podobnych warunkach do komórek poddanych działaniu pól TTFields, z wyłączeniem stosowania pól TTFields.
<ol>
	<li>Płytki kontrolne próbek z tą samą zawiesiną i na podobnej powierzchni, używane do powlekania próbek poddanych działaniu pól TTFields.</li>
	<li>Umieścić szalki kontrolne w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pożywkę należy wymieniać w naczyniach co 24 godziny, aby dopasować ją do warunków podłoża poddanego działaniu pól TTFields.</li>
</ol>
5. Koniec eksperymentu
<ol>
	<li>Po kliknięciu na ZAKOŃCZ EKSPERYMENT poczekaj, aż oprogramowanie pobierze wszystkie rekordy z systemu i zapisze je na komputerze.</li>
	<li>Użyj przycisku RAPORTY, aby przejrzeć pliki dziennika temperatury, prądu i rezystancji każdej płytki podstawowej, aby sprawdzić, czy wszystkie naczynia zostały potraktowane zgodnie z planem eksperymentalnym. 
	nuta: Wszystkie raporty i dzienniki są zapisywane na komputerze po zakończeniu eksperymentu i można je przejrzeć w dowolnym momencie.</li>
	<li>Wyłączyć generator pól TTFields.</li>
	<li>Odłącz płaski od płyty podstawy i wyjmij go z inkubatora.</li>
	<li>Aby wyjąć naczynie ceramiczne, naciśnij i obróć naczynie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby odblokować je z podstawy.</li>
	<li>Umieść naczynia w komorze z przepływem laminarnym i aseptycznie usuń szkiełka nakrywkowe. Przenieść je na sterylne szalki Petriego zawierające świeżą pożywkę lub sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu dalszej kontroli i oceny.</li>
</ol>
6. Ocena wpływu pól TTFields
UWAGA: Efekty pól TTFields można określić na kilka sposobów. Należy użyć jednej lub więcej z następujących metod, aby porównać komórki poddane działaniu substancji z komórkami kontrolnymi niepoddanymi działaniu środka:
<ol>
	<li>Liczba komórek
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę/PBS z każdego naczynia zawierającego szkiełko nakrywkowe.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny/EDTA do każdej szalki i inkubować przez maksymalnie 10 minut (tj. do momentu, gdy komórki zaczną odrywać się od powierzchni szkiełka nakrywkowego) w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
		<li>Dodaj 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej, aby zneutralizować trypsynę i ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół.</li>
		<li>Policz komórki przy użyciu dowolnej standardowej techniki liczenia komórek, która jest kompatybilna z liczeniem niskich stężeń komórek (tj. około 20 000 komórek/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test klonogenny
	<ol>
		<li>Umieść podobną liczbę komórek (100-500 komórek na szalkę) z każdej szalki na nowych, sterylnych szalkach Petriego lub 6-dołkowych płytkach zawierających 2 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 1-3 tygodnie (w zależności od właściwości każdej linii komórkowej), aż do utworzenia kolonii składających się z ~50 komórek. Oceń liczbę komórek w kolonii za pomocą mikroskopii świetlnej.</li>
		<li>Usuń pożywkę i spłucz PBS.</li>
		<li>Usuń PBS i dodaj lodowaty metanol (1 ml). Inkubować w temperaturze -20 °C przez 10 minut lub dłużej.</li>
		<li>Usuń metanol.</li>
		<li>Dodać roztwór fioletu krystalicznego (0,1% m/v w 25% metanolu v/v w wodzie) i inkubować przez 20 min. 
		ostrożność: Fiolet krystaliczny jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym; Używaj rękawiczek podczas pracy z kryształowym fioletem.</li>
		<li>Usuń fiolet krystaliczny, umyj 3 razy wodą dejonizowaną i wysusz na powietrzu.</li>
		<li>Policz kolonie utworzone w każdym naczyniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+electric+fields+arrest+cell+proliferation+in+animal+tumor+models+and+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Alternating electric fields arrest cell proliferation in animal tumor models and human brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (24), 10152-10157 (2007).</li>
<li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cancer+cell+replication+by+alternating+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Disruption of cancer cell replication by alternating electric fields.</a> Cancer Res. 64 (9), 3288-3295 (2004).</li>
<li>Gera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+treating+fields+perturb+the+localization+of+septins+and+cause+aberrant+mitotic+exit%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tumor treating fields perturb the localization of septins and cause aberrant mitotic exit.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li>
<li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+disruption+and+reduced+clonogenicity+of+pancreatic+cancer+cells+in+vitro+and+in+vivo+by+tumor+treating+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Mitotic disruption and reduced clonogenicity of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo by tumor treating fields.</a> Pancreatology. 14 (1), 54-63 (2014).</li>
<li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+Spindle+Disruption+by+Alternating+Electric+Fields+Leads+to+Improper+Chromosome+Segregation+and+Mitotic+Catastrophe+in+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic Spindle Disruption by Alternating Electric Fields Leads to Improper Chromosome Segregation and Mitotic Catastrophe in Cancer Cells.</a> Sci Rep. 5, 18046(2015).</li>
<li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+electric+fields+%28tumor-treating+fields+therapy%29+can+improve+chemotherapy+treatment+efficacy+in+non-small+cell+lung+cancer+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Alternating electric fields (tumor-treating fields therapy) can improve chemotherapy treatment efficacy in non-small cell lung cancer both in vitro and in vivo.</a> Semin Oncol. 41, S35-S41 (2014).</li>
<li>Voloshin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+electric+fields+%28TTFields%29+in+combination+with+paclitaxel+are+therapeutically+effective+against+ovarian+cancer+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Alternating electric fields (TTFields) in combination with paclitaxel are therapeutically effective against ovarian cancer cells in vitro and in vivo.</a> Int J Cancer. 139 (12), 2850-2858 (2016).</li>
<li>Pless, M., Droege, C., von Moos, R., Salzberg, M., Betticher &amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I%2FII+trial+of+Tumor+Treating+Fields+%28TTFields%29+therapy+in+combination+with+pemetrexed+for+advanced+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">A phase I/II trial of Tumor Treating Fields (TTFields) therapy in combination with pemetrexed for advanced non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 81 (3), 445-450 (2013).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+therapy+with+tumor-treating+fields+plus+temozolomide+vs+temozolomide+alone+for+glioblastoma%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Maintenance therapy with tumor-treating fields plus temozolomide vs temozolomide alone for glioblastoma: A randomized clinical trial.</a> JAMA. 314 (23), 2535-2543 (2015).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NovoTTF-100A+versus+physician%27s+choice+chemotherapy+in+recurrent+glioblastoma%3A+a+randomised+phase+III+trial+of+a+novel+treatment+modality%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">NovoTTF-100A versus physician's choice chemotherapy in recurrent glioblastoma: a randomised phase III trial of a novel treatment modality.</a> Eur J Cancer. 48 (14), 2192-2202 (2012).</li>
<li>Kanner, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25213871">Post Hoc analyses of intention-to-treat population in phase III comparison of NovoTTF-100A system versus best physician's choice chemotherapy.</a> Semin Oncol. 41, S25-S34 (2014).</li>
<li>Miranda, P. C., Mekonnen, A., Salvador, R., Basser &amp, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+electric+field+distribution+in+the+brain+for+the+treatment+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Predicting the electric field distribution in the brain for the treatment of glioblastoma.</a> Phys Med Biol. 59 (15), 4137-4147 (2014).</li>
<li>Wong, E. T., Lok, E., Swanson &amp, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Evidence-Based+Review+of+Alternating+Electric+Fields+Therapy+for+Malignant+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Treat+Options+Oncol%22%5BJournal%5D)">An Evidence-Based Review of Alternating Electric Fields Therapy for Malignant Gliomas.</a> Curr Treat Options Oncol. 16 (8), (2015).</li>
<li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+effect+of+an+alternating+electric+field+on+cell+proliferation+and+synergistic+antimitotic+effect+in+combination+with+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Biological effect of an alternating electric field on cell proliferation and synergistic antimitotic effect in combination with ionizing radiation.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Kim, E. H., Song, H. S., Yoo, S. H., Yoon &amp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+treating+fields+inhibit+glioblastoma+cell+migration%2C+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Tumor treating fields inhibit glioblastoma cell migration, invasion and angiogenesis.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Pavesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+3D+microfluidic+culture+platform+for+tumor-treating+field+application%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineering a 3D microfluidic culture platform for tumor-treating field application.</a> Sci Rep. 6, 26584(2016).</li>
<li>Wong, E. T., Lok, E., Swanson &amp, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+benefit+in+recurrent+glioblastoma+from+adjuvant+NovoTTF-100A+and+TCCC+after+temozolomide+and+bevacizumab+failure%3A+a+preliminary+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical benefit in recurrent glioblastoma from adjuvant NovoTTF-100A and TCCC after temozolomide and bevacizumab failure: a preliminary observation.</a> Cancer Med. , (2015).</li>
<li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+treatment+efficacy+and+sensitivity+are+increased+by+adjuvant+alternating+electric+fields+%28TTFields%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic treatment efficacy and sensitivity are increased by adjuvant alternating electric fields (TTFields).</a> BMC Med Phys. 9, (2009).</li>
<li>Schneiderman, R. S., Shmueli, E., Kirson, E. D., Palti &amp, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTFields+alone+and+in+combination+with+chemotherapeutic+agents+effectively+reduce+the+viability+of+MDR+cell+sub-lines+that+over-express+ABC+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters.</a> BMC Cancer. 10, 229(2010).</li>
<li>Connelly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planning+TTFields+treatment+using+the+NovoTAL+system-clinical+case+series+beyond+the+use+of+MRI+contrast+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Planning TTFields treatment using the NovoTAL system-clinical case series beyond the use of MRI contrast enhancement.</a> BMC Cancer. 16 (1), (2016).</li>
</ol>

Porat Yaara, Giladi Moshe, Schneiderman S. Rosa, Blat Roni, Shteingauz Anna, Zeevi Einav, Munster Mijal, Voloshin Tali, Kaynan Noa, Tal Orna i Kirson D. Eilon D są płatnymi pracownikami w Novocure Ltd w Izraelu. Weinberg Uri jest płatnym pracownikiem firmy Novocure GmbH, Lucerna. Yoram Palti jest udziałowcem Novocure Ltd w Nowym Jorku.

Pola elektryczne TTFields to nowa metoda przeciwnowotworowa oparta na ciągłym stosowaniu odpowiednio dostrojonych zmiennych pól elektrycznych 1,2,8,9,10,17. Maksymalizacja skuteczności przeciwnowotworowej jest pożądanym wynikiem dla wszystkich metod leczenia. Tak więc "walka" o każdy dodatkowy procent zahamowania wzrostu komórek nowotworowych może mieć znaczący wpływ na długoterminowe wyniki kliniczne dla pacjentów. Wynika to z wymaganej ciągłości stosowania pól TTFields i wynikającego z tego skumulowanego efektu. Maksymalizację zastosowania pól elektrycznych TTFields można osiągnąć na kilka sposobów: (1) zwiększenie natężenia pola elektrycznego 1,7, (2) wydłużenie czasu leczenia5, (3) znalezienie najskuteczniejszej kombinacji z innymi metodami leczenia18,19 oraz (4) określenie optymalnej częstotliwości 1,2,4,6,7. Maksymalizację natężenia pola elektrycznego w miejscu guza uzyskuje się poprzez optymalizację lokalizacji matryc na skórze pacjenta; Pozwala to na dostarczenie maksymalnego natężenia pola do guza w oparciu o indywidualną anatomię pacjenta20. Wydłużenie czasu leczenia zależy głównie od przestrzegania przez pacjenta zaleceń lekarskich (przez co najmniej 18 godzin dziennie)17. Znalezienie właściwej kombinacji z innymi terapiami i określenie optymalnej częstości leczenia zależy w dużej mierze od wyników badań in vitro, ponieważ obecnie nie są dostępne żadne zwalidowane markery wyników leczenia polami TTFields. W niniejszej pracy przedstawiono procedury eksperymentalne wymagane do określenia optymalnej częstości stosowania pól TTFields dla linii komórek nowotworowych przy użyciu systemu do stosowania pól elektrycznych TTFields in vitro. Opisane tutaj metody mogą być potencjalnie wykorzystane do badania przesiewowego skojarzenia innych metod leczenia nowotworów (np. chemioterapii lub napromieniania) z polami TTFields oraz do określenia optymalnej częstości podawania pól TTFields dla każdego konkretnego leczenia skojarzonego.
Zgodnie z wcześniejszymi publikacjami, przedstawione wyniki pokazują, że optymalna częstość leczenia zarówno komórek glejaka, jak i komórek raka jajnika wynosi 200 kHz 1,7. W niniejszej pracy po raz pierwszy wykazaliśmy, że optymalna częstość stosowania pól elektrycznych TTFields w celu zmniejszenia potencjału klonogennego jest związana z częstością, która prowadzi do maksymalnego efektu cytotoksycznego. Metody zastosowane w niniejszej pracy do ilościowego określenia skutków pól elektrycznych TTFields (tj. cytotoksycznych i klonogennych) to tylko dwie z wielu możliwych standardowych testów końcowych służących do oceny wyników leczenia. Dodatkowe testy wyników leczenia obejmują: (1) mocowanie, barwienie i mocowanie szkiełek nakrywkowych, na których komórki są platerowane pod mikroskopem w celu wizualizacji struktur wewnątrzkomórkowych; (2) przeprowadzanie testów ekstraktów białkowych i RNA z samych pól TTFields lub po przeniesieniu szkiełka nakrywkowego do nowego naczynia jednorazowego użytku; oraz (3) trypsynizowanie komórek barwionych do analizy cytometrii przepływowej.
Staranne planowanie eksperymentów będzie miało wpływ na wyniki leczenia po podaniu pól elektrycznych TTFields. Kluczowe kroki obejmują zapewnienie, że proliferacja komórek przez cały czas trwania eksperymentu nie prowadzi do przerostu i stosowanie odpowiedniego natężenia pola elektrycznego, ponieważ natężenia, które są zbyt wysokie w przypadku zastosowania do wrażliwych linii komórkowych, spowodują, że liczba komórek będzie zbyt mała dla wymaganych testów w celu określenia optymalnej częstotliwości. I odwrotnie, pola TTFields stosowane z bardzo niską intensywnością na mniej czułych liniach komórkowych powodują niewielkie efekty, które mogą być maskowane przez wrodzoną zmienność. Dzienniki leczenia powinny być badane w celu uzyskania cennych informacji na temat stabilności temperatury, prądów elektrycznych i rezystancji dla każdej potrawy podczas eksperymentu. Wymiana wadliwych naczyń na początku leczenia i wykluczenie danych z naczynia, które nie spełniało pożądanych parametrów leczenia, zminimalizuje zmienność między powtórzeniami.
Podsumowując, pola elektryczne TTFields są nową metodą leczenia przeciwnowotworowego, która wykazała już skuteczność i bezpieczeństwo w warunkach klinicznych 8,9,10. Badanie pól elektrycznych TTFields w warunkach in vitro z wykorzystaniem opisanych tutaj protokołów może pozwolić na optymalizację parametrów leczenia polami TTFields w warunkach klinicznych i może poszerzyć naszą wiedzę na temat mechanizmu działania leżącego u podstaw tego procesu.

Pola do leczenia nowotworów (TTFields) są antymitotyczną metodą leczenia glejaka wielopostaciowego i potencjalnie innych typów raka. Pola są dostarczane poprzez ciągłe stosowanie pól elektrycznych o niskiej intensywności (1-3 V/cm), średniej częstotliwości (100-500 kHz), naprzemiennych do obszaru guza1,2. Wykazano, że stosowanie pól TTFields in vitro i in vivo hamuje zarówno wzrost różnych linii komórek nowotworowych, jak i progresję nowotworów w kilku modelach nowotworów zwierzęcych1,2,3,4,5,6,7. Pilotażowe badania kliniczne i większe badania randomizowane u pacjentów z guzami litymi, w tym glejakiem i niedrobnokomórkowym rakiem płuca, wykazały bezpieczeństwo i skuteczność ciągłego stosowania pól TTFields8,9,10. Stwierdzono, że skuteczność pól elektrycznych TTFields jest: (1) zależna od częstotliwości, z określonymi optymalnymi częstotliwościami prowadzącymi do największego zmniejszenia liczby komórek linii komórkowych o różnym pochodzeniu1,2,4,5,6,7; (2) zależne od natężenia pola elektrycznego, z minimalnym progiem aktywności na poziomie około 1 V/cm i silniejszymi wyższymi intensywnościami1,2,7,11; (3) wzmocnione, gdy czas trwania leczenia był dłuższy<klasa SUP="xref">5; oraz (4) wyższe, gdy 2 kierunkowe pola TTFields zostały zastosowane prostopadle do siebie, w porównaniu z polami elektrycznymi przyłożonymi z jednego kierunku1. Na podstawie powyższych ustaleń pola TTFields mogą być stosowane u pacjentów przez długi czas przy użyciu 2 zestawów matryc przetworników zlokalizowanych na skórze pacjenta, aby zmaksymalizować natężenie pola elektrycznego w łożysku guza12,13.
Badanie wpływu pól TTFields na komórki nowotworowe in vitro obecnie dostarcza obecnie jedynego sposobu na określenie optymalnej częstotliwości do zastosowania dla określonego typu nowotworu. Testowanie optymalnej częstotliwości wymaga urządzenia, które pozwala na zastosowanie różnych częstotliwości w zakresie 100-500 kHz i przy natężeniach do 3 V/cm średniej kwadratowej (RMS) do hodowli komórkowej. Ponieważ pola elektryczne TTFields wytwarzają ciepło, system aplikacyjny wymaga zdolności do odprowadzania nadmiaru ciepła przy jednoczesnym zachowaniu ścisłej kontroli nad temperaturą.
Na przestrzeni lat opracowano kilka urządzeń, które umożliwiają zastosowanie pól TTFields w hodowlach komórkowych1,2,5,14,15,16. We wszystkich tych urządzeniach zastosowane elektrody zostały zaizolowane, aby uniknąć zastrzeżeń związanych z użyciem elektrod przewodzących, takich jak wymiana elektronów na powierzchni elektrody i uwalnianie toksycznych jonów metali do medium1. Główną różnicą między różnymi testowanymi systemami aplikacji TTFields jest rodzaj zastosowanej izolacji elektrod, przy czym elektrody wykonane są z drutów metalowych izolowanych cienką warstwą izolatora2,14,15,16 lub z materiałem o wysokiej stałej dielektrycznej (np. niobian ołowiu-tytanianu ołowiu (PMN-PT))6 . Podczas gdy elektrody z drutem izolowanym stanowią stosunkowo proste i ekonomiczne rozwiązanie do zastosowań w polach TTFields, często są one ograniczone przez wysokie napięcie wymagane do osiągnięcia efektywnego natężenia pola elektrycznego powyżej progu 1 V/cm oraz przez powierzchnię dostępną do powlekania ogniw, ponieważ odległość między elektrodami jest stosunkowo niewielka. Systemy oparte na elektrodach izolowanych materiałem o wysokiej stałej dielektrycznej wymagają specjalnych możliwości projektowych i produkcyjnych, ale nie wymagają wysokiego napięcia i mogą oferować większą powierzchnię do wzrostu komórek między elektrodami.
System aplikacji in vitro TTFields używany w tej pracy należy do drugiej klasy systemów, przy czym jednostką rdzeniową jest szalka Petriego (płytka TTFields, zobacz <silna klasa="xfig">Rysunek 1) składa się z ceramiki o wysokiej stałej dielektrycznej (np. PMN-PT). Dwie pary elektrod są drukowane prostopadle na zewnętrznych ściankach czaszy pola TTFields, aby umożliwić zastosowanie pól elektrycznych z 2 kierunków. Elektrody są podłączone do generatora przebiegów sinusoidalnych i wzmacniacza, co pozwala na zastosowanie pól TTFields w zakresie częstotliwości 50-500 kHz. W celu rozproszenia nadmiernego ciepła, naczynia TTFields są przechowywane w inkubatorze z chłodzeniem, a kontrola temperatury medium odbywa się poprzez ciągłe monitorowanie temperatury naczynia i regulację napięcia podawanego przez system. W praktyce ustawienie inkubatora na niższą temperaturę doprowadziłoby do większego natężenia pola elektrycznego, ponieważ system zwiększa napięcie, aż do osiągnięcia docelowej temperatury wewnątrz naczynia. Różnica między temperaturą wewnątrz naczynia a temperaturą inkubatora może prowadzić do pewnego parowania, w zależności od gradientów temperatury; W związku z tym pożywkę hodowlaną należy wymieniać co 24 godziny, aby utrzymać odpowiednie warunki wzrostu.
Poniższy protokół opisuje procedurę eksperymentalną mającą na celu optymalizację stosowania częstotliwości pól TTFields do komórek nowotworowych, tak aby osiągnąć maksymalne zmniejszenie liczby komórek i zmniejszenie potencjału komórek, które przeżyły, do tworzenia kolonii.

<table><tbody><tr><td>System i oprogramowanie inovitro</td><td>ITG1000 i IBP1000</td><td>Novocure</td><td>Każde urządzenie zawiera 1 generator pól TTFields, 1 płytę podstawy, 8 naczyń pola TTFields z pokrywami i 1 płaski.</td></tr><tr><td>Worki do sterylizacji</td><td>Westfield medical</td><td>24882</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice z tworzywa sztucznego</td><td>Thermo Scientific (NUNC)</td><td>174977</td><td>Wstępnie obrobione i wysterylizowane</td></tr><tr><td>Szkiełka osłonowe</td><td>Thermo Scientific (Menzel-Gl&auml; ser)</td><td>CB00220RA1</td><td>W razie potrzeby wysterylizować</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni</td><td>Przemysł biologiczny (Izrael)</td><td>01-055-1A</td><td>Ciepły w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biological Industries (Izrael)</td><td>04-007-1A</td><td>Ciepła w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-029</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10 000 U/ml Penicyliny, 10 000 &mikro; g/ml Streptomycyny)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu 100 mM&nbsp;</td><td>Przemysł biologiczny (Izrael)</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Hepes 1 M</td><td>Przemysł biologiczny (Izrael)</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór insuliny z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna/EDTA</td><td>Biological Industries (Izrael)</td><td>03-050-1B</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>1.06009.2511</td><td>Schłodzić do -20 & deg; C w zamrażarce przed użyciem</td></tr><tr><td>Kryształowy fiolet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>120M1445</td><td>Szkodliwy. Przygotować 0,1% m/v roztwór fioletu krystalicznego w 25% metanolu 75% wodzie.</td></tr><tr><td>Lekki detergent</td><td>Alcononx</td><td>242985</td><td>Przygotować 5% roztwór w wodzie lub zgodnie z instrukcją producenta.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries (Izrael)</td><td>02-023-1A</td><td>Bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>A2780</td><td>ECACC</td><td>93112519</td><td>Grow in RPMI 1640 uzupełniony FBS (10%), pióro/paciorkowiec (100&nbsp; U/ml / 100&nbsp; &mikro; g/ml), pirogronian sodu (1&nbsp; mM) i bufor Hepes (12&nbsp; mM).</td></tr><tr><td>F98</td><td>ATCC</td><td>CRL-2397</td><td>Rośnie w Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka uzupełniona FBS (10%), wstrzykiwacz/paciorkowiec (100&nbsp; U/ml / 100&nbsp; &mikro; g/ml), pirogronian sodu (1&nbsp; mM) i glutaminy (2&nbsp; mM).</td></tr><tr><td>Ovcar-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-161</td><td>Rośnie w RPMI 1640 uzupełniony o FBS (20%), długopis/paciorkowiec (100&nbsp; U/ml / 100&nbsp; &mikro; g/ml), pirogronian sodu (1&nbsp; mM), bufor Hepes (12&nbsp; mM) i insuliny (10&nbsp; &mikro; g/ml).</td></tr><tr><td>U-87 MG</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td>Rośnie w Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka uzupełniona FBS (10%), wstrzykiwacz/paciorkowiec (100&nbsp; U/ml / 100&nbsp; &mikro; g/ml), pirogronian sodu (1 mM) i glutamina (2&nbsp; mM).</td></tr><tr><td>Inkubator chłodniczy CO2</td><td>CARON</td><td>7404-10-3</td><td></td></tr><tr><td>Komora z przepływem laminarnym</td><td>ADS Laminair</td><td>Bio12 i VSM12</td><td></td></tr></tbody></table>

określanie optymalnej częstości hamowania dla komórek nowotworowych za pomocą pól ttfields (tumor treating fields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Pola do leczenia nowotworów (TTFields) są skuteczną metodą leczenia dostarczaną poprzez ciągłą, nieinwazyjną aplikację naprzemiennych pól elektrycznych o niskiej intensywności (1-3 V/cm) w zakresie częstotliwości kilkuset kHz. Badanie pól TTFields w hodowli tkankowej przeprowadza się przy użyciu systemu aplikacji pola TTFields do diagnostyki in vitro, który umożliwia zastosowanie pól elektrycznych o różnych częstotliwościach i natężeniach do ceramicznych szalek Petriego o wysokiej stałej dielektrycznej (Ɛ > 5 000). Linie komórek nowotworowych umieszczone na szkiełkach nakrywkowych na dnie ceramicznych szalek Petriego są poddawane działaniu pól elektrycznych TTFields podawanych w dwóch prostopadłych kierunkach z różną częstotliwością, aby ułatwić przeprowadzenie testów wyników leczenia, takich jak liczba komórek i testy klonogenne. Wyniki przedstawione w niniejszym raporcie pokazują, że optymalna częstość stosowania pól elektrycznych TTFields zarówno w odniesieniu do liczby komórek, jak i testów klonogennych wynosi 200 kHz zarówno dla komórek jajnika, jak i glejaka.

Efekty zastosowania TTFields przy skanowaniu różnych częstotliwości można ilościowo określić na podstawie różnych testów, takich jak liczenie komórek, testy kolorymetryczne, testy klonogenne oraz badania zmian liczby komórek naciekających z użyciem komory Boydena umieszczonej w specjalnej wysokościennej płytce do hodowli komórkowej TTFields. Staranne zaplanowanie eksperymentu w oparciu o wcześniej określone czasy podwojenia komórek pozwoli komórkom osiągnąć maksymalną liczbę zdarzeń mitotycznych w czasie trwania zabiegu, co zoptymalizuje wyniki leczenia.
Rysunek 2 ilustruje typowy wynik skanowania częstotliwości dla średniej liczby komórek (t. j. liczba komórek) oraz test klonogenny linii A2780 (t. j. ludzkie komórki raka jajnika; Rysunek 2A)7 oraz F-98 (t. j. komórki glejaka szczura; Rycina 2B)1 poddane działaniu dwukierunkowych pól TTFields (zakres częstotliwości: 10–50 kHz, wartość RMS: 1,7 V/cm, temperatura inkubatora: 18 °C). Wyniki wykazują znaczną redukcję liczby komórek przy wszystkich zastosowanych częstotliwościach, przy czym maksymalna redukcja wystąpiła przy 20 kHz dla wszystkich badanych linii komórkowych (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA z porównaniami wielokrotnymi). Optymalna częstotliwość prowadząca do najwyższej redukcji potencjału klonogennego była taka sama dla komórek A2780 i F98 (Rysunki 2B i C). Współczynnik korelacji Pearsona pomiędzy liczbą komórek a efektem klonogennym dla każdej częstotliwości wyniósł odpowiednio 0,967 (p = 0,02) dla A2780 oraz 0,75 (p = 0,083) dla F98.
Rysunek 3 przedstawia wynik skanowania częstotliwości dla średniej liczby komórek OVCAR-3 (tj. ludzkie komórki raka jajnika; Rysunek 3A) oraz U-87 MG (tj. ludzkie komórki glejaka; Rysunek 3B) poddanych działaniu TTFields w dwóch kierunkach przy różnych intensywnościach (odpowiednio RMS: 1,7, 1,3 i 1,0 V/cm oraz temperatura inkubatora: 18 °C, 24 °C i 28 °C). Wyniki pokazują, że choć po leczeniu TTFields o natężeniu 1,3 V/cm (temperatura inkubatora: 24 °C) nadal występuje istotna redukcja liczby komórek OVCAR-3, efekt ten jest stosunkowo niewielki w porównaniu z wynikami uzyskanymi przy leczeniu komórek natężeniem 1,7 V/cm (temperatura inkubatora: 18 °C). Komórki U-87 MG poddane działaniu TTFields o natężeniu 1,0 V/cm (temperatura inkubatora: 28 °C) wykazują podobną tendencję w redukcji liczby komórek jak w przypadku leczenia 1,7 V/cm, jednak efekt ten nie był istotny przy niższych intensywnościach.
<img alt="Układ spektroskopowy z czujnikami optycznymi do analizy emisji; schemat systemu wielokanałowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Szalki TTFields zostały umieszczone na jednostce płyty podstawowej i podłączone do płaskiego kabla sterującego TTFields. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres skanowania częstotliwości; liczba komórek w funkcji wzrostu klonalnego przy różnych wartościach kHz; wykresy wyników eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2Skanowanie częstotliwości w celu wyznaczenia optymalnej częstotliwości hamującej TTFields dla komórek (A) A2780 i (B) F98. Komórki poddano 72-godzinnej ekspozycji na TTFields o różnych częstotliwościach (1,7 V/cm i 10–50 kHz). Efekt działania TTFields oceniano za pomocą liczenia komórek oraz testów klonogennych. Strzałka wskazuje częstotliwość optymalną. Wyniki przedstawiają średnie ± SD na podstawie co najmniej 6 powtórzeń dla każdej badanej częstotliwości.C) Reprezentatywne obrazy przeżywalności klonogenicznej komórek A2780 po zastosowaniu TTFields o różnych częstotliwościach. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy liczby komórek względem częstotliwości; komórki OVCAR-3, U87-MG, różne napięcia; analiza biologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3Skanowanie częstotliwości w celu wyznaczenia optymalnej częstotliwości hamującej TTFields dla komórek (A) OVCAR-3 i (B) U-87 MG. Komórki poddano 72-godzinnej inkubacji w polach elektrycznych TTFields o różnych częstotliwościach (10–50 kHz) i natężeniach (OVCAR-3: 1,3 i 1,7 V/cm; U-87 MG: 1,0 i 1,7 V/cm). Efekt działania TTFields oceniono na podstawie liczby komórek. Strzałka wskazuje częstotliwość optymalną. Wyniki przedstawiono jako średnie ± SD na podstawie co najmniej 6 powtórzeń dla każdej badanej częstotliwości. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Temperatura otoczenia w inkubatorze </td>
			<td >Przewidywane natężenia TTFields </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >(°C)</td>
			<td >(V/cm RMS)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >18</td >
			<td >1.62</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >19</td >
			<td >1.5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >20</td >
			<td >1.48</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >21</td >
			<td >1.41</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td >
			<td >1.3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >23</td >
			<td >1.26</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >24</td >
			<td >1.19</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >25</td >
			<td >1.12</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >26</td >
			<td >1.04</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >27</td >
			<td >0.97</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >28</td >
			<td >0.9</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >29</td >
			<td >0.83</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >30</td >
			<td >0.76</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Temperatura otoczenia w inkubatorze i oczekiwane natężenia pól TTFields wewnątrz naczynia TTFields.

Pola do leczenia nowotworów (TTFields) są skuteczną metodą leczenia przeciwnowotworowego dostarczaną poprzez ciągłą, nieinwazyjną aplikację zmiennych pól elektrycznych o niskiej intensywności i częstotliwości pośredniej. Stosowanie pól elektrycznych TTFields na liniach komórkowych za pomocą systemu do nawożenia polami TTFields in vitro pozwala na określenie optymalnej częstotliwości, która prowadzi do największego zmniejszenia liczby komórek.

Określanie optymalnej częstości hamowania dla komórek nowotworowych za pomocą pól TTFields (Tumor Treating Fields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Ogólnym celem systemu aplikacji TTFields in vitro jest zbadanie ich wpływu na komórki nowotworowe z różnych typów guzów, aby ukierunkować kliniczne podawanie TTFields i zoptymalizować wyniki leczenia. Metoda ta pozwala określić wpływ różnych parametrów TTFields na komórki nowotworowe. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przedklinicznej identyfikacji najskuteczniejszej częstotliwości TTFields hamującej wzrost konkretnej linii komórek nowotworowych, co docelowo mogłoby zostać zastosowane u ludzi.Poprzez niewielką modyfikację tej techniki możliwe jest przetestowanie skuteczności połączonego leczenia z użyciem TTFields oraz innych metod terapeutycznych, takich jak środki chemioterapeutyczne i radioterapia. Procedurę zaprezentuje Yaara Porat, badacz z naszego zespołu. Na początek należy zainstalować szalki TTFields z pokrywkami na płycie podstawowej i przygotować dodatkowe osiem szalek, które posłużą do hodowli komórek kontrolnych.Na dnie każdej płytki umieść sterylne szkiełko nakrywką o grubości 2 mm. Następnie w 1 ml pożywki DMEM zawieś 5 × 10⁴ komórek U-87 MG. Odpowiednia liczba komórek wysianych na każdą płytkę zależy od właściwości stosowanej linii komórkowej.Kluczowe jest wykonanie kalibracji przed eksperymentem, aby uniknąć nadmiernego rozrostu komórek. Należy nanieść 200 µL zawiesiny komórkowej na każde szkiełko nakrywką w taki sposób, aby na jego powierzchni utworzyła się kropla, a następnie przykryć naczynia pokrywkami. Wszystkie naczynia należy inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc, aby umożliwić adhezję komórek.Po przytwierdzeniu komórek odessaj medium z szkiełek nakrywkowych za pomocą pipety 200 µL, a następnie ostrożnie nanieś dwa mililitry pełnego medium wzrostowego na każdą płytkę. Delikatnie uderz sterylną końcówką pipety w krawędzie szkiełek nakrywkowych, aby uwolnić pęcherzyki powietrza uwięzione pod szkiełkiem. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 aż do rozpoczęcia leczenia TTFields.Aby rozpocząć terapię TTFields, wyjmij płytę podstawową z inkubatora ustawionego na 37 °C i umieść ją w chłodzącym inkubatorze z dwutlenkiem węgla. Temperatura w chłodzącym inkubatorze będzie determinować natężenie pola elektrycznego. Ważne jest zastosowanie odpowiedniego natężenia, które zależy od wrażliwości komórek na TTFields.Następnie podłącz płaski żeński konektor kabla do płyty podstawy i włącz generator TTFields. Otwórz oprogramowanie przeznaczone dla systemu aplikacji TTFields in vitro. Po zdefiniowaniu nowego badania poprzez wprowadzenie nazw eksperymentu i eksperymentatora, dostosuj częstotliwość oraz temperaturę docelową dla każdej szalki.Kliknij przycisk start, aby zainicjować terapię TTFields w oprogramowaniu, a następnie sprawdź, czy wszystkie naczynia wyświetlają się na monitorze w kolorze jasnoniebieskim, co potwierdza ich prawidłowe połączenie. Aby przywrócić połączenie, delikatnie naciśnij naczynie i powoli obracaj je w przód i w tył, aż naczynie pojawi się na ekranie w kolorze jasnoniebieskim. Po 24 godzinach terapii zatrzymaj eksperyment w oprogramowaniu, klikając pauzę.Odłącz złącze płaskiej taśmy z płyty podstawowej, a następnie umieść płytę podstawową w komorze z laminarnym przepływem powietrza, po czym wyjmij z inkubatorów płytę podstawową z szalkami oraz komórki kontrolne hodowane w warunkach standardowych. Wymień medium we wszystkich szalkach na świeże kompletne medium wzrostowe, następnie umieść komórki kontrolne w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide, a płytę podstawową przenieś z powrotem do inkubatora chłodzącego. Ponownie podłącz płytę podstawową do generatora.Kontynuuj zabieg, klikając przycisk kontynuuj. Po zakończeniu zabiegu zakończ eksperyment, klikając w oprogramowaniu przycisk zakończ eksperyment, a następnie zapisz dane przesłane z systemu. Po wyłączeniu generatora TTFields odłącz płaską taśmę od płyty podstawowej i wyjmij system z inkubatora.Naciśnij i obróć ceramiczną płytkę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby oddzielić ją od płyty podstawy. Następnie aseptycznie przenieś szkiełka nakrywki z grupy poddanej działaniu TTFields oraz z grupy kontrolnej do sterylnych naczyń Petri zawierających świeżą pożywkę w celu dalszej oceny. Aby ocenić efekt działania TTFields, usuń pożywkę z każdego naczynia zawierającego szkiełko nakrywkę, następnie dodaj 0,5 milliliters 0,25% trypsyny/EDTA i inkubuj naczynia w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, aż komórki oddzielą się od powierzchni szkiełka nakrywki.Zneutralizować trypsynę za pomocą 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej, a następnie ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując zawiesinę w górę i w dół. Na koniec policzyć komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawione tutaj są wyniki skanowania częstotliwości przeprowadzonego na komórkach A2780, wykazujące zależny od częstotliwości wpływ TTFields na wzrost i zdolność klonogenną badanych komórek.Najwyższą skuteczność terapii zaobserwowano przy zastosowaniu częstotliwości 200 kHz. Zbadano skuteczność leczenia metodą TTFields przeprowadzonego przy dwóch różnych intensywnościach w komórkach OVCAR-3. Badanie wykazuje wyraźną zależność między zastosowaną intensywnością a wynikiem leczenia, przy czym wyższa intensywność pola wykazywała silniejsze działanie hamujące wzrost.Niezależnie od zastosowanej natężenia pola, najsilniejszy efekt terapii TTFields zaobserwowano przy częstotliwości 200 kHz. Po opanowaniu techniki, procedura ta może być wykonywana w czasie krótszym niż 30 minut dziennie. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby unikać rozlania pożywki oraz dbać o stabilność naczyń podczas przenoszenia ich z inkubatora do dygestorium i z powrotem.Po zastosowaniu TTFields można przeprowadzić inne metody, takie jak cytometria przepływowa, analiza białek alaninowych lub mikroskopia immunofluorescencyjna, aby dalej zbadać wynik leczenia oraz mechanizm leżący u podstaw zaobserwowanej aktywności. Technika ta jest wykorzystywana do określenia optymalnych częstotliwości TTFields do zastosowania w warunkach klinicznych dla różnych typów nowotworów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na temat planowania i przeprowadzania eksperymentów TTFields in vitro.Należy pamiętać, że praca z ludzkimi liniami komórkowymi może być niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie rękawic ochronnych i odzieży ochronnej.

determining-optimal-inhibitory-frequency-for-cancerous-cells-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Testy transplantacji komórek z rozcieńczeniem ograniczającym są stosowane do określania częstości występowania komórek propagujących nowotwór. Niniejszy protokół opisuje metodę generowania syngeneicznych rybek zebrafish, u których rozwija się białaczka z oznakowaniem fluorescencyjnym, oraz szczegółowo wyjaśnia, jak izolować i transplantować te komórki białaczkowe z rozcieńczeniem ograniczającym do jamy otrzewnej dorosłych rybek zebrafish.

Kwantyfikacja częstotliwości komórek propagujących guz za pomocą transplantacji komórek w rozcieńczeniu ograniczającym u syngeneicznych rybek zebrafish

Test uwalniania chromu, powszechnie stosowana metoda wykrywania aktywności cytotoksycznych limfocytów T, posiada kilka ograniczeń. W niniejszym artykule, wykorzystując antygenowo specyficzne limfocyty T CD8 oraz linię komórkową raka piersi u ludzi SKBR3, zbadano podejście oparte na impedancji pod kątem zdolności do wykrywania śmierci komórek.

Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

Ten film pokazuje wpływ stosowania TTField na wzrost linii komórkowych raka jajnika in vitro. Test ten może pomóc w określeniu optymalnej częstotliwości pola elektrycznego, która może prowadzić do maksymalnego zmniejszenia liczby komórek rakowych.

Określanie optymalnej częstości pola hamującego leczenie guza dla komórek nowotworowych: nieinwazyjna metoda in vitro do oceny wpływu pól TTFields na żywotność komórek nowotworowych

Ten film demonstruje zastosowanie pól do leczenia nowotworów (TTFields) w modelach ludzkich guzów mózgu. Ta nieinwazyjna technika dostarcza zmienne pola elektryczne o niskim natężeniu bezpośrednio do mózgu, co powoduje zahamowanie podziału komórek, a następnie apoptozę.

Zastosowanie pól leczenia nowotworów w modelach guzów ludzkiego mózgu: nieinwazyjna technika dostarczania zmiennych pól elektrycznych do ludzkiego mózgu w celu leczenia guza mózgu

Opisano nowatorską metodologię stosowaną w leczeniu nawracających glejaków. To podejście do leczenia polega na zastosowaniu naprzemiennych pól elektrycznych do leczenia nowotworów (TTFields), znanych jako terapia TTF w połączeniu z bewacyzumabem, lekiem celowanym, który jest obecnie zatwierdzony przez FDA jako monoterapia.

Terapia polowa w leczeniu nowotworów w połączeniu z bewacyzumabem w leczeniu nawracającego glejaka wielopostaciowego

Selektywne uszkodzenie ludzkich komórek białaczkowych można osiągnąć dzięki nowatorskiemu podejściu polegającemu na stosowaniu ultradźwięków o niskiej częstotliwości, zarówno z chemioterapeutycznym leczeniem białaczkowym i prawidłowymi komórkami krwiotwórczymi, jak i bez niego.

Generowanie i analiza ilościowa pulsacyjnych ultradźwięków o niskiej częstotliwości w celu określenia wrażliwości sonicznej nieleczonych i leczonych komórek nowotworowych

Glejak jest najczęstszym i najbardziej agresywnym pierwotnym nowotworem złośliwym mózgu u dorosłych, z większością nowotworów nawracających po początkowym leczeniu. Terapia polami do leczenia nowotworów (TTFields) jest najnowszą metodą leczenia glejaka. W tym artykule opisano prawidłowe zastosowanie matryc przetworników pola TTFields u pacjentów oraz omówiono teorię i aspekty leczenia.

Kliniczne zastosowanie terapii polowej w leczeniu nowotworów w glejaku

Świeżo wycięte ludzkie nowotwory raka piersi są charakteryzowane za pomocą terahercowej spektroskopii i obrazowania zgodnie z protokołami postępowania z nowymi tkankami. Pozycjonowanie tkanek jest brane pod uwagę, aby umożliwić skuteczną charakterystykę przy jednoczesnym zapewnieniu analizy w odpowiednim czasie dla przyszłych zastosowań śródoperacyjnych.

Protokół obrazowania i charakterystyki terahercowej dla świeżo wyciętych guzów raka piersi

Ta praca opisuje rozwój elastycznych elektrod międzypalcowych do implementacji w modelach 3D guzów mózgu, a mianowicie w hodowli in vitro, modelu in ovo i modelu mysim in vivo. Proponowana metoda może być wykorzystana do oceny wpływu pulsacyjnych pól elektrycznych na nowotwory na różnych poziomach złożoności.

Elastyczne organiczne urządzenia elektroniczne do terapii pulsacyjnym polem elektrycznym glejaka

Artykuł opisuje protokół do symulacji przejściowych profili temperatury i sprzężonej czasoprzestrzennej zmienności ciśnienia płynu śródmiąższowego po ogrzewaniu dostarczanym przez dipolarny system hipertermii o częstotliwości radiowej. Protokół może być wykorzystany do oceny odpowiedzi parametrów biofizycznych charakteryzujących mikrośrodowisko guza na techniki hipertermii interwencyjnej.

Podejście do modelowania obliczeniowego w celu zbadania wpływu hipertermii na mikrośrodowisko guza

Ten protokół opisuje kompletny, możliwy do powtórzenia przepływ pracy do symulacji pola elektrycznego specyficznego dla pacjenta i walidacji elektrochemioterapii (ECT) w przypadku przerzutów do kręgosłupa. Przepływ pracy integruje wielomodalne obrazowanie, półautomatyczną i ręczną segmentację, modelowanie przewodności tkankowej, symulację pola elektrycznego liniowego elementu skończonego i walidację eksperymentalną poprzez analizę nakładania martwicy opartą na MRI po zabiegu.

Symulacja pola elektrycznego specyficzna dla pacjenta w elektrochemioterapii przerzutów do rdzenia kręgowego

Poznaj metodę zastosowania pól TTFields do hamowania wzrostu komórek nowotworowych in vitro. Technika umożliwia identyfikację optymalnej częstotliwości 200 kHz dla różnych linii komórkowych.

Określanie optymalnej częstości hamowania dla komórek nowotworowych za pomocą pól TTFields (Tumor Treating Fields)

Przeglądaj więcej filmów